CC BY
112
Медицинская иммунология 2001, Т. 3, № 3, стр 439-447 ©2001, СПб РОРААКИ
Обзоры
ЦИТОКИНЫ И ВАКЦИНЫ
Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И., Алпатова H.A., Акользина С.Е.
ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздрава России, г. Москва
Резюме. Некоторые цитокины (IL-1, IL-2, TNF, гибрид TNF с тимозином и др.) и их комбинации, вводимые вместе с вакцинами против бешенства, клещевого энцефалита или гепатита А, способны стимулировать развитие поствакцинального иммунитета у экспериментальных животных. Стимуляция клеточного и гуморального иммунитета может быть достигнута подбором необходимых цитокинов. Вакцины против бешенства, полиомиелита, гепатита А, кори, а также культуры клеток млекопитающих (ПЗМ, Л-68, М-22,4647, VERO), которые используются для получения вирусных вакцин, содержат ряд провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF). Набор и концентрация цитокинов в вакцинах зависят от вида клеточных линий и штаммов вируса. Препараты естественного лейкоцитарного интерферона содержат примесь IL-1 и TNF. Имеется значительный разброс в концентрациях цитокинов в препаратах интерферона различных серий одного и того же предприятия и между одноименными препаратами, изготовленными на разных предприятиях. Данные свидетельствуют о присутствии цитокинов в некоторых биомедицинских препаратах и о возможности использования цитокинов в качестве адьювантов вакцин.
Ключевые слова: цитокины, вакцины, адъюванты.
Medunitsyn N.V., Avdeeva G.I., Alpatova N.A., Akolzina S.E.
CYTOKINES AND VACCINES
Abstract. Some cytokines (IL-1, IL-2, TNF and the hybrid form of TNF and thymosin) and their combinations, when injected together with rabies vaccine, tick-born encephalitis vaccine or hepatitis A vaccine, can stimulate the development of postvaccinal immunity in laboratory animals. The development of cell-mediated and humoral immunity may be stimulated by combinations of necessary cytokines. Rabies vaccine, poliovirus vaccine, hepatitis A vaccine and measles virus vaccine, as well as mammalian cell cultures (green monkey kidney cells, L-68, M-22,4647, VERO) used for virus vaccine development, contain some proinflammatory cytokines (IL-1, IL-6, TNF). The definite pattern and concentrations of cytokines in vaccines depend on the type of the cell line and on the virus strain. Natural human leukocyte interferon preparations contain an admixture of IL-1 and TNF. There are significant variations in cytokine concentrations in interferon preparations produced by various companies, as well as in interferon preparations of different series produced by the same company. These data indicate an admixture of cytokines in some pharmaceuticals and the possibility of clinical utility of cytokines as vaccine adjuvants. (MedJmmunol., 2001, vol.3, N 3,pp 439-447)
Цитокины - клеточные низкомолекулярные гликопротеины, они секретируются преимущественно активированными клетками иммунной системы и обладают широким спектром биологического действия. Основные классы цитокинов включают интерлейкины (от ^-1 до 1Е-18), интерфероны (1Ш-а, 1Ш-(3,1РЫ-у), колониестимулирующие факторы (С-СЗБ, СМ-СБР), факторы некроза опухолей (Т№-а, ТЫР-(3), семейство ростовых факторов и хемокины [3,8,10].
Адрес для переписки:
Медуницын Николай Васильевич - д.м.н., профессор, директор ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. ЛА.Тарасевича.
121002, Москва, ул.Сивцев Вражек, 41.
Тел./факс: (095) 241-39-22.
Цитокины оказывают влияние практически на все клетки, они обеспечивают межклеточную кооперацию, воздействуя на большинство процессов, протекающих в организме. Их действие неспецифично, активная продукция цитокинов происходит в ответ на различные стимулирующие агенты, включая антигены. Цитокины модулируют экспрессию клеточных рецепторов и образуют особую сеть индукции секреции друг друга. Благодаря высокоаффинным рецепторам на клетках-мишенях (константа диссоциации в пределах 10_10-10~,2М), цитокины способны вызывать биологические эффекты в малых концентрациях. Действие цитокинов плейотропно, они обладают локальной (ауто- и паракринной) и системной (эндокринной) регуляторной активностью [3, 9,17, 21, 23]. Цитокины определяют особенности формирования иммунного ответа, способствуя рас-
познаванию антигенов, повышая экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), молекул адгезии, вызывая активацию, пролиферацию и дифференцировку иммунорегуляторных клеток и клеток-эффекторов [3, 10, И].
Сила и характер иммунного ответа при вакцинации зависит от многих факторов, прежде всего от свойств самой вакцины (вида возбудителя, технологии приготовления), пути и схемы введения вакцины, а также функционального состояния организма и его генетических особенностей [4, 7]. В настоящее время для оптимизации вакцинального процесса используются различные иммуномодуляторы, которые отличаются друг от друга по своей природе и способу действия. Механизм действия многих из них опосредован цитокинами [1,12,13,14,15,16,20]. Исследования по использованию препаратов цитоки-нов в качестве адьювантов вакцин немногочисленны.
