CC BY
252
Никиян А.Н., Татлыбаева Е.Б.
Оренбургский государственный университет E-mail: nikiyan@yahoo.com
УСПЕХИ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ В МИКРОБИОЛОГИИ
В данном обзоре рассмотрены возможности использования атомно-силовой микроскопии в решении микробиологических задач за последнее десятилетие. Основное внимание уделено достижениям и успехам в области биодетекции, вирусологии и изучению влияния биогенных и абиогенных факторов на бактериальные клетки. Представленные результаты демонстрируют потенциал атомно-силовой микроскопии в обнаружении и идентификации единичных клеток и молекул, исследовании механических и морфологических свойств бактериальных клеток в ответ на различные воздействия, а также изучении межмолекулярных и внутримолекулярных взаимодействий.
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, бактериальные клетки, идентификация молекул, детектирование вирусных частиц.
Развитие микробиологии, как науки изучающей строение, жизнедеятельность и экологию микроорганизмов, невозможно представить без микроскопических методов исследования. Так, именно с первым описанием бактериальных клеток, увиденных с помощью оптического микроскопа Антонии Ван Левенгуком в 17 веке, начался описательный этап развития микробиологии. С тех пор методы визуализации непрерывно совершенствовались и, на сегодняшний день, у исследователей имеется целый арсенал всевозможного микроскопического инструментария, являющегося, однако, разновидностями двух видов микроскопов - оптического и электронного. В микробиологии оптическая микроскопия является бесспорным лидером среди всех методов визуализации в силу доступности, относительной простоты приготовления исследуемых образцов, а также возможности изучения биологических структур в близких к природным условиях. Слабой стороной оптических приборов является ограниченная дифракционным пределом разрешающая способность. Именно поэтому ультраструктуру микроорганизмов удалось изучить и описать лишь с появлением электронной микроскопии в 40-е годы XX века. Однако, электронная микроскопия, до настоящего времени являющаяся единственным методом визуализации нанометрового разрешения, имеет целый ряд недостатков, главные из которых - сложность приготовления препаратов и необходимость проведения исследований в условиях высокого вакуума.
В 1981 году был изобретен сканирующий зондовый микроскоп, в основе работы которого лежит регистрация взаимодействия, возника-
ющего между сенсором (зондом) и поверхностью образца при сканировании. Результатом сканирования является цифровое трехмерное изображение поверхности изучаемых структур с нанометровым латеральным и пространственным разрешением. В настоящее время существует целое семейство зондовых микроскопов, один из которых - атомно-силовой микроскоп (АСМ), наиболее активно используется для изучения биообразцов микронного и субмик-ронного уровня организации благодаря простой процедуре пробоподготовки и возможности визуализации объектов практически в любой среде исследования.
Многочисленные исследования, проводимые в течение последних десятилетий, позволили переосмыслить возможности и раскрыть новые аспекты использования АСМ. Так АСМ уже является не просто методом визуализации, а нанотехнологическим инструментом, позволяющим манипулировать отдельными атомами, исследовать межмолекулярные силы взаимодействия, а также картировать физико-химические и иные свойства поверхности отдельных молекул и микроорганизмов [1]-[3].
Данный обзор посвящен рассмотрению различных возможностей использования атомно-силовой микроскопии в решении микробиологических задач, продемонстрированных в работах отечественных и зарубежных исследователей за последнее десятилетие.
Принцип действия атомно-силового микроскопа заключается в сканировании поверхности образца атомарно острой иглой (зондом), расположенной на конце упругой консоли, именуемой кантилевером. Силы взаимодействия,
возникающие между поверхностью исследуемого образца и зондом при их сближении, приводят к изгибу консоли. Передвижение иглы по трем координатам осуществляется прецизионным пьезоэлектрическим двигателем. Деформацию консоли обычно регистрируют с помощью оптической системы, состоящей из лазера, излучение которого падает на тыльную зеркальную сторону кантилевера, и четырехсегментного фотодетектора, на который падает отраженный луч. Любые возвышенности или впадины, встречающиеся на пути поступательно движущейся иглы, вызывают изгиб кантилевера, что приводит к отклонению луча. Регистрируемая таким образом величина изгиба в процессе сканирования позволяет формировать трехмерный рельеф поверхности образца в режиме реального времени. Разрешающая способность данного метода составляет примерно 0,1-1 нм по горизонтали и 0,01 нм по вертикали.
