CC BY
38
polymorpha yeast strain - producer of mutant hepatitis B virus surface antigen (versions). Patent RU № 2586513 C1.; 2016. (in Russian)
16. Bazhenov A.I., Konopleva M.V., El'gort D.A., Fel'dsherova A.A., Khats Yu.S., Godkov M.A., et al. Algorithm of serologic screening and assessment of prevalence of serologically meaningful mutations of HBsAg in hepatitis B virus carriers. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2007; (6): 30-7. (in Russian)
17. Tijssen P., Kurstak E. Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase and active peroxidase-antibody conjugates enzyme immunoassays. Anal. Biochem. 1984; 136(2): 451-7.
18. Krymskiy M.A., Borisov I.A., Yakovlev M.S., Mel'nikov V.A., Suslov A.P., Semenenko T.A., et al. A method of assessing the level of antibodies specific to various HBsAg of HBV. Patent RF № 2616236C1; 2017. (in Russian)
19. Bellecave P., Gouttenoire J., Gajer M., Brass V., Koutsoudakis G., Blum H.E., et al. Hepatitis B and C virus coinfection: a novel model system reveals the absence of direct viral interference. Hepatology. 2009; 50(1): 46-55.
Поступила 18.02.17 Принята в печать 27.02.17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДк 616.98:578.833.26]-078.33-092.9
БахваловаВ.Н.1, ПановВ.В.1, Потапова О.Ф.1, Морозова О.В.2,3
цитокины и антитела при экспериментальном заражении диких
И ЛАБОРАТОРНЫХ ГРЫЗУНОВ (RODENTIA) ВИРУСОМ кЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
1 ФГБУН «Институт систематики и экологии животных» Сибирского отделения РАН, 630091, г. Новосибирск;
2 Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва;
3 ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» ФМБА России, 119435, г. Москва
Моделирование персистенции проводили посредством заражения диких грызунов красной полевки Myo-des rutilus (Pallas, 1779) и полевой мыши Apodemus agrarius (Pallas, 1771), а также лабораторных мышей вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) в составе клещевых суспензий с последующей детекцией вируса, антигемагглютининов и вируснейтрализующих антител к ВКЭ, а также экспрессии генов цитокинов в течение 4 мес. При высоких частотах детекции РНК и антигена Е ВКЭ на протяжении всего периода наблюдений патогенный для лабораторных мышей-сосунков вирус выделяли преимущественно до 8 сут после заражения. На поздних стадиях персистентной инфекции (1—4 мес) частота детекции вирусной РНК у красных полевок и лабораторных мышей оставалась высокой, а у полевых мышей значимо снижалась (p < 0,001). Вирусные нагрузки у диких грызунов достоверно превышали (p < 0,001) значения у лабораторных мышей. Средние частоты экспрессии генов ^2-цитокинов были сходными у M. rutilus (50 ± 8,5%) и A. agrarius (50 ± 9,6%) на протяжении всего периода, но частоты детекции мРНК цитокинов TM-пути после активации транскрипции через 2 сут инфекции и последующего возвращения к исходному уровню различались (p > 0,05) у двух видов диких грызунов, составляя 22,2 ± 5 и 38,1 ± 7,6% соответственно. При этом доля особей с мРНК интерлейкина-^ была значимо (p < 0,05) больше у A. agrarius, чем у M. rutilus, что, возможно, обусловливало пониженные частоты вирусоносительства среди полевых мышей по сравнению с красными полевками. Ан-тигемагглютинины и вируснейтрализующие антитела у диких грызунов были выявлены через 30 сут после заражения и оставались в детектируемых количествах до 4 мес. Таким образом, персистенция ВКЭ у мелких грызунов сопровождалась детекцией патогенного вируса в ранний период, вирусной РНК и антигена Е в течение 4 мес с большими вирусными нагрузками у диких грызунов, превышающими значения у лабораторных мышей. Изменения экспрессии генов провоспалительных цитокинов и наличие вирусспецифических антител свидетельствовали об иммуномодулировании как возможном механизме персистенции.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита; красная полевка Myodes rutilus (Pallas, 1779); полевая мышь Apodemus agrarius (Pallas, 1771); цитокины; вируснейтрализующие антитела и антигемаг-глютинины.