Цитокины могут присутствовать в иммунобиологических препаратах, субстратом для изготовления которых являются клетки эукариотов. Определение цитокинов в коммерческих препаратах важно для оценки их влияния на биологическую активность препаратов. Эпителиальные, фибробластные и лим-фобластоидные клеточные линии, используемые для производства иммунобиологических препаратов, способны секретировать цитокины спонтанно или при антигенной стимуляции [2,18, 22,24]. Установлено присутствие 1Ь-1, С-СБР, СМ-СЗБ, 1Ь-6 в ан-тирабической вакцине и ряде противовирусных вакцин. Большое количество цитокинов находится в лейкоцитарных препаратах интерферона. Н.-1 и ТОТ-а выявлены в лекарственных препаратах моно-
клональных антител, изготовленных на основе лим-фобластоидных клеток человека, a IL-1, IL-6 и TNF-а - в препаратах на основе клеток мыши [2, 5, 6, 19].
ЦИТОКИНЫ В ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ
Нами показано, что вакцины против гепатита А, бешенства, полиомиелита и кори, полученные на основе клеток эукариотов, содержат провоспалитель-ные цитокины (IL-1, IL-6, TNF-a). Набор и концентрация указанных цитокинов зависят от вида вакцины. Как видно из таблицы 1, выявляемое содержание IL-1P в исследуемых вакцинах было в пределах от 26,0+4,0 до 130,8±12,8 пкг/мл. Наиболее высокий уровень IL-ip выявлен в вакцине против гепатита А, изготовленной на основе клеточной линии 4647 (130,8+12,8 пкг/мл). Отсутствие IL-ip установлено в полиомиелитной вакцине, изготовленной на клеточной линии VERO.
Содержание IL-6 в вакцинах было в пределах от
0,9±0,3до 833,3±211,8 МЕ/мл. Наибольшее количество IL-6 выявлено в антирабической вакцине, изготовленной на культуре клеток ПСХ (833,3±211,8 МЕ/мл). Наименьшее содержание IL-6 установлено в вакцине против гепатита А, изготовленной на основе клеточной линии 4647 (0,9±0,3 МЕ/мл).
Наиболее высокая концентрация TNF-a выявлена в полиомиелитной вакцине, изготовленной на клеточной линии VERO (2830±30 пкг/мл). В полиомиелитной вакцине, изготовленной на культуре клеток ПЗМ, а также в коревой вакцине и вакцине против гепатита А содержание TNF-a было в преде-
Табл.1. СОДЕРЖАНИЕ ЦИТОКИНОВ В ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИНАХ
Название вакцины и субстрата, на котором она получена Концентрация цитокинов
IL-1a (пкг/мл) IL-6 (МЕ/мл) TNF-p (пкг/мл)
Антирабическая вакцина.
Клетки почек н/о 833,3 + 211,8 0
сирийских хомяков (ПСХ) (410 - 1060)
Полиомиелитная вакцина.
Клетки почек 26,0 ± 4,0 62,0 ± 13,3 779,0 ± 96,0
зеленых мартышек (ПЗМ) (19 - 55) (44 - 88) (380 - 1280)
Полиомиелитная вакцина. 15,0 ± 4,0 2830,0 ± 30,0
Клеточная линия VERO 0 (11 - 19) (2800 - 2860)
Коревая вакцина (экспериментальная). 27,0 ± 8,0 71,5 ± 32,1 600,0 ± 79,0
Клеточная линия L-68 (19 - 35) (39 - 103) (520 - 680)
Вакцина против гепатита А
(экспериментальная). 130,8 ± 12,8 0,9 ± 0,3 575,0 ± 39,0
Клеточная линия 4647 (108-165) (0,4- 1,5) (500 - 680)
лах 575-779 пкг/мл. В антирабической вакцине TNF-а отсутствовал.
С целью выяснения источника появления цито-кинов в противовирусных вакцинах была изучена спонтанная и индуцированная вирусом полиомиелита 1,2, 3 типов выработка цитокинов (IL-1(3, IL-6, TNF-a) различными клеточными субстратами, используемыми для изготовления вакцин.
Супернатанты клеточных культур, используемых при изготовлении исследуемых вакцин (культуры клеток ПЗМ, 4647, VERO), без дополнительной стимуляции клеток не содержали указанных цитокинов. Исключение составляют диплоидный клеточный штамм Л-68, который спонтанно продуцировал небольшое количество IL-6, и диплоидный клеточный штамм М-22, спонтанно продуцирующий IL-6 и TNF-a (таблица 2). Как видно из таблицы, под воздействием вируса полиомиелита исследуемые виды клеточных культур приобретали способность продуцировать цитокины. Выявлена зависимость выработки цитокинов от типа вируса. Под влиянием вируса полиомиелита 1 типа наблюдалась наибольшая выработка TNF-a всеми исследуемыми клеточными культурами. Под влиянием вируса полиомиелита 2 типа установлена наибольшая продукция IL-1P клеточной линией 4647 и IL-6 - культурой клеток М-
22. Вирус полиомиелита 3 типа индуцировал культуры клеток к выработке меньшего количества IL-6 и TNF-a по сравнению с вирусом полиомиелита 1 и 2 типа и не стимулировал выработку IL-lp.