Режимы работы. В зависимости от расстояния между иглой и образцом, различают контактный, бесконтактный и полуконтактный режимы работы атомно-силового микроскопа. При контактном режиме расстояние от иглы до образца составляет порядка нескольких десятых нанометра. В этом случае доминирующими являются силы отталкивания, приводящие к изгибу кантилевера. В бесконтактном режиме (режиме притяжения) кантилевер с помощью пьезокристалла колеблется над изучаемой поверхностью с амплитудой ~5 нм, превышающей расстояние между зондом и поверхностью. По изменению амплитуды или сдвигу резонансной частоты колебаний в ходе сканирования поверхности определяется сила притяжения и формируется изображение поверхности. В полуконтактном режиме, называемом иногда режимом постукивания, кантилевер также совершает вынужденные колебания, но уже с гораздо большей амплитудой ~100 нм, при этом слегка касаясь поверхности образца в нижней точке своих колебаний.
Атомно-силовая спектроскопия (АСС) -это режим работы АСМ, позволяющий изучать локальные физико-механические свойства поверхности, используя зонд в качестве сенсора. АСС основана на регистрации силовых кривых, отображающих отклонение кантилевера при взаимодействии с поверхностью в зависимости от расстояния между зондом и образцом в вертикальном направлении. Силовая кривая, записанная в процессе вдавливания (идентиро-
вания) зонда известной геометрии в поверхность материала, позволяет количественно оценить силу адгезии и модуль упругости исследуемого образца.
Исследование бактериальных клеток
Благодаря своим возможностям, АСМ может быть использован для комплексной оценки состояния бактериальных клеток в различных условиях и при действии различных экологических факторов. Так, например, исследование штаммов Bifidobacterium и Lactobacillus позволило выявить изменения морфологических характеристик в зависимости от используемой среды культивирования [4]. Известно, что для большинства бактерий характерна вариация формы и размеров в зависимости от фазы роста культуры. При исследовании особенностей процесса старения спорообразующих микроорганизмов Bacillus cereus методом АСМ, на различных этапах их жизненного цикла было продемонстрировано изменение как размерных характеристик, так и упругости и шероховатости клеточной стенки [5]. Длительное культивирование сопровождалось сокращением доли жизнеспособных клеток в популяции и появлением морфологически дифференцированных форм покоя - спор. Физиологические перестройки в микроорганизмах, возникающие при воздействии абиотических стрессовых факторов, отражаются в изменениях их морфологии и, поэтому, легко могут быть обнаружены с помощью АСМ. Так на примере клеток Azotobacter chroococcum продемонстрировано изменение размеров и структурированности поверхности в зависимости от величины и времени теплового воздействия [6]. Кроме того, в условиях теплового шока у стрессированных клеток обнаруживались вдавливания на полюсах, отсутствующие в контрольных образцах. Изменение структуры поверхности и механических свойств бактериальных клеток в кислой (pH=4) и щелочной (pH=10) средах наблюдали в работе [7]. Сравнительные исследования влияния относительной влажности (ОВ) среды на результаты АСМ измерений были описаны в работе [8] на примере модельных микроорганизмов B. cereus и Escherichia coli. Так морфологические свойства B. cereus оставались достаточно стабильными в широком диапазоне относительной влажности и достоверно изменялись лишь при достижении 65% ОВ, тогда как клетки E. coli оказывались менее устойчивыми к внешнему воз-
действию и уже при 84% ОВ отвечали ростом шероховатости и упругости клеточной стенки.
В последние годы, в связи с ростом производства углеродных наноматериалов (УНМ), активно используемыми в промышленности, пристальное внимание уделяется вопросу их биологической активности по отношению к живым системам [9], [10]. Применение метода атомно-силовой микроскопии в решении подобных задач позволяет получить уникальную информацию о характере и последствиях контакта УНМ с модельными микроорганизмами. В работах [11], [12] представлено исследование взаимодействия широкого круга углеродных наноматериалов, для каждого из которых проводилось описание характера контакта с клетками E. coli. Было показано, что контакт многостенных и ряда одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ) с поверхностью модельного микроорганизма носит вероятностный характер, а визуализируемые повреждения поверхностных структур, обуславливающие гибель E. coli, определяются эффектами технологических примесей, входящими в состав УНМ. Полученные результаты опровергают гипотезу прямого повреждения (прокалывания) клеток нанотрубками, заявленную авторами работы [13]. Невозможность прямого повреждения клеточной стенки ОУНТ была дополнительно продемонстрирована в работе [14]: вдавливание в клеточную стенку АСМ иглы радиусом 2 нм с силой 10 нН не приводило к последствиям, аналогичным наблюдаемым при совместной инкубации клеток с нанотрубками. В работе [15] изучалось токсичное действие углеродных нанотрубок на бактериальные сообщества. Методом АСМ было показано значительное подавление роста биопленок на поверхностях, покрытых нанокомпозитом ОУНТ-полимер ПВК, что потенциально может быть использовано для создания антибактериальных покрытий.