Для цитирования: Бахвалова В.Н., Панов В.В., Потапова О.Ф., Морозова О.В. Цитокины и антитела при экспериментальном заражении диких и лабораторных мелких грызунов (Rodentia) вирусом клещевого энцефалита. Вопросы вирусологии. 2017; 62(4): 186-192.
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-62-4-186-192
Bakhvalova V.N.1, Panov V.V.1, Potapova O.F.1, Morozova O.V.23 CYTOKINES AND ANTIBODIES IN EXPERIMENTAL INFECTION OF WILD AND LABORATORY RODENTS (RODENTIA) WITH TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS
1 Institute of Systematics and Ecology of Animals, Novosibirsk, 630091, Russian Federation;
2 D.I. Ivanovsky Institute of Virology «Federal Research Center of Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya», Moscow, 123098, Russian Federation;
3 Federal Research Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Moscow, 119435, Russian Federation
Для корреспонденции: Морозова Ольга Владимировна, д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии отдела арбовирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва. E-mail: omorozova2010@gmail.com
оригинальные исследования
Persistence modeling was performed by means of infection of the wild rodents: northern red-backed vole Myodes rutilus (Pallas, 1779) and striped field mouse Apodemus agrarius (Pallas, 1771), as well as of laboratory mice with the tick-borne encephalitis virus (TBEV) in tick suspensions with subsequent detection of the TBEV, hemagglutination inhibition and virus-neutralizing antibodies, as well as expression of cytokine genes during 4 months. Detection rate of the TBEV RNA and antigen E remained high during the whole period of observations; however, virus pathogenic for laboratory suckling mice was isolated mainly during a period of 8 days post infection. At the late stages of the persistent infection (1-4 months) the TBEV RNA detection rate in northern red-backed voles and laboratory mice remained high, whereas in striped field mice it significantly declined (p < 0.001). The viral loads were significantly higher (p < 0.001) in the wild rodents compared to the laboratory mice. Average frequencies of Th2 cytokine gene expression were similar for M. rutilus (50.0 ± 8.5%) and A. agrarius (50.0 ± 9.6%) during the whole period, but Th1 cytokine mRNA detection rate after transcription activation in 2 days post infection and subsequent return to the original values were different (22.2 ± 5.0% and 38.1 ± 7.6%, respectively (p > 0.05)). Meanwhile, a part of animals with interleukin 1p mRNA was significantly higher among A. agrarius than among M. rutilus (p < 0.05), which might cause low levels of spontaneous TBEV infection of field mice compared to red voles. Hemagglutination inhibition and virus-neutralizing antibodies were revealed in wild rodents in 30 days post infection and remained at detectable levels during 4 months.
Thus, the TBEV persistence in small rodents was accompanied by the detection of the pathogenic virus in the early period, the viral RNA and antigen E during 4 months with high viral loads in wild animals exceeding the values in laboratory mice. Changes in the proinflammatory cytokine gene expression frequencies and the TBEV-specific antibodies pointed at immunomodulation as the possible mechanism of the TBEV persistence.
Keywords: tick-borne encephalitis virus; Northern red-backed vole Myodes rutilus (Pallas, 1779); striped field mouse Apodemus agrarius (Pallas, 1771); cytokines; virus-neutralizing and hemagglutination inhibition antibodies.