Таким образом, установлено, что вакцины, изготовленные на основе клеток млекопитающих, содержат ряд провоспалительных цитокинов, набор и концентрация которых зависят от вида вакцины. Наибольший уровень IL-ip содержится в вакцине против гепатита A, IL-6 - в антирабической вакцине, TNF-a - в полиомиелитной вакцине, изготовленной на клеточной линии VERO. Концентрация цитокинов в различных вакцинах варьируется от серии к серии. Спонтанная продукция IL-ip, IL-6 и TNF-a изученными клеточными субстратами, за исключением диплоидных клеточных штаммов М-22 и Л-68, не установлена. Синтез цитокинов наблюдается при антигенной стимуляции клеточных культур вирусом полиомиелита. Продукция цитокинов зависит от клеточной линии и типа вируса, более выраженный эффект наблюдается под воздействием вируса полиомиелита 1 и 2 типов. Определение высокоактивных цитокинов в препаратах, при изготовлении которых используются культуры клеток эукариотов, является одним из новых направлений в вакцинологии. Изучение спонтанной и антигениндуцированной
Табл.2. УРОВЕНЬ СИНТЕЗА ЦИТОКИНОВ (СПОНТАННЫЙ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ ВИРУСОМ ПОЛИОМИЕЛИТА 1, 2, 3 ТИПОВ) КЛЕТКАМИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Название субстрата Концентрация цитокинов
IL-1a (пкг/мл) IL-6 (МЕ/мл) TNF-р (пкг/мл)
Клетки почек зеленых мартышек - без стимуляции 0 0 0
- стимуляция - 1 типом 34,5 ± 6,3 12,0 501,7 ± 208,0
- 3 типом 0 2,3 95,0 ± 65,0
Клетки линии М-22
- без стимуляции 0 0,3 90,0
- стимуляция - 1 типом 0 66,1 973,3 ± 279,6
- 2 типом 0 156,4 545,0 ± 186,0
- 3 типом 0 1,8 405,6 + 167,1
Клетки линии 4647
- без стимуляции 0 н/о 0
- стимуляция - 1 типом 36,0 н/о 140,0
- 2 типом 102,0 н/о 135,0 + 5,0
- 3 типом 0 н/о 40,0
Клетки линии L-68
- без стимуляции 0 н/о 0
Клетки линии VERO
- без стимуляции 0 н/о 0
продукции цитокинов на этапе культивирования клеточных культур, используемых для производства коммерческих вакцин, дает возможность прогнозировать присутствие цитокинов в конечном продукте. Это предопределяет необходимость изучения влияния сопутствующих цитокинов на свойства готового продукта. Изучение синтеза цитокинов экспериментальными клеточными культурами может быть одним из критериев выбора клеточного субстрата для производства культуральных вакцин.
Цитокины как адьюванты вакцин
Поиск способов усиления иммуногенных свойств вакцин очень актуален для повышения эффективности вакцинации [10, 11, 12, 13]. Использование цитокинов, регулирующих в организме каскад иммунных реакций на антигенное воздействие в качестве потенциальных иммуноадьювантов было ограничено из-за сложности их получения из природных источников в количествах, необходимых для экспериментальных и клинических исследований. Получение рекомбинантных цитокинов человека позволило приступить к решению этой задачи.
Экспериментальные исследования по изучению иммуноадыовантных свойств цитокинов проведены на моделях вакцинации животных против гепатита А, гепатита В, клещевого энцефалита и бешенства. В работе использованы следующие вакцины - вакцина против гепатита А культуральная концентрированная очищенная инактивированная адсорбированная жидкая “Геп-А-ин-ВАК” (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор”); коныогат вакцины против гепатита А “Геп-А-ин-Вак” (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ “Вектор”) с полиоксидонием, содержащий 25 нг антигена вируса гепатита А (АГ ВГА) и 2,5 мкг полиоксидония; вакцина против гепатита В рекомбинантная (НПО “Вирион” г. Томск), приготовленная из полуфабриката вакцины НеЬегЫоуас, Куба; вакцина клещевого энцефалита (ВКЭ) культуральная концентрированная очищенная инактивированная сухая (ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова); культуральная антира-бическая вакцина концентрированная очищенная методом ультрафильтрации (КОКАВ) инактивированная сухая (ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова).
Эксперименты проведены на мышах линии ВАЬВ/с, мышах линии СВА, беспородных белых мышах весом 14-18 г и морских свинках весом 250-350 г.
При вакцинации экспериментальных животных дозы и схемы введения вакцин соответствовали принципам определения иммуногенной активности соответствующих вакцин при оценке их качества.
Эффект воздействия исследуемых препаратов в качестве иммуноадьювантов на иммуногенную активность вакцин оценивали по изменению иммунизирующей дозы вакцины (ИД50), показателю серо-
конверсии, уровню титров специфических антител и, в случае использования вакцины против бешенства, по уровню выживаемости животных, инфицированных вирусом бешенства.
Адъювантное действие гЬТОТ-а и полиоксидония на иммуногенную активность вакцины против гепатита А в экспериментах на мышах. Проведены исследования по изучению иммуногенной активности коныогата антигена вируса гепатита А (АГ ВГА) и полиоксидония (ПО) с добавлением лекарственной формы ПО в различных концентрациях, а также иммуногенной активности указанных выше компонентов в сочетании с препаратом рекомбинантного фактора некроза опухолей - альфа человека (гЬТЫР-а). Для получения коньюгированного препарата АГ ВГА с ПО был использован полуфабрикат одной из коммерческих серий вакцины против гепатита А “Геп-А-ин-Вак” (без содержания гидроокиси алюминия). В ГНЦ-Институте иммунологии на основе указанного полуфабриката были приготовлены три экспериментальные серии препарата, одна прививочная доза которых (25 нг АГ ВГА) содержала различные дозы лекарственной формы ПО (1000, 200 или 40 мкг).