Исключительно актуальными являются исследования микроорганизмов, подвергнутых действию таких биогенных факторов как антибиотики, ввиду возрастающей глобальной проблемы антибиотикорезистентности. И здесь АСМ может быть использован для оценки влияния новых препаратов с антимикробной активностью на бактериальные клетки-мишени [16]. В работе [17] показаны изменения морфологических и механических характеристик модельных клеток E. coli и B. cereus, вызванных
действием ампициллина. В ряде работ ампициллин выступает в качестве «препарата сравнения», по отношению к которому оцениваются эффекты вновь создаваемых веществ и соединений [18], [19]. Большое внимание уделяется изучению действия антимикробных пептидов, являющихся принципиально новым классом природных антибиотиков, которые могут прийти на смену традиционным препаратам [20]. В [21] проведены сравнительные исследования двух различных антимикробных пептидов -хорошо изученного магаинина 2 [22] и тромбо-цитарного катионного бела (ТКБ), действие которого исследовалось методом АСМ впервые. Кроме различий в форме и степени повреждений, вызываемых указанными антимикробными пептидами, показана также большая к ним чувствительность грамотрицательных по сравнению с грамположительными бактериями, что выражалось в деформации концевых участков клеток, потере жесткости наружной мембраны, увеличению её шероховатости и формированию пор. Пример характерных повреждений показан на рисунке 1, взятом из работы [21].
Совершенствование техники и программного обеспечения зондовых микроскопов позволяет в автоматическом режиме выполнять измерения и обрабатывать множества силовых кривых в разных точках сканирования и формировать по полученным результатам изображение, соответствующее распределению локальных значений модуля Юнга или адгезионных сил по сканируемой поверхности. Подобный метод, именуемый методом силового картирования [23], был использован для выявления действия четырех антибиотиков (изониа-зид, этионамид, этамбутол, стрептомицин) на возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота Mycobacterium bovis [24]. Использовался зонд, к поверхности которого были химически привиты углеводородные цепи. Такой кантиле-вер показывал большее значение адгезии на гидрофобных поверхностях. Было обнаружено, что поверхность клеток M. bovis после обработки антибиотиками становится более гидрофильной, что указывает на разрушение внешнего гидрофобного слоя состоящего из миколовых кислот и приводит к росту шероховатости поверхности и увеличению адгезии гидрофобного кантилевера. Указанный подход можно использовать и для выявления расположения сайтов связывания антибиотиков с поверхностью
бактериальных клеток. Функционализация зонда ванкомицином позволила авторам работы [25] с нанометровой точностью локализовать участки связывания антимикробного препарата с мембраной Lactococcus 1асиз. Более подробно о возможностях метода функциона-лизации зонда будет описано в следующем параграфе обзора.
АСМ в задачах биодетекции
В микробиологии задача обнаружения и распознавания молекул и бактерий остается достаточно актуальной и в ряде случаев решается путем их специфического маркирования с последующим микроскопическим исследованием. В случае использования световой микроскопии это достигается использованием иммунохимических или иммунофлюоресцентых меток [26], а при электронной микроскопии распознающие антитела конъюгируются с электронно-плотными частицами, например, коллоидным золотом [27]. Разработанные на этом принципе методы имму-нофлюоресцентного анализа и иммуноэлектрон-ной микроскопии произвели в свое время революционный переворот в развитии диагностического сектора. В свою очередь использование атомно-силовой микроскопии для детекции микробиологических объектов открывает широкие перспективы для анализа иммуно- и субстратс-
а
пецифической активности. АСМ-детекторы позволяют визуализировать отдельные молекулы белков и подсчитывать их количество и при этом теоретически не имеют ограничений концентрационной чувствительности.
