CC BY
74
УДК 615.322.015.44:616-091.818
Л.А. Лацерус1, Н.М. Пинигина2, А.Ю. Барышников2, М.В. Огородникова2
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ И АПОПТОЗИНДУЦИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА АБИСИЛИН® В ОТНОШЕНИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
1ООО «Инитиум-Фарм», Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Лацерус Людмила Анатольевна, кандидат медицинских наук, генеральный директор ООО «Инитиум-Фарм» адрес: 142000, Московская область, г. Домодедово, Каширское ш., д. 7, тел.: +7(499)-722-2357 e-mail: initium-pharm@vandex.ru
Статья поступила: 15.12.2009, принята к печати 25.03.2010.
Резюме
Абисилин® - отечественный пероральный препарат, содержащий в своем составе природный комплекс терпеноидов, синтезируемый хвойными деревьями. В экспериментах in vitro установлено, что препарат Абиси-лин® может оказывать избирательное цитотоксическое действие на опухолевые клетки и вызывать их гибель по типу апоптоза.
Ключевые слова: Абисилин®, опухолевые клетки, цитотоксическая активность, апоптоз.
L.A. Latseruz1, N.M. Pinigina1, A.Yu. Baryshnikov2, M.V. Ogorodnikova2 THE CYTOTOXIC APOPTOSIS-INDUCING ACTIVITY OF ABISILIN 'Initium-Parm, LTD, Moscow
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow Abstract
In this review we discuss the anticancer activity of different groups of terpenoids obtained from coniferous trees, particularly from Pinaceae.
Key words: medicinal plants, terpenoids, anticancer activity.
Введение
Одним из направлений по изысканию новых лекарственных средств для использования в онкологии является поиск специфически активных природных соединений растительного происхождения, обладающих слабой токсичностью в отношении нормальных клеток.
Особый интерес вызывают растительные тер-пеноиды, в том числе полученные из хвойных деревьев, среди которых выявлены соединения, проявляющие противоопухолевую активность [4; 5; 7]. Большой набор моно-, сескви-, ди- и тритерпенои-дов, обнаруженных в хвойных породах деревьев, может оказаться перспективным источником получения эффективных средств для лечения больных онкологическими заболеваниями [3].
Лекарственный препарат Абисилин® ( Аби-сил 20 %-ный раствор в масле для перорального применения) содержит в своем составе природный комплекс терпеноидов (изопреноидов), синтезируемый хвойными деревьями [9].
Для субстанции препарата (Абисил - пихты сибирской терпены) и его лекарственной формы для местного и наружного применения, включенных в Государственный реестр лекарственных средств, выявлены антимикробные, противовоспалительные, ранозаживляющие, иммуномодулирующие и другие фармакологически значимые эффекты [1; 2].
Принимая во внимание низкую токсичность препарата Абисилин, а также его способность оказывать разнонаправленное действие на биологические процессы в организме, возникает необходимость в изучении его противоопухолевой активности.
Цель настоящей работы - определение in vitro цитотоксической и апоптозиндуцирующей активности препарата Абисилин в отношении некоторых клеточных линий опухолей человека.
Материалы и методы
Исследования проводили на опухолевых клеточных линиях: Т-клеточный лимфобластозный лейкоз - Jurkat, В-клеточный лейкоз - Raji, хронический миелогенный лейкоз - K562, миелолейкоз
- U937, меланома - Mel Р, рак молочной железы
- Т 47 D, рак яичников - SKOV-3, рак предстательной железы - РС-3.
Клеточные линии выращивали в полной питательной среде RPMI-1640, содержащей 10 % телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ/мл глутамина,
0,1 мг/мл гентамицина, витамины, пируват натрия, аминокислоты при 37 °С и в атмосфере 5% СО2.
Для исследования использовали следующие концентрации препарата Абисилин®: 300 мкг/мл, 500 мкг/мл, 800 мкг/мл, 1000 мкг/мл. При разведении препарата применяли 1 %-ный раствор ДМСО, приготовленный с использованием РВ8.
Определение цитотоксической активности Абисилина® проводили колометрическим методом с использованием МТТ-теста [6; 8]. Опухолевые клетки в концентрации 5*104 клеток/мл засевали в 96-луночные плоскодонные планшеты (Sarshted), добавляли по 20 мкл препарата в исследуемых концентрациях и инкубировали 72 ч в стандартных условиях (каждую концентрацию препарата исследовали в триплетах). В качестве контролей использовали триплет лунок без препарата и триплет лунок с добавлением 20 мкл 1% ДМСО.
Выживаемость опухолевых клеток при инкубации с Абисилином.
За 5 ч до окончания инкубации в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ (Sigma, Chemical Co, США). После окончания инкубации клетки осаждали центрифугированием планшетов при 1000 об/мин в течение 2-3 мин.
Супернатант аккуратно отбирали и в каждую лунку добавляли по 200 мкл ДМСО (ICN Bio-medicals, Inc) -растворителя кристаллов формазана. Клетки ресуспен-зировали и инкубировали 10 мин при 37 °С, после чего измеряли оптическую плотность раствора на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» АИФР-01 (Россия) при v 540 нм.
МТТ метаболизируется жизнеспособными клетками, превращаясь в нерастворимый в воде формазан, тем самым, изменяя оптическую плотность раствора пропорционально количеству выживших клеток. Опухолевые клетки считали чувствительными к исследуемому препарату, если количество погибших клеток в культуре составляло не менее 50 %.