В экспериментах использован гЬТКР-а (лекарственная форма “Альнорин” с активностью 1*106
0 Ед/мл). Указанный препарат вводили подкожно в дозе 100 Ед/мышь в объеме 0,5 мл одновременно с полуфабрикатом вакцины.
Иммуногенную активность каждой из трех серий коньюгированного препарата и полуфабрикат вакцины без ПО исследовали на мышах, используя для введения животным как неразведенные формы препарата, так и его разведения (1/2, 1/4, 1/8, 1/16).
Сыворотки от опытных и контрольных групп мышей были получены через 28 дней от начала иммунизации и исследованы на наличие суммарных антител к АГ ВГА и выявление титров антител к АГ ВГА с помощью коммерческих тест-систем “Векто-геп-А-антитела” (производство “Вектор-Майстар”, г. Новосибирск).
Исследования адьювантных свойств гЬТЫР-а и ПО при оценке иммуногенной активности коныогата на экспериментальных животных выявили дозозависимый эффект лекарственной формы ПО. В группах животных, получивших гЬТКБ-а одновременно с коньюгатом вакцины с добавлением лекарственной формы ПО в оптимальной дозе (200 мкг), отмечено усиление иммунного ответа на АГ ВГА по сравнению с животными без введения гЬТМР-а. При этом ИД50 составила 2,0 нг АГ ВГА в первой группе и 2,65 нг АГ ВГА во второй группе (снижение ИД50 составляет 24,6%). При сопоставлении групп животных, вакцинированных полуфабрикатом вакцины в сочетании с гЬТЫР-а и только полуфабрикатом вакцины, установлено снижение ИД_0 на 45%.
Оценка уровня титров специфических антител к АГ ВГА в исследуемых группах животных показала, что при введении гЬТЫР-а в сочетании с полуфабрикатом вакцины наблюдается стимуляция выработки антител по сравнению с животными, иммунизированными только полуфабрикатом вакцины. Так, у животных, иммунизированных вакциной в дозе 12,5 нг АГ ВГА с тЬТЫБ-а, в 40% случаев выявляются антитела в титре 1:160 и выше, тогда как в контрольной группе - у всех животных в титре 1:10. Аналогичная закономерность наблюдается и при использовании разведений вакцины.
Наиболее выраженный эффект ПО на формирование специфических антител наблюдался при использовании его в дозе 200 мкг/мышь. Указанный дозозависимый эффект отмечался и при сочетанном применении ПО и гЬТЫР-а. В группах животных, вакцинированных коныогатом вакцины (цельной и разведенной 1 /2) в сочетании с гЬТЫР-а и ПО в дозе 200 мкг/мышь титры антител, соответствующие 1:160 и выше, выявлялись в 50,0-62,5% случаев.
Следует отметить, что наиболее выраженный стимулирующий эффект препарата тЬТЫБ-а проявлялся при вакцинации животных малыми дозами конъюгированной вакцины (3,12 и 1,56 нг АГ ВГА) и при сочетанном использовании его с малой дозой ПО (40 мкг/мышь).
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что лекарственная форма гЬТКР-а и ПО оказывают стимулирующее влияние на иммуногенную активность вакцины “Геп-А-ин-Вак”, индуцируя синтез специфических антител к АГ ВГА.
Адъювантное действие цитокинов на иммуногенную активность вакцины против гепатита А в экспериментах на морских свинках. Влияние препаратов цитокинов на иммуногенность вакцины против гепатита А (“Геп-А-ин-Вак”) изучали в экспериментах на морских свинках. Животным одновременно с “Геп-А-ин-Вак” вводили исследуемые препараты цитокинов, иммунизацию проводили подкожно трехкратно с интервалом в две недели. Дозы цитокинов были выбраны на основании данных литературы и результатов собственных предварительных исследований и составили для гЬТМР-а - 1 мкг, или 1000 Рд, 1Ь-1(3 - 1 мкг, гЫРЫ-у - 50000 Ед на морскую свинку в объеме 0,5 мл. Контрольным группам животных вводили “Геп-А-ин-Вак” без цитокинов.
В экспериментах использовали три серии вакцины Геп-А-ин-ВАК, различающиеся по содержанию АГ ВГА. В первых двух сериях вакцины содержание АГ ВГА составляло 60-70 ед (по данным иммунофер-ментного анализа - ИФА), в третьей - 120 ед.
Результаты исследований оценивали по титру специфических антител к ВГА и по числу сероположительных животных. Титр специфических антител (АТ) к вирусу гепатита А определяли с помощью ИФА. Сероположительными считались сыворотки животных, титр антител к АГ ВГА которых был больше 1:10. Эффективность иммунизации оценивали в динамике на 14-е сутки после 2-го и 3-го введений препаратов.