Принцип работы такого молекулярного АСМ-детектора в простейшем случае основан на выявлении различий в морфометрических характеристиках визуализируемых молекул. Например, критерием для выявления комплексов «антиген-антитело» может выступать высота белкового комплекса, поскольку высота составляющих этот комплекс отдельных молекул, как правило, оказывается значительно ниже [28]. На этом же принципе основана система диагностики вирусных инфекций, предлагаемая авторами [29]. Специфическое прикрепление вирусных частиц к модифицированной антителами подложке приводит к утолщению слоя нанесенных белков, что легко выявляется при сканировании. Возможность обнаружения специфических комплексов, основанная на сопоставлении гистограмм распределения размерных характеристик молекул антигена до и после взаимодействия со специфическими и неспецифическими антителами, также продемонстрирована авторами работы [30]. Применение данного подхода, однако, осложнено наличием «шумов» из-за неспецифических взаимодействий.
Рисунок 1. Деформации клеточной стенки ЕхоК: под действием магаинина (а) и образование пор при использовании ТКБ (Ь)
Для повышения надежности обнаружения единичных комплексов на поверхности бактериальных клеток, распознающие антитела конъюгируют с различными маркерами, в качестве которых могут выступать частицы, размеры которых находятся в пределах хорошей разрешающей способности микроскопа и имеют отчетливую структуру [31]. Это в свою очередь позволяет не только установить факт взаимодействия, но и определить локализацию составляющих реакции антиген-антитело, а также проводить их количественный анализ. Авторами [32] с использованием золотых нанораз-мерных меток продемонстрирована возможность специфического маркирования и последующей идентификации бактериальных клеток в ассоциациях сложного компонентного состава. Так в смеси клеток Staphylococcus aureus и Bacillus licheniformis, конъюгаты иммуноглобулина G с коллоидным золотом обнаруживаются только на поверхности стафилококков. Полученное авторами [32] изображение меченых клеток приведено на рисунке 2.
Более сложные методы детекции методом АСМ включают в себя использование функци-онализированных зондов, на поверхности которых иммобилизованы различные структуры, превращающие зонд в сверхчувствительный нано/биосенсор. Факт специфического взаимодействия определяется по статическому изгибу кантилевера, по сдвигу резонансной частоты его колебаний в случае использования бесконтактных режимов сканирования [33] или по изменению силы взаимодействия с подложкой [34]. В зависимости от иммобилизуемой структуры выделяют несколько вариантов атомно-силовой спектроскопии. В химической силовой спектроскопии используется иммобилизация отдельных химических групп, в силовой спектроскопии единичных молекул (ССЕМ) - биоор-ганических молекул, в силовой спектроскопии единичных клеток - клеточных структур [35].
Кроме упомянутых задач биодетекции, атомно-силовая спектроскопия позволяет экспериментально охарактеризовать единичные межмо-лекулярные взаимодействия, что раннее было доступно лишь методам, основанных на принципе оптических и магнитных пинцетов, а также камер ламинарного потока. Так, в случае ССЕМ, регистрация и анализ силовых кривых позволяет изучить взаимодействия белок - нуклеиновая кислота [36], нуклеиновая кислота - нуклеино-
Рисунок 2. АСМ изображение бактериальных клеток в присутствии конъюгатов золота
вая кислота [37] , пептид - нуклеиновая кислота [38], фермент - ингибитор [39], а также измерить силы взаимодействия фермента с субстратом, токсина с антитоксином, ближние и дальние бе-лок-белковые взаимодействия [34].
Возможность изучения не только межмоле-кулярных, но и внутримолекулярных взаимодействий показана в [40]. В указанный работе один конец молекулы закреплялся на подложке, а второй - на кантилевере. Регистрация сил, возникающих при отводе кантилевера, позволяла оценивать прочность внутримолекулярных связей при разворачивании молекулы.
Имеющиеся ограничения метода АСМ-биодетекции с участием функционализирован-ного зонда определяются необходимостью проведения сканирования в жидкостной ячейке, что усложняет процесс пробоподготовки и сканирования и часто приводит к появлению артефактов на полученных изображениях.
