CC BY
133
УДК 543.422.3
ТВЕРДОФАЗНО-СПЕКТРОФОТОМЕТРИчЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 2,6-ДИХЛОРФЕНОЛИНДОФЕНОЛА, ИММОБИЛИЗОВАННОГО
В ПОЛИМЕТАКРИЛАТНУЮ МАТРИЦУ
А.В. Суханов, Н.А. Гавриленко*
Томский государственный университет *Томский политехнический университет E-mail: gavrilkenko@mail.tsu.ru
Изучено взаимодействие аскорбиновой кислоты с 2,6-дихлорфенолиндофенолом, иммобилизованным в полиметакрилатную матрицу. Разработана простая методика твердофазно-спектрофотометрического определения аскорбиновой кислоты. Методика применена для анализа экстрактов растительного сырья.
Ключевые слова:
Твердофазная спектрофотометрия, иммобилизованный реагент, 2,6-дихлорфенолиндофенол, определение аскорбиновой кислоты. Key words:
Solid-phase spectrophotometry, immobilized reagent, 2,6-dichloroindophenol, determination ascorbic acid.
Витамин С - Ь-аскорбиновая кислота является широко распространенным компонентом в пищевой и фармацевтической промышленностях. Синтетический витамин С широко используется в качестве пищевых добавок и, следовательно, имеет свой Е номер (Е300). Использование Ь-аскорбино-вой кислоты в качестве пищевых добавок компенсирует потери витамина в процессе приготовления пищи либо просто повышает природное содержание витамина. Также Ь-аскорбиновую кислоту используют в качестве антиоксиданта, что повышает кислотность продуктов и увеличивает срок их хранения. Общеизвестна значимость витамина С в качестве компонента фармацевтических препаратов. Обычно она используется не в чистом виде, а в смесях с другими веществами, которые часто добавляются для улучшения вкуса. Ь-аскорбиновая кислота обнаружена у всех представителей растительного мира, во всех частях растений, и часто в достаточно больших количествах.
Большинство методов количественного определения аскорбиновой кислоты основаны на ее восстановительных свойствах. Традиционные титри-метрические методы [1, 2] сложно использовать при анализе растворов, имеющих собственную интенсивную окраску. Предложенные современные высокочувствительные физико-химические методы определения аскорбиновой кислоты [3], имеют общий недостаток - использование токсических органических реагентов. Указанный недостаток можно устранить, используя реагенты, иммобилизованные на твердых носителях. Кроме того, иммобилизованные реагенты могут быть использованы для определения элементов в твердой фазе методами спектроскопии, в качестве готовой аналитической формы для визуально-тестовых методов анализа и чувствительного элемента в оптических сенсорах. В данной работе, для разработки твердо-фазно-спектрофотометрического метода определе-
ния аскорбиновой кислоты в экстрактах растительного сырья, было предложено использовать 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХИФ), иммобилизованный в полиметакрилатную матрицу.
Полиметакрилатную матрицу в виде прозрачной пластины толщиной (0,60+0,04) мм получали радикальной блочной полимеризацией по методике, описанной в работе [4]. Из исходной пластины вырезали пластины размером 6x8 мм массой около 0,05 г. В работе использовали реактивы марки «х.ч.», «ч.д.а.». Исходные растворы натриевой соли 2,6-дихлорфенолиндофенола и аскорбиновой кислоты готовили растворением их точных навесок в бидистиллированной воде. Рабочие растворы готовили последовательным разбавлением исходных растворов непосредственно перед использованием. Необходимое значение рН создавали универсальным и цитратным буферными растворами [5].
Иммобилизацию ДХИФ в полиметакрилатную матрицу проводили сорбцией из водного раствора в статическом режиме. Для этого полиметакрилат-ную матрицу помещали в раствор реагента и перемешивали в течение 5 мин, при этом матрица окрашивалась в синий цвет, соответствующий окисленной ионной форме реагента (Amax=630 нм). Спектры поглощения и оптические плотности растворов и полиметакрилатной матрицы измеряли на спектрофотометрах Evolution 600 и Spekol 21. Оптические характеристики полиметакрилатной матрицы с иммобилизованным реагентом после контакта с исследуемым раствором измеряли относительно немодифицированной полиметакрилатной матрицы. Величину рН растворов контролировали с помощью иономера И-160.
Взаимодействие аскорбиновой кислоты с иммобилизованным реагентом изучали в статическом режиме методом твердофазной спектрофотоме-трии. Для этого 50 мл раствора аскорбиновой кислоты определенной концентрации и кислотности
перемешивали 5...45 мин с 0,05 г полиметакрилат-ной матрицы, модифицированной 2,6-дихлорин-дофенолом. Затем измеряли оптическую плотность в максимуме полосы поглощения ДХИФ в полиме-такрилатной матрице.