Как видно из таблицы 3, после 2-кратного введения препаратов (I срок обследования) более высокий уровень титров АТ отмечен в группе морских свинок, иммунизированных “Геп-А-ин-Вак”, содер-
Табл. 3. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ЦИТОКИНОВ НА ИММУНОГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ ВАКЦИНЫ “Геп-А-ин-Вак” В ЭКСПЕРИМЕНТАХ НА МОРСКИХ СВИНКАХ
Группы Сроки Средняя геом. Средний Частота
серопол. обследования титров АТ титр животных в %
животных животных (Х1д 7 + Пд) АТ (Р ± Эр)
Геп-А-ин-ВАК
60-70 ИФА ед.
(контроль) I 0,62 ± 0,24 1:4 41,7 ± 14,8
(п = 12) II 1,32 ± 0,27 1:21 75,0 ±13,1
Геп-А-ин-ВАК
+ гШ^-а I 1,49 ± 0,23* 1:31 88,9 ± 11,1*
(п = 9) II 2,42 ± 0,20* 1:261 100
Геп-А-ин-ВАК
+ мир I 0,98 ± 0,28 1:10 66,7 ± 16,4
(п = 9) II 2,15 ± 0,28* 1:140 100
Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе,
I срок обследования - 14-е сутки после 2-кратного введения препаратов,
II срок обследования - 14-е сутки после 3-кратного введения препаратов.
жащей 60-70 ИФА ед в сочетании с гЬТЫР-а. Средние геометрические титры АТ в этой группе животных превышали показатели в контроле в 7,8 раза (1:31 и 1:4 соответственно). Частота сероположительных животных после 2-кратного введения препаратов в группах с гИТОТ-а статистически достоверно (р<0,05) отличалась от аналогичных показателей в контрольной группе (88,9% и 41,7% соответственно). Уровни титров антител и частота сероположительных животных в группе морских свинок, иммунизированных вакциной в сочетании с гЫЬ-1Р, были выше по сравнению с контрольной группой, однако различия сравниваемых показателей были статистически недостоверны.
После 3-кратного введения препаратов (II срок обследования) увеличение титров АТ в группе с АТОТ-абыло в 12,4 раза, в группе с гЫЬ-1(3 - в 7 раз выше по сравнению с показателями в контроле (1:261, 1:140 и 1:21 соответственно). Частота сероположительных животных после 3-го введения препаратов в контрольной группе составила 75,0%, а в группах животных, получивших вместе с вакциной препарат гИТОТ-а или гЫЬ-1Р, достигла 100% .
Адъювантное действие гЬТТЧР-Р и ридостина на иммуногенные свойства вакцины против гепатита В. Влияние исследуемых препаратов на иммуногенную активность вакцины против гепатита В оценивали в экспериментах на белых мышах по уровню специфических антител к вирусу гепатита В (НВэ Ag) и по числу сероположительных животных.
Вакцина в дозах 2,5, 1,25, 0,6, 0,3, 0,15 мкг/мышь вводилась внутрибрюшинно однократно. Контрольные животные получали только указанные дозы вакцины. Опытным животным 1-й группы вводили дозы вакцины в сочетании с препаратом рекомбинантного фактора некроза опухолей - бета человека (тЬТЫБ-Р) из расчета 50 ед/мышь; животным 2-й
группы - дозы вакцины в сочетании с препаратом ридостин из расчета 50 мкг/мышь. Через 30 суток индивидуально у каждого животного была получена сыворотка крови. Уровень специфических антител против АГ ВГВ определяли с помощью иммуно-ферментной тест-системы “Гепаностика” (“Органон техника”).
Адыовантные свойства гЬТ№-(3 и ридостина проявлялись при их сочетании с наиболее низкой дозой вакцины (содержание АГ ВГВ - 0,15 мкг/мышь). В указанных опытных группах у 30% экспериментальных животных наблюдалось формирование антител к АГ ВГВ, в то время как в контрольной группе животных, иммунизированных только вакциной в указанной выше дозе, антитела не выявлялись.
Вакцина без иммуноадыовантов вызывала образование антител у 50% мышей в дозе 1,25 мкг. Аналогичные показатели были отмечены и в опытных группах животных, иммунизированных вакциной с препаратами гЬТКГ-(3 и ридостин.
Влияние цитокинов на уровень протективного иммунитета против бешенства. В первой серии экспериментов изучали профилактическое использование культуральной антирабической вакцины, концентрированной и очищенной методом ультрафильтрации (КОКАВ) в сочетании с цитокинами, при котором указанные препараты вводили мышам до их заражения фиксированным вирусом бешенства, штамм СУБ. Эффективность вакцинации оценивали по проценту выживаемости животных и показателю предельно допустимого разведения вакцины, обеспечивающего 50% выживаемость животных в абсолютных значениях (КР50) и значениях данного показателя в логарифмах (^ КР50), а также по уровню титров вируснейтрализующих антител.
Результаты проведенных исследований приведены в таблице 4.
Табл.4. ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСА ЦИТОКИНОВ (гЫЫР, гЫ1.-2, гШ^-сс) НА ИММУННЫЙ ОТВЕТ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВВЕДЕНИИ КОКАВ
Группы животных КР50 Разведения вакцины Число животных Процент выживших животных 1дКР50
КОКАВ 1:50 4/10 40,00 1,70
1:50 1:500 0/13 0
(контроль) 1:5000 2/12 16,66
КОКАВ + 1:365 1:50 10/12 83.34* 2.56
гЫМР + гїііі_-2+ 1:500 6/13 46,15*
гШР-а 1:5000 1/13 7,69
Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе мышей; числитель -число выживших животных, знаменатель - общее количество животных; показатель КР50 - величина предельно допустимого разведения вакцины, обеспечивающего 50% выживаемость животных.