АСМ в вирусологии
На сегодняшний день АСМ успешно применяется для визуализации и оценки количества как целых вирусных частиц, так и составляющих их белков и нуклеопротеинов [41]-[43]. Возможность количественной дифференциров-ки их морфологических и механических характеристик, позволяет отличать целые, полностью сформированные вирионы от разрушенных, что особенно важно при количественном
учёте вирусных частиц в живых вакцинах, эффективность которых напрямую зависит от наличия в них цельных, способных к размножению вирионов. Так для количественного учёта вирусного материала в живой паротитной вакцине, авторами [44] использован как метод АСМ, так и количественная ПЦР в реальном времени. Сравнение полученных двумя указанными методами данных, позволило определить количество копий вирусной РНК в вакцине.
Применение спектроскопических методик АСМ к изучению вирусов, позволило получить ряд любопытных результатов, таких как: обнаружение анизотропных механических свойств полого продолговатого капсида бактериофага phi29, выражающихся в двукратно большей его жесткости в продольном направлении по отношению к поперечному направлению, что может быть вызвано необходимостью противостоять дегидратации, осмотическому давлению и механическому напряжению, создаваемому ком-пактизированной молекулой ДНК [45]. Выявлены различия в жесткости полого и содержащего ДНК вириона. Количественно определенное давление внутри капсида фага phi29, соответствовало 40 атмосферам, что согласуется с предсказаниями теоретических расчетов [46].
Перспективным направлением является использование АСМ для создания миниатюрных тест-систем для диагностики различных заболеваний - биочипов, в которых используется принцип молекулярного узнавания. Так авторами [47] продемонстрирована принципиальная возможность совместного использования технологии микроконтактной печати (МКП) и АСМ для диагностических целей на примере детекции Chlamydia trachomatis в пробах биологических образцов. МКП использовалась для создания микроструктурированных сенсорных покрытий из поликлональных про-тивохламидийных IgG на которых происходила селективная адсорбция частиц C. trachomatis. Использование АСМ позволило не только охарактеризовать несколько морфотипов возбудителя, но и анализировать укладку антигенов на подложке. Аналогичным образом иммобилизо-вывались и идентифицировались отдельные молекулы протеазорезистентного прионного
белка РгР27-30, что указывает на возможность проведения ранней диагностики заболеваний прионной этиологии.
Заключение
С момента своего возникновения, методы атомно-силовой микроскопии смогли прочно занять важное место в ряду традиционных исследовательских подходов к изучению биологических объектов. Гибкость методик АСМ позволяет находить все новые и новые приложения в биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии. Бесспорны преимущества использования АСМ и в микробиологических исследованиях - нанометровая визуализация в воздушной и жидкой средах в сочетании с качественно новой информацией о механических и поверхностных свойствах, предоставляемой при использовании спектроскопических методик, делают его неоценимым в решении ряда задач. К настоящему времени АСМ успешно применяется для диагностики и быстрой количественной оценки вирусных частиц, идентификации микроорганизмов, исследования влияния различных веществ на жизнедеятельность клеток, визуализации и контроля образования специфических комплексов, контроля размеров, структуры и стабильности различных наноструктур, использующихся для доставки лекарственных средств, визуализации единичных биомолекул и многих других, чрезвычайно разнообразных задач.
Отмечая достоинства, необходимо упомянуть и о недостатках метода, к которым относят ограниченный размер поля сканирования (в лучшем случае составляет порядка 150x150 мкм), небольшой перепад высот (несколько микрометров) изучаемой поверхности и низкую, по сравнению с растровым электронным микроскопом, скорость сканирования, которая на сегодняшний день достигла 10 кадров в секунду. Совершенно очевидно, что совершенствование существующих и разработка новых методик сканирующей микроскопии позволит уже в ближайшем будущем следить за трансформациями, происходящими в биосистемах на атомарном разрешении и в режиме реального времени.
10.04.2014
Работа выполнена при поддержке Правительства Оренбургской области совместно с Российским фондом фундаментальных исследований (проект №13-04-97054) и Министерства образования и науки РФ в рамках выполнения базовой части госзаказа (проект №148) с применением оборудования ЦКП ИМНТ ОГУ
Список литературы:
1. Allison D.P., Mortensen N.P., Sullivan C.J., Doktycz M.J. Atomic force microscopy of biological samples // Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. - 2010. - V. 2. - №6. - P. 618-634. - doi:10.1002/wnan.104
2. Kai-Chih Chang, Yu-Wei Chiang, Chin-Hao Yang, Je-Wen Liou Atomic force microscopy in biology and biomedicine // Tzu Chi Medical Journal. - 2012. - V. 24. - №4. - P. 162-169.