Влияние рН раствора на восстановление аскорбиновой кислотой иммобилизованного ДХИФ изучали следующим образом: матрицы, с одинаковым содержанием реагента, перемешивали с раствором аскорбиновой кислоты определенной концентрации при заданном значении рН, параллельно получали матрицы после контакта с раствором с заданным значением рН, не содержащим аскорбиновой кислоты. Затем рассчитывали степень восстановления иммобилизованного реагента - а, по зависимости а от рН делали вывод об оптимальном значении рН раствора.
Степень восстановления иммобилизованного ДХИФ - а рассчитывали как
А - А,
а =-
-100 %,
где А0, АI - значения оптической плотности поли-метакрилатной матрицы с иммобилизованным ДХИФ после контакта с раствором определенной кислотности в отсутствии и присутствии аскорбиновой кислоты, соответственно. Измерение оптической плотности проводили при длине волны, соответствующей максимуму поглощения иммобилизованного реагента при данном значении рН.
Для изучения влияния количества реагента в матрице и времени контакта с анализируемым раствором на аналитический сигнал, готовили несколько серий пластин, модифицированных в растворах различной концентрации 2,6-дихлориндо-фенола. Содержание реагента в матрице рассчитывали по формуле:
а = (Со - [С]) V т
где С0 и [С] - концентрации определяемого соединения в водном растворе до и после сорбции, соответственно, мг/мл, V - объем раствора, из которого производится иммобилизация, мл, т - масса полиметакрилатной матрицы, г.
Затем каждую из серий пластин приводили в контакт с растворами аскорбиновой кислоты определенной концентрации при рН=3, в течение заданного времени. Экспериментальные данные представляли в виде зависимости степени восстановления от содержания реагента в матрице.
ДХИФ является хорошо изученным окислительно-восстановительным индикатором [6]. Восстановленная форма ДХИФ бесцветна, а окисленная форма действует как кислотно-основной индикатор, окрашенный в красно-розовый цвет в кислом растворе (молекулярная форма, ИК, ^тж~510 нм) и в синий цвет в щелочном растворе (ионная форма, К-, Ятах«605 нм). При этом синяя окраска интенсивнее красной, индикатор в кислом растворе в молекулярной форме неустойчив и выпадает в осадок. 2,6-дихлориндофенол традиционно используется в титриметрических методах определения аскорбиновой кислоты. Аскорбиновая кислота восстанавливает окрашенный ДХИФ, с образованием бесцветного продукта. Реакция окисления - восстановления ДХИФ представлена на схеме.
В работе [7] показана возможность использования полиметакрилатной матрицы с иммобилизованным ДХИФ в качестве чувствительного оптического элемента для определения восстановителей, в частности, аскорбиновой кислоты. После контакта с раствором аскорбиновой кислоты интен-
О
Окисленная форма
+ 2 е, 2Н+ О ^ НО
Восстановленная форма
ионная форма синяя окраска
Н+
С1^
+ 2 е, 2Н+ -ОН „ ^ НО
молекулярная форма розовая окраска Схема. Реакция окисления - восстановления ДХИФ
"О"
Н+
Рис 1. Спектры поглощения полиметакрилатной матрицы с иммобилизованным ДХИФ после контакта с раствором аскорбиновой кислоты, при рН 3, сАх, мг/л: 1) 0; 2) 50; 3) 70; 4) 100
сивность окраски полиметакрилатной матрицы с иммобилизованным ДХИФ уменьшается. Обесцвечивание сопровождается снижением оптической плотности при 550 нм пропорционально содержанию аскорбиновой кислоты в растворе, рис. 1. Изменение оптической плотности при данной длине волны было выбрано в качестве аналитического сигнала.
Для определения оптимальных условий взаимодействия иммобилизованного ДХФ с аскорбиновой кислотой были исследованы: рН раствора ас-
корбиновой кислоты, содержание реагента в матрице и время контакта с анализируемым раствором.
Для изучения влияния рН на интенсивность взаимодействия иммобилизованного реагента с аскорбиновой кислотой была получена зависимость степени восстановления реагента (а) от рН анализируемого раствора, рис. 2. Наиболее полное восстановление иммобилизованного реагента наблюдается в области рН=2...3; для дальнейшей работы было выбрано значение рН=3.
Таблица 1. Параметры уравнений для определения концентрации аскорбиновой кислоты. Коэффициент корреляции -0,997
Время контакта, мин Уравнение ДОС, мг/л
15 Д=1,141-0,008с 0...100
30 ~А=1,031-0,010~ 0...70
45 ~А=1,124-0,016~ 0...50
ДОС - диапазон определяемых содержаний; А - значение оптической плотности; с - концентрация аскорбиновой кислоты, мг/л.
На основании проведенных исследований была разработана методика твердофазно-спектрофото-метрического определения аскорбиновой кислоты, которая апробирована при анализе экстрактов растительного сырья.