For citation: Bakhvalova V.N., Panov V.V., Potapova O.F., Morozova O.V. Cytokines and antibodies in experimental infection of wild and laboratory rodents (Rodentia) with tick-borne encephalitis virus. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2017; 62(4): 186-192. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2017-62-4-186-192
For correspondence: Olga V. Morozova, D. Sci., leading researcher, Laboratory of immunology, Department of Arboviruses, D.I. Ivanovsky Institute of Virology «Federal Research Center of Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya», Moscow, 123098, Russian Federation. E-mail: omorozova2010@gmail.com Information about authors:
Bakhvalova V. N., http:// orcid.org/0000-0002-3441-1751 Panov V.V., http://orcid.org/0000-0002-9728-2985 Potapova O.F., http://orcid.org/0000-0002-8435-7482
Acknowledgments. This work was financially supported by the Integration programs of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences and Federal programs for Basic Scientific Research 2013-2020 (VI.51.1.5). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 19 January 2017 Accepted 28 February 2017
Введение
Известны 3 способа персистенции вирусов: снижение уровней репликации вирусных геномов и экспрессии вирусных генов с формированием нелитической инфекции; информационные изменения вирусных белков, экспонированных на поверхности вирионов или зараженных клеток; вирусопосредованное модулирование иммунного ответа [1].
Персистенция ВКЭ среди многочисленных и разнообразных эволюционно удаленных позвоночных и беспозвоночных хозяев обеспечивает стабильность всей паразитарной системы. Совпадение сезонных циклов активности и биотопов иксодовых клещей и их прокормителей, врожденная резистентность и специфический иммунитет определяют роли разных видов мелких млекопитающих как прокормителей личинок и нимф клещей, а также резервуарных, индикаторных и случайных хозяев ВКЭ [2, 3]. В отличие от резервуарных хозяев с пожизненным вирусоносительством и доказанной передачей ВКЭ клещам для индикаторных хозяев характерны короткий период виремии с низкими уровнями вирусной репродукции и неспособностью передавать ВКЭ переносчикам [2]. Случайные хозяева не могут поддерживать ни репликацию геномной вирусной РНК из-за отсутствия клеточных факторов, ни передачу ВКЭ [2].
Персистенция ВКЭ в инфицированных клетках происходит в присутствии в организме специфических антител, в том числе вируснейтрализующих и ингибирующих гемаг-глютинацию [4—6]. Такие антитела не могут быть утрачены у млекопитающих через несколько месяцев, как полагают Коренберг и соавт. [3], после клональной селекции В- клеток,
секретирующих специфические антитела, возможно лишь снижение титров ниже пределов чувствительности серологических методов. Поэтому в исследованиях персистентной инфекции необходимо использование комплексного подхода, включая молекулярно-биологические методы, так как их специфичность и чувствительность превосходят пределы иммунологических подходов, на которых были основаны прежние выводы, в частности Коренберга и соавт. [3].
Цель данной работы состояла в сравнительном анализе врожденной резистентности и адаптивного иммунитета у массовых видов диких грызунов: красной полевки Myodes rutilus Pallas и полевой мыши Apodemus agrarius Pallas, а также у лабораторных мышей ICR после их экспериментального заражения ВКЭ в составе клещевых суспензий.
Материал и методы
Мелкие млекопитающие и клещи. Голодных имаго иксодо-вых клещей и диких мелких млекопитающих отлавливали на территории антропургического очага клещевого энцефалита (КЭ) г. Новосибирска (54°49' N, 83°05' E). Имаго голодных иксодовых клещей собирали на флаг с растительности в период их максимальной активности в мае—июне 2010 г с определением видов по морфологическим признакам [7]. Диких животных для опытов отлавливали в октябре с использованием живоловок, определение вида, пола и возраста проводили, как описано ранее [8]. Молодых неразмножав-шихся зверьков (возраст 3—4 нед) помещали на неделю в индивидуальные клетки после обработки 1% водной эмульсией циперметрина для уничтожения эктопаразитов. Через 1 мес
после содержания в индивидуальных клетках у животных прижизненно брали кровь для определения РНК ВКЭ, анти-гемагглютининов и вируснейтрализующих антител к ВКЭ, после чего для опытов отбирали неинфицированных особей. Всего в опытах использовали 65 особей красной полевки и 54 особи полевой мыши, а также 57 лабораторных мышей ICR аналогичного с дикими зверьками возраста.