3. Goldsbury C.S., Scheuring S., Kreplak L. Introduction to atomic force microscopy (AFM) in biology // Current Protocols in Protein Science. - 2009. - V. 17. - №7. - P. 1-19. - doi:10.1002/0471140864.ps1707s58
4. Цинберг М.Б., Дерябин Д.Г., Денисова И.В., Никиян А.Н. Ростовые и морфологические характеристики производственных штаммов Bifidobacterium и Lactobacillus при использовании гидролизатно-молочной и гидролизатно-соевой сред // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - Т. 48. - №12. - С. 9-13.
5. Васильченко А.С., Яруллина Д.Р., Никиян А.Н., Тесля А.В. Морфофункциональные характеристики бактерий Bacillus cereus на различных этапах жизненного цикла // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2012. -№10. - С. 66-71.
6. Олюнина Л.Н., Мацкова Ю.А., Гончарова Т.А., Гущина Ю.Ю. Оценка терморезистентности Azotobacter chroococcum методом атомно-силовой микроскопии // Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. - Т. 45. - №1. - С. 45-50.
7. Gaboriaud F., Bailet S., Dague E., Jorand F. Surface structure and nanomechanical properties of Shewanella putrefaciens bacteria at two pH values (4 and 10) determined by atomic force microscopy // Journal of bacteriology. - 2005. - V. 187. - №11. - P. 3864-3868.
8. Nikiyan H., Vasilchenko A., Deryabin D. Humidity-dependent bacterial cells functional morphometry investigations using atomic force microscope // International Journal of Microbiology. - 2010. - doi:10.1155/2010/704170
9. Mejias Carpio I.E., Santos C.M., Wei X., Rodrigues D.F. Toxicity of a polymer-graphene oxide composite against bacterial planktonic cells, biofilms, and mammalian cells // Nanoscale. - 2012. - V. 4. - №15. - P. 4746-56. - doi:10.1039/c2nr30774j
10. Esfandiary E., Valiani A., Hashemibeni B., Moradi I., Narimani M. The evaluation of toxicity of carbon nanotubes on the human adipose-derived-stem cells in-vitro // Advanced Biomedical Research. - 2014. - V. 3. - doi:10.4103/2277-9175.125729
11. Дерябин Д.Г., Васильченко А.С., Алешина Е.С., Тлягулова А.С., Никиян А.Н. Исследование взаимодействия углеродных наноматериалов с клетками Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии // Российские нанотехнологии. -2010. - Т. 5. - №11-12. - С. 103-108.
12. Nikiyan H., Vasilchenko A., Deryabin D. AFM investigations of various disturbing factors on bacterial cells // Microscopy: science, technology, applications and education (Microscopy book series - ISBN (13). 978-84-614-6189-9). - 2010. - №4. - V. 1. - P.523-529.
13. Liu S., Wei L., Hao L., Fang N., Chang M.W, Xu R., Yang Y., Chen Y. Sharper and faster “Nano Darts” kill more bacteria: a study of antibacterial activity of individually dispersed pristine single-walled carbon nanotube // ACS Nano. - 2009. - V. 3. - №12. -P. 3891-3902.
14. Liu S., Ng A.K., Xu R., Wei J., Tan C.M., Yang Y., Chen Y. Antibacterial action of dispersed single-walled carbon nanotubes on Escherichia coli and Bacillus subtilis investigated by atomic force microscopy // Nanoscale. - 2010. - V. 2. - №12. - P. 27442750. - doi:10.1039/c0nr00441c
15. Ahmed F., Santos C.M., Vergara R.A., Tria M.C., Advincula R., Rodrigues D.F. Antimicrobial applications of electroactive PVK-SWNT nanocomposites // Environmental Science and Technology. - 2012. - V. 46. - №3. - P. 1804-1810. - doi:10.1021/ es202374e
16. Longo G., Kasas S. Effects of antibacterial agents and drugs monitored by atomic force microscopy // Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. - 2014. - V. 6. - №3. - P. 230-244. - doi:10.1002/wnan.1258
17. Дерябин Д.Г., Васильченко А.С., Никиян А.Н. Исследование воздействия ампициллина на морфологические и механические свойства клеток Escherichia coli и Bacillus cereus с использованием метода атомно-силовой микроскопии // Антибиотики и химиотерапия. - 2011. - Т. 56. - №7-8. - С. 7-12.