Как видно из таблицы, комбинация цитокинов (гЫЬ-1|3, гЫЬ-2, ЛТ^-а), использованная в качестве адыованта при иммунизации животных вакциной КОКАВ, способствует повышению ее эффективности. Отмечена большая выживаемость экспериментальных животных при их заражении вирусом бешенства по сравнению с контрольной группой. Показатель КР5() в опытной группе, получившей вместе с вакциной комбинацию цитокинов, увеличился в 7,3 раза по сравнению с контрольной группой. Процент выживших животных, иммунизированных вакциной в разведении 1:50 и 1:500, в опытной группе статистически достоверно (р<0,05) отличался от показателей контрольной группы.
В следующей серии экспериментов животные были иммунизированы вакциной КОКАВ в сочетании с цитокинами (гЫЬ-1(3, гЬТОТ) или препаратами, условно отнесенными нами к цитокинам (тимо-зин-а! человека рекомбинантный - гЬТ-а1, гибридный белок “неотим”, состоящий из ТИР-а и тимози-на-а1 -Та-Т№-Та).
Результаты проведенных исследований показали, что использование в качестве адыовантов гЫЬ-1[3 или гЬТОТ-а при иммунизации животных вакциной КОКАВ способствует повышению ее эффективности. Отмечено увеличение выживаемости экспериментальных животных в указанных группах. Процент выживших мышей в группе с гЫЬ-1(3 при использовании вакцины в разведениях 1:25 и 1:125 был в 1,6 раза выше аналогичных показателей в контроле. В группе с гЬТКР-а при использовании вакцины в разведении 1:25 - в 1,7 раза выше показателя контрольной группы мышей. Установлено, что в группах животных, получивших вместе с вакциной Н'ГШР-а или гЫЬ-1Р, показатель КР50 увеличился в 1,2-1,8 раза по сравнению с контрольной группой. В группах животных, получивших одновременно с вакциной один из препаратов (гЬТ-а1 или Та-Т№-Та), показатель КР50 остался на уровне контроля (< 1:25).
При введении вакцины в разведении 1:25 в сочетании с цитокинами все исследуемые препараты оказывали стимулирующее влияние на процесс антите-лообразования, способствуя увеличению титров ви-руснейтрализующих антител в 1,2-7,0 раз. При этом наиболее эффективными были препараты гЫЬ-1(3 и ЛТОТ-а (увеличение титров АТ в 2,8-7,0 раз соответственно). При использовании вакцины в разведении 1:125 в группах с гЬТОТ-а и гЫЬ-1(3 титры АТ были в 2,5-3,0 раза выше уровня контрольной группы, тогда как в группах с Та-ТЫР-Та и гЬТ-а1 - на уровне контроля. При большем разведении вакцины стимулирующего влияния цитокинов на антите-лообразование не наблюдали.
Таким образом, результаты проведенных исследований по изучению адьювантных свойств цитокинов при иммунизации экспериментальных животных показали, что исследуемые препараты способ-
ны повышать протективный эффект культуральной антирабической вакцины (КОКАВ), оцениваемый по уровню резистентности беспородных белых мышей к заражению фиксированным вирусом бешенства. Развитие иммунного ответа у животных при использовании антирабической вакцины в сочетании с отдельными цитокинами или смесью цитокинов сопровождалось формированием высокого уровня вируснейтрализующих антител.
Адъювантное действие цитокинов на иммуно-генную активность вакцины против клещевого энцефалита. При изучении влияния цитокинов на им-мупогенную активность вакцины против клещевого энцефалита (ВКЭ) эффективность вакцинации оценивали по трем показателям - проценту выживших животных; величине предельно допустимого разведения вакцины, обеспечивающего 50% выживаемость животных после заражения вирусом клещевого энцефалита, рассчитанной по методу Reed-Muench (ПР_0); величине минимальной иммунизирующей дозы ВКЭ, защищающей 50% животных (МИД50).
Результаты исследований представлены в таблице 5. Как видно из таблицы, использование в качестве адыовантов препаратов rhTNF-a или иммунофана оказывало стимулирующее действие на имму-ногенность ВКЭ. При этом показатели lgnP50 в этих группах животных достоверно (р<0,05) отличались от аналогичных показателей в контрольной группе. Следует отметить, что rhTNF-a был более эффективен при использовании вакцины в разведении 1:32, а иммунофан - 1:32 и 1:100.
Введение ВКЭ в сочетании с rhIL-lp или rhIL-2 приводило к усилению иммуногенной активности вакцины, rhTNF-a - практически не изменяло им-муногенную активность вакцины. Следует отметить, что более выраженный стимулирующий эффект rhIL-1 (3 наблюдался при использовании вакцины в разведении 1:100 и 1:320, rhIL-2 - вакцины в разведении 1:32 и 1:320, а rhIFN-a - 1:10.