Методика определения. Аликвоту анализируемого раствора с содержанием аскорбиновой кислоты 0,5...5 мг вносили в колбу вместимостью 50 мл, создавали рН=3,0 цитратным буфером и разбавляли дистиллированной водой. В раствор помещали пластинку полиметакрилатной матрицы, модифицированную ДХИФ, и перемешивали в течение 15 мин. Затем пластинку сушили между листами фильтровальной бумаги и измеряли оптическую плотность при 550 нм. Содержание аскорбиновой кислоты находили по градуировочному графику.
Методика была апробирована при анализе аскорбиновой кислоты в соковом напитке «Да» (Изготовитель - ООО «СП Нидан - Экофрукт») и экстракте шиповника. Экстракт шиповника готовили по методике [8. С. 239]. В качестве метода сравнения при определении аскорбиновой кислоты в экстракте использовали титриметрический метод [8]. Использование иодатного метода для окрашенного образца сока представляло трудности, поэтому для оценки правильности результатов определения аскорбиновой кислоты в соке применяли метод «вве-
0 20 40 60 80 100 Ca.SC> МГ/Л
Рис. 4. Зависимость оптической плотности полиметакрилатной матрицы с иммобилизованным ДХИФ при 550 нм от концентрации аскорбиновой кислоты в растворе при контакте в течение: 1) 15; 2) 30 и 3) 45 мин (У=50 мл, рН=3)
В ходе исследования влияния содержания реагента в матрице на характер взаимодействия аскорбиновой кислоты с иммобилизованным ДХИФ была получена зависимость степени восстановления иммобилизованного ДХИФ (а) от содержания реагента в матрице (а) при рН=3 (рис. 3). Наибольшая степень восстановления иммобилизованного реагента наблюдается при его содержании в матрице 0,30...0,35 мг/г. На рис. 4 представлены зависимости аналитического сигнала от концентрации аскорбиновой кислоты в растворе при разном времени контакта полиметакрилатной матрицы с содержанием ДХИФ 0,35 мг/г; в табл. 1 приведены параметры соответствующих градуировочных зависимостей. При увеличении времени контакта увеличивается чувствительность определения, но уменьшается диапазон линейности градуировоч-ной зависимости.
0,15 0,25 0,35 0,45 а, мг/г
Рис. 3. Зависимость степени восстановления иммобилизованного ДХФ (а) раствором аскорбиновой кислоты различной концентрации от содержания реагента в матрице (а), мг/г, сАх: 1) 50; 2) 30 мг/л. Время контакта 15 мин, объем 50 мл, рН=3
Таблица 2. Результаты определения аскорбиновой кислоты (n=3, P=0,95)
Объект Введено, мг/л Найдено
Предлагаемый r % Титриметри-ческий r %
Экстракт шиповника - (0,29±0,09) мг/100 г 12,3 0,293±0,004 0,6
Соковый напиток «Да» (указано на упаковке 9 мг/100 мл) - (10±3) мг/100 мл 11,9 - -
10 (22±4) мг/100 мл 7,5 - -
п - число опытов; Р - доверительная вероятность; б, - стандартное квадратичное отклонение.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Государственная фармакопея СССР. Изд. XI. Вып. 2. - М.: Медицина, 1989. - 397 с.
2. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. - М.: Медицина, 1983. -272 с.
3. Запорожец О.А., Крушинская Е.А. Определение аскорбиновой кислоты методами молекулярной спектроскопии // Журнал аналитической химии. - 2002. - Т. 57. - № 4. - С. 343-354.
4. Индикаторный чувствительный материал для определения микроколичеств веществ: пат. 2272284 Рос. Федерация, № 2004125304/04; заявл. 18.08.04; опубл. 20.03.06, Бюл. № 8. -8 с.
дено - найдено». Результаты, полученные при применении обоих методов, согласуются (табл. 2).
Выводы
Исследовано взаимодействие аскорбиновой кислоты с иммобилизованным в полиметакрилатную матрицу 2,6-дихлорфенолиндофенолом. Разработана методика твердофазно-спектрофотометрическо-го определения аскорбиновой кислоты, позволяющая анализировать интенсивно окрашенные образцы, например, экстракты растительного сырья.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант № 09-03-90758 (мобст).
5. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. - М.: Химия, 1989. - 448 с.
6. Индикаторы. Т. 2 / под ред. Э. Бишопа. - М.: Мир, 1976. -437 с.
7. Гавриленко Н.А., Суханов А.В., Мохова О.В. Окислительно-восстановительные и кислотно-основные свойства 2,6-дих-лорфенолиндофенола иммобилизованного в полиметакрилат-ную матрицу // Журнал аналитической химии. - 2010. - Т. 65. - № 1. - С. 20-24.
8. Девятнин В.А. Методы химического анализа в производстве витаминов. - М.: Медицина, 1964. - 370 с
Поступила 10.02.2010 г.