18. Perry C.C., Weatherly M., Beale T., Randriamahefa A. Atomic force microscopy study of the antimicrobial activity of aqueous garlic versus ampicillin against Escherichia coli and Staphylococcus aureus // Journal of the Science of Food and Agriculture. -
2009. - V. 89. - №6. - P. 958-964. - doi:10.1002/jsfa.3538
19. Yang L., Wang K., Tan. W., He X., Jin R., Li J., Li H. Atomic force microscopy study of different effects of natural and semisynthetic ?-lactam on the cell envelope of Escherichia coli // Anal. Chem. - 2006. - V. 78. - P. 7341-7345.
20. Mohan K.V.K., Rao S.S., Atreya C.D. Evaluation of antimicrobial peptides as novel bactericidal agents for room temperature-stored platelets // Transfusion. - 2010. - V. 50. - P. 166-173.
21. Vasilchenko A.S., Nikiyan H.N, Deryabin D.G. Atomic force microscopy study of magainin 2 versus human platelet extract action on Escherichia coli and Bacillus cereus // Journal of biological research. - 2013. - №19. - P. 3-9.
22. Meincken M., Holroyd D.L., Rautenbach M. Atomic force microscopy study of the effect of antimicrobial peptides on the cell envelope of Escherichia coli // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2005. - V. 49. - № 10. - P. 4085-4092.
23. Филонов А., Яминский И. Обработка и анализ данных в сканирующей зондовой микроскопии: алгоритмы и методы // Наноиндустрия. - 2007. - №2. - С. 32-34.
24. Alsteens D., Verbelen C., Dague E., Raze D., Baulard A., Dufrene Y. Organization of the mycobacterial cell wall: a nanoscale view // Pflugers Archiv European Journal of Physiology. - 2008. - V. 456. - № 1. - P. 117-125.
25. Gilbert Y., Deghorain M., Wang L., Xu B., Pollheimer P.D., Gruber H.J., Errington J., Hallet B., Haulot X., Verbelen C., Hols P., Dufrene Y. Single-molecule force spectroscopy and imaging of the vancomycin/d-Ala-d-Ala interaction // Nano Letters. - 2007. -V. 7. - №3. - P. 796-801.
26. Ramos-Vara J.A. Technical aspects of immunohistochemistry // Veterinary pathology. - 2005. - V.42. - №4. - P. 405-426.
27. Kuo J. Electron microscopy: methods and protocols. Humana Press. - 2007. - 608 p. - ISSN 1064-3745.
28. Kuznetsov V.Y., Ivanov Y.D., Archakov A.I. Atomic force microscopy revelation of molecular complexes in the multiprotein cytochrome P450 2B4-containing system // Proteomics. - 2004. - V. 4. - №.8. - P. 2390-2396.
29. Способ детекции токсичных белков на основе сканирующей зондовой микроскопии / В. А. Быков [и др.]; ЗАО "НТ-МДТ". - № 2003121587/13 ; Заявл. 16.07.2003 ; Опубл. 10.01.2006 Патент 2267787 Российская Федерация, МКИ G01N 33/577.
30. Малюченко, Н.В. Детекция иммунных комплексов с помощью атомно-силовой микроскопии // Биофизика. - 2004. -Т. 49. - № 6. - С. 1008-1014.
31. Dykman L.A., Staroverov S.A., Bogatyrev V.A., Shchyogolev S.Yu. Gold nanoparticles as an antigen carrier and as an adjuvant. In: Gold Nanoparticles: Properties, Characterization and Fabrication, Ed. by Chow P.E. - New York: Nova Science Publishers. -
2010. - Ch. 2. - P 59-88.
32. Tatlybaeva E.B., Nikiyan H.N., Vasilchenko A.S., Deryabin D.G. Atomic force microscopy recognition of protein A on Staphylococcus aureus cell surfaces by labeling with IgG-Au conjugates // BeilsteinJ. Nanotechnol. - 2013. - №4. - P. 743-749.
33. Nordstrom M., Keller S., Lillemose M., Johansson A., Dohn S., Haefliger D., Blagoi G., Havsteen-Jakobsen M., Boisen A. SU-8 cantilevers for bio/chemical sensing; Fabrication, characterisation and development of novel read-out methods // Sensors. - 2008. - V. 8. - №3. - P. 1595-1612.