Введение вместе с вакциной гибридного белка “неотим” способствовало усилению иммуногеннос-ти ВКЭ. Введение тимозина-al или комбинации, состоящей из rhTNF-a и rhlFN-y, приводило к снижению, а введение rhlFN-y не оказало заметного влияния на иммуногенность ВКЭ. Препарат Ta-TNF-Ta в сочетании с ВКЭ повышал количество выживших мышей при всех используемых дозах вакцины.
Для сопоставления результатов, полученных в различных экспериментах, один из показателей им-муногенности вакцины (ПРГ>0) анализировали в относительных единицах. С этой целью показатели ПР50 всех контрольных групп животных, получивших ВКЭ без цитокинов, принимали за 100%, а показатели ПР50 в опытных группах животных рассчитывали относительно контрольных групп. Установлено, что наиболее эффективными иммуноадьюван-
Табл. 5. ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА (ВКЭ) ПРИ ИММУНИЗАЦИИ МЫШЕЙ ЛИНИИ ВАЬВ/С ВАКЦИНОЙ В СОЧЕТАНИИ С ЦИТОКИНАМИ (гМТ№-а ИЛИ ИММУНОФАНОМ)
Группы животных 1дПР50+ Ид пря МИДл
ВКЭ (контроль) 1,69 ± 0,11 1 49 0,0102
ВКЭ + Т^-сс 1,76 ± 0,09* 1 58 0,0086
ВКЭ + иммунофан 1,88 ± 0,02* 1 76 0,0066
ВКЭ (контроль) 1,77 ± 0,07 1 59 0,0085
ВКЭ + 11.-1 (3 1,89 ± 0,06* 1 78 0,0064
ВКЭ + 11.-2 1,83 ± 0,03 1 68 0,0074
ВКЭ + 1ПМ-а 1,73 ± 0,06 1 54 0,0093
ВКЭ (контроль) 1,88 ± 0,08 1 76 0,0066
ВКЭ + рчТ-а1 1,79 + 0,09* 1 62 0,0081
ВКЭ + Та-Т^-Та 2,08 ± 0,02* 1 120 0,0043
ВКЭ + ^-у 1,87 + 0,08 1 74 0,0067
ВКЭ + ^-у + Ж-а 1,69 ± 0,03* 1 49 0,0103
Примечание: * - различие достоверно (р<0,05) по отношению к контрольной группе мышей.
тами при вакцинации животных против клещевого энцефалита были иммунофан и гибридный белок “неотим”, увеличивающие иммуногенность ВКЭ на 55-58%. Введение мышам препаратов - гЫЬ-1|3, гЫЬ-
2 или тЬТЫБ-а усиливало иммуногенность ВКЭ на 15-32%. Аналогичный эффект наблюдался при сочетанном использовании указанных цитокинов. Следует отметить, что комбинация цитокинов гЬТКР-а и гЫРЫ-у, оказывала подавляющее действие на иммуногенность ВКЭ, в то время как индивидуальное использование тЬТОТ-а приводило к повышению иммуногенности ВКЭ, а гЬИЧ-у - к отсутствию заметного влияния на показатель ПР50. Отсутствие эффекта отмечено также при использовании вместе с ВКЭ гЫРМ-а, а супрессорное действие - при введении тимозина- а1, введение которого снижало иммуногенность ВКЭ на 18%.
Таким образом, при вакцинации мышей линии ВАЬВ/с против клещевого энцефалита наблюдается статистически достоверное увеличение иммуногенности ВКЭ при введении животным рекомбинантных препаратов цитокинов - гЫЬ-1(3, гЬТЫР-а, а также гибридного белка “неотим” и иммунофана одновременно с вакциной. Комбинированное использование гЫЬ-1(3, гЫЬ-2, гЬТЫР-а и иммунофана также повышало иммуногенность вакцины против клещевого энцефалита.
Проведенные исследования по изучению адъювантных свойств цитокинов на ряде экспериментальных моделей свидетельствуют о стимулирующем действии некоторых цитокинов на иммуноген-ную активность вакцин против бешенства, клещевого энцефалита, гепатита А и гепатита В. Наиболее выраженными иммуностимулирующими свойствами обладают рекомбинантные цитокины - ТЫР-
а, 1Ь-1(3 и синтетический гексапептид - иммунофан. Указанные цитокины при индивидуальном или со-
четанном использовании их с 1Ь-2 или 1РЫ-у усиливают иммуногенность вакцины против гепатита А, повышая уровень титров антител к АГ ВГА у морских свинок в 2,5-13,6 раза по сравнению с контрольной группой животных, иммунизированных одной вакциной, и обеспечивая 100% сероконвер-сию. Использование цитокинов при вакцинации экспериментальных животных против бешенства повышает протективный эффект антирабической вакцины. Наиболее выраженная защита наблюдается при применении вместе с вакциной комбинации цитокинов (ТЫР-а, 1Ь-113, 1Ь-2), которая увеличивает показатель выживаемости животных в 7,3 раза. При этом развитие иммунного ответа сопровождается усилением специфического и неспецифического клеточного иммунитета и высоким уровнем вируснейтрализующих антител. При клещевом энцефалите наиболее высокий уровень резистентности мышей к заражению вирулентным штаммом вируса клещевого энцефалита наблюдается при использовании с вакциной вышеуказанных цитокинов и препарата иммунофан. Усиление иммуногенной активности вакцины в 1,5 раза на фоне введения цитокинов сопровождается более высокими показателями специфического клеточного иммунного ответа.