Каждый эксперимент повторяли 3 раза. Процент выживаемости определяли по формуле (среднее значение ОП в опыте / среднее значение ОП в контроле) х 100 %. Выявление апоптических клеток проводилось методом двойного прижизненного окрашивания с использованием Аннексина V- FITC в комбинации с таким витальным красителем, как пропедиум иодид (PI).
Окрашенные по Аннексину V-FITC и PI клетки оценивали по следующим критериям: живые клетки отрицательные по Аннексину V и PI (AnV“ PI “), ранние апоптические клетки положительные по Аннек-сину V и отрицательные по PI (AnV+ PI_), поздние апоптические или некротические клетки положительные по Аннексину V и по PI (AnV+ PI+).
В качестве контроля использовали опухолевые клетки, которые инкубировали в тех же условиях, но в
отсутствии препарата, а также опухолевые клетки, которые инкубировали в тех же условиях, но вместо препарата добавляли 1%-ный раствор ДМСО.
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. При сопоставлении средних величин использовали критерий значимости Стьюдента (различия считали статистически значимыми при р<0,05).
Результаты и обсуждение
При инкубации опухолевых клеток с препаратом Абисилин® его цитотоксическое действие выявлено только в отношении клеточных линий Jurkat, Raji и PC-3. Кривые выживаемости опухолевых клеток под воздействием препарата представлены на рисунке.
Наиболее выраженное цитотоксическое действие препарат Абисилин® проявил по отношению к клеточной линии Jurkat - 41,8 % при использовании препарата в концентрации 1000 мг/мл. С увеличением концентрации Абисилина® уменьшался процент живых опухолевых клеток и наоборот.
При исследовании препарата Абисилин® в отношении опухолевых клеток U937, K562, T 47 D, SKOV-3, Mel P цитотоксического эффекта выявлено не было.
Определение апоптоза, индуцированного действием препарата Абисилин® с использованием метода прижизненного двойного окрашивания Annexin V/PI, было проведено на опухолевых клетках линий Jurkat, Raji, PC-3, U937 в концентрации препарата 300 мкг и 1000 мкг.
Установлено, что Абисилин® вызывал гибель опухолевых клеток исследованных линий по типу апоптоза (см. таблицу).
АБИСИЛИН ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ И АПОПТОЗИНДУЦИРУЮЩАЯа 11
Таблица
Результаты исследования абисилин-индуцированного апоптоза
Препарат Суммарное кол-во опухолевых клеток положительных по AnV+PI“, AnV+PI+ , AnV“PI+ , %
Jurkat Raji PC-3 U937
Контроль (i %—ный р-р ДМСО) 26,G 23,i 33,i i,7
Абисилин®, 3GG мкг/мл 53,3* 27,9 56,7* 7,4
Абисилин®, iGGG мкг/мл 86,6* 44,9* 62,4* 38,2*
*р^^5 - достоверность различия между опытом и контролем
С опытным увеличением концентрации Аби-силина® число клеток, достигших апоптоза, значительно увеличивалось.
Наибольшее количество клеток в сумме положительных по АпУ+РГ, АпУ+Р1+, АпУП+ было выявлено по отношению к клеточной линии 1шка и соста-
вило 86,6 % при использовании дозы Абисилина® 1000 мкг/мл. Таким образом, полученные данные свидетельствует о способности препарата Абиси-лин® оказывать избирательное цитотоксическое действие на опухолевые клетки и вызывать их гибель по типу апоптоза.
Выводы
1. Лекарственный препарат Абисилин® обладает избирательной цитотоксической активностью в отношении некоторых клеточных линий опухолевых клеток (Jurkat, Raji, РС-3).
2. Выживаемость опухолевых клеток зависит от концентрации препарата Абисилин®. При увеличении концентрации препарата уменьшается процент живых опухолевых клеток.
3. Препарат Абисилин® вызывает гибель опухолевых клеток по типу апоптоза.
Литература
1. Государственный реестр лекарственных средств. - М.,2004. - Т. 1. - С. 93.
2. Лацерус Л.А., Носков А.П.. Пинигина Н.М. Биологическая активность и клиническая эффективность нового фитопрепарата «Абисил-1» // Современные проблемы педиатрии и детской хирургии: Материалы Сибирско-Американской научно-практической конференции. 7-8 октября 1998 г. - Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1998. - С. 233-8.
3. Пентегова В.А., Дубовенко Ж.В., Ралдугин В.А., Шмидт Э.П. Терпеноиды хвойных растений. - Новосибирск: Наука, 1987. - 97 с.
4. Рахимов К.Д. Фармакологическое и доклиническое изучение противоопухолевого препарата аргла-бин // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. - Т. 4, № 2. - С. 15-7.
5. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Толстиков Г.А. и др. Терпеноиды ряда лупана - биологическая активность и фармакологические перспективы: 1. Природные производные лупана // Биологическая химия. - 2006. - Т. 32, № 1. - С. 42-55.
6. BoydM. Status the NCI. Preclinical antitumor drug discovery screen // Principles and practice of oncology.
- 1989. - 3(10). - P. 1-12.
7. Kim Hyun Jung, Choi Eun Hwa, Lee Ik-Soo. Two lanostane triterpenoid from Abies koreana // Phyto-chemisry. - 2004. - 65(18). - P. 2545-9.
8. Mosmann T. Rapid Colorimetris assay for cellular growth and surnival: application to proliferation and cito-toxicity assays // J. of Immunological methods. - 1983. - 65. - P. 55-63.
9. PCT/RU2008/000147. Pub.No.: W0/2009/113902, 17.09.2009. Pinigina N.M., Latserus L.A., Baryshnikov F.U. et. al. Antitumoral terpenoid pharmaceutical composition “Abisilin” exhibiring angiogenesis-inhibitig action.