34. Steffens C., Leite F.L., Bueno C.C., Manzoli A., Herrmann PS. Atomic force microscopy as a tool applied to nano/biosensors // Sensors. - 2012. - V. 12. - №6. - P. 8278-8300. - doi:10.3390/s120608278
35. Сафенкова И.В., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Применение атомно-силовой микроскопии для характеристики единичных межмолекулярных взаимодействий // Успехи биологической химии. - 2012. - Т. 52. - С. 281-314.
36. Fuhrmann A., SchoeningJ.C., Anselmetti D., Staiger D., Ros R. Quantitative analysis of single-molecule RNA-protein interaction // Biophysical Journal. - 2009. - V. 96. - №12. - P. 5030-5039.
37. Lynch S., Baker H., Byker S.G., Zhou D., Sinniah K. Single molecule force spectroscopy on G-quadruplex DNA // Chemistry a European journal. - 2009. - V. 15. - №33. - P 8113-8116.
38. Eckel R., Wilking S.D., Becker A., Sewald N., Ros R., Anselmetti D. Single-molecule experiments in synthetic biology: an approach to the affinity ranking of DNA-binding peptides // Angewantde chemie international edition. - 2005. - V. 44. - №25. - P. 39213924.
39. Porter-Peden L., Kamper S.G., Wal M.V., Blankespoor R., Sinniah K. Estimating kinetic and thermodynamic parameters from single molecule enzyme-inhibitor interactions // Langmuir. - 2008. - V. 24. - №20. - P. 11556-11561.
40. Yew Z.T., Olmsted P.D., Paci E. Free energy landscapes of proteins: insights from mechanical probes // Single-Molecule Biophysics. - 2012. - V. 146. - P. 395-417.
41. Kuznetsov Y.G., Daijogo S., Zhou J., Semler B.L., McPherson A. Atomic force microscopy analysis of icosahedral virus RNA // Journal of molecular biology. - 2005. - V. 347. - №1. - P 41-52.
42. Kuznetsov Y.G., McPherson A. Atomic force microscopy in imaging of viruses and virus-infected cells // Microbiology and molecular biology reviews. - 2011. - V. 75. - №2. - P. 268-85. - doi:10.1128/MMBR.00041-10
43. Porter M.D., Driskell J.D., Kwarta K.M., Lipert R.J., Neill J.D., Ridpath J.F. Detection of viruses: atomic force microscopy and surface enhanced Raman spectroscopy // Developments in biologicals. - 2006. - V. 126. - P. 31-39.
44. Шебанова А.С., Саватеев М.Н., Малюченко Н.В., Трофимов Д.Ю., Агапов И.И. Новый метод количественной оценки вирусных частиц // Биомедицинская химия. - 2009. - Т.55. - Вып.5. - С 610-620.
45. Carrasco C., Luque A., Hernando-Perez M., Miranda R., CarrascosaJ.L., Serena P.A., de Ridder M., Arvind R., Gomez-Herrero J., Schaap I.A.T., Reguera D., de Pablo PJ. Built-in mechanical stress in viral shells // Biophysical Journal. - 2011. - V. 100. - № 4. - P. 1100-1108.
46. Hernando-Perez M., Miranda R., Aznar M., CarrascosaJ.L., Schaap I.A.T., Reguera D., Pablo PJ. Direct measurement of phage phi29 stiffness provides evidence of internal pressure // Small. - 2012. - V. 8. - №15. - P. 2366-2370. - doi:10.1002/ smll.201200664
47. Полещук Н., Асташонок А., Рубаник Л., Капитулец С., Жавнерко Г., Парибок И., Фарния П., Яминский И. Нанотехнологические подходы для диагностики бактериально-вирусных инфекций // Наноиндустрия. - 2012. - Вып. 35. - С. 48-54.
Сведения об авторах:
Никиян Айк Николаевич, доцент кафедры биофизики и физики конденсированного состояния Оренбургского государственного университета, кандидат физико-математических наук, доцент
e-mail: nikiyan@yahoo.com
Татлыбаева Елена Батыровна, аспирант кафедры микробиологии Оренбургского государственного
университета, e-mail: tatlubaeva@mail.ru 460018, г. Оренбург, пр-т Победы, 13