В заключение следует отметить, что присутствие высокоактивных цитокинов в вакцинных препаратах определяет необходимость изучения биологической значимости их присутствия и целесообразности стандартизации и контроля этих препаратов по содержанию в них цитокинов. Использование цитокинов с целью регуляции вакцинального процесса является перспективным направлением современной иммунологии. Цитокины как иммуно-адьюванты нового поколения могут избирательно усиливать защитные механизмы иммунитета, вы-
зывая развитие тех форм иммунного ответа, которые необходимы организму для защиты от конкретного возбудителя заболевания. Использование цитокинов в качестве адьювантов должно способствовать созданию более эффективной и надежной защиты при иммунизации и открыть новые подходы к изучению и управлению вакцинальным процессом.
Список литературы
1. Авдеева Ж.И., Акользина C.E., Алпатова H.A., Медуницын Н.В. Оптимизация вакцинального процесса с помощью цитокинов // Russian Journal of Immunol. - 1999. -V.4. - Suppl.l. - P.54.
2. Акользина С.E. Цитокины в вакцинах и их адь-ювантное действие // Автореф. канд. дисс., - 1996.
3. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Воробьев A.A. // Эндогенные иммуномодуляторы. - СПб: Гиппократ, - 1992. - 256 с.
4. Медуницын Н.В., Вакцинология. М. Триада-X. -1999. -272 с.
5. Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И., Акользина C.E., Алпатова H.A. и др. Присутствие цитокинов в иммунобиологических препаратах. // Иммунология,
- 1997, - №2, - с. 42-45.
6. Медуницын Н.В., Кузнецов В.П., Крылов O.P., Авдеева Ж.И. и др. Сопутствующая цитокиновая активность в препаратах интерферона // Иммунология, - 1987, - №4, -с.34-40.
7. Петров Р.В., Хаитов P.M. Вакцины нового поколения на основе синтетических полиионов: история создания, феноменология и механизм действия, внедрение в практику // Иммунология. -1998. - №5. -4-11.
8. Титов Л.П. Цитокины // Медицина. - 1998. -№2. -30-32.
9. Ярилин A.A. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология. -1997. -N5. -7-14.
10. Ярилин A.A. Основы иммунологии // М. “Медицина” -1999. - 605 с.
11. Abbas A.K., Lichtman А.Н., Pober J.S. // Cellular and molecular immunology. - Philadelphia. - 1991. -417p.
12. Andrews A.E., Lofthouse S.A., Bowles V.M., Brandon M.R., Nash A.D. Production and in vivo use of
recombinant ovine IL-lb as an immunological adjuvant // Vaccine. - 1994. - Vol.12. - N.l. - P.14-22.
13. Armitage J.O. Emerging applications of recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor // Blood. -1998. -92. -N12. -4491-4508.
14. Bonnem E.M., Chaudry I.A., Stupak E. Use of GM-CSF as a vaccine adjuvant: Пат. 5679356 США, МПК6 A61K 38/19, A61K 39/145.
15. Cao M., Sasaki O., Yamada A., Imanishi J. Enhancement of the protective effect of inactivated influenza virus vaccine by cytokines // Vaccine. -1992.
- Vol.10. - P.238-242.
16. Doyle M.V., Nevell A.D., Nunberg J.H., White T.J., Anderson G.A. Human IL-2 as a vaccine adjuvant // Pat. 5100664, USA, MKI5, A61K37/02, Cetus Corp.
- N.374602. - 1992.
17. Fradelizi D., Les cytokines: Facteurs solubles de la communication intercellulaaire // Med. trop. -1998. -V.58. -N 4. - P.427-432.
18. Gearing A.J.H., Cartwright J.E., Bird C.R. et al. Demonstration of cytokines in biological medicines produced in mammalian cell lines. // Lancet, 1989, vol.28, p.1011-1012.
19. Gearing A.J.H., Leung H., Bird C.R. et al. Inflammatory cytokines IL-1, TNF and IL-6 in preparations of monoclonal antibodies. // Hybridoma, 1989, vol.8, N.3, p.361-367.
20. Heath A.W., Playfaire J.H.L. Cytokines as immunological adjuvants //Vaccine. - 1992. - Vol.10. -N.7. - P.427-434.
21. Paul W.E., Seder R.A. Lymphocyte responses and cytokines // Cell. - 1994. - Vol.76. - N.2. - P.241-251.
22. Sehgal P.B., Helfgott D.C., Santhanam U. et al. Regulation of the acute phase and immune responses in viral disease. Enhanced expression of the B2-interferon (hepatocyte stimulating factor) interleukine-6 gene in virus-infected human fibroblasts. J. Exp. Med., 1988, vol. 167, No.6, p.1951-1956.
23. Senda T. Structure and function of cytokines and their receptors. // Protein, Nucb Acid and Enzyme. -1999. -V.44. - N4. -P.318-324
24. Van Damme J., Schaafsma M.R., Fibble W.E. et al. Simultaneous production of interleukin-6, interferon-в and colony-stimulating activity by fibroblasts after viral and bacterial infection. // Eur.J.Immunol., 1989, vol.19, p.163-168.
поступила в редакцию 15.05.2001 принята к печати 09.07.2001