Детекцию ВКЭ проводили с использованием комплекса методов: обратной транскрипции с последующей ПЦР с ге-нотипспецифичными флуоресцентными зондами в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ), иммуноферментного анализа (ИФА) для определения антигена Е ВКЭ с использованием набора ВектоВКЭ-антиген-стрип (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск) и биопробы на 1—3- или 10—12-суточных лабораторных мышах ICR [9—11]. Патогенность изолятов оценивали для 1—3-суточных лабораторных мышей ICR в соответствии с описанием в работе [10].
Вирусную нагрузку определяли с использованием количественной ОТ-ПЦР-РВ с калибровочным графиком зависимости пороговых циклов (Ct) флуоресценции от количеств геном-эквивалентов рекомбинантной плазмиды, содержащей клонированную полноразмерную ДНК-копию генома ВКЭ, и уравнения Лукьянова—Матца [11].
Для заражения животных готовили смесь равных алик-вот (по 0,4 мл) супернатантов суспензий 27 вируссодержа-щих пулов клещей (по 10 экземпляров в каждом пуле), затем приготовленную смесь разводили в 5 раз физиологическим раствором (0,9% NaCl) с добавлением 3% сыворотки новорожденных телят. Молекулярное типирование посредством ОТ-ПЦР-РВ с генотипспецифичными зондами и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов Е и NS1 выявили в смеси РНК ВКЭ дальневосточного и сибирского (подтипы Заусаев и Васильченко в соотношении 4:1) генетических типов, доминирующих на территории Сибири [10]. По данным количественной ОТ-ПЦР-РВ, смесь клещевых суспензий содержала приблизительно 2520 геном-эквивалентов в 1 мл каждого типа ВКЭ, а в сумме — 5040 геном-эквивалентов ВКЭ в 1 мл. Внутримозговое титрование на 14-суточных лабораторных мышах ICR показало, что инфекционный титр ВКЭ в смеси составлял 3,5 lg LD^/мл.
Равные аликвоты (по 0,4 мл) супернатантов суспензий 27 неинфицированных пулов клещей без дополнительного разведения физиологическим раствором объединяли в безвирусную смесь клещевых суспензий.
Заражение красных полевок, полевых и лабораторных мышей проводили посредством подкожного введения 0,25 мл смеси клещевых суспензий, содержащих 2,9 lg LD50 ВКЭ и 1260 геном-эквивалентов ВКЭ. Контрольным группам лабораторных мышей вводили подкожно по 0,25 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) с добавлением 3% сыворотки новорожденных телят или по 0,25 мл безвирусной смеси клещевых суспензий.
Образцы крови для детекции ВКЭ и антител к ВКЭ брали прижизненно из ретроорбитального венозного сплетения до заражения и через 2, 4, 8, 16, 30, 60, 90 и 120 сут после заражения животных. Образцы крови для детекции ВКЭ хранили аликвотами по 50 мкл при -70 °C. В пробирки с кровью для выделения РНК добавляли 3 объема лизирующего раствора, содержащего 5,5 М гуанидин-изотиоцианат. Гомогенаты крови исследовали индивидуально. Пробы крови для тестирования антител к ВКЭ центрифугировали для отделения сыворотки, которую хранили в холодильнике при 4 °C не более недели.
Анализ экспрессии генов цитокинов у мышей и диких грызунов. Экспрессию генов цитокинов у инфицированных ВКЭ мелких грызунов исследовали посредством ОТ-ПЦР с прай-мерами, соответствующими мРНК интерферона у (ИФН-у), фактора некроза опухоли а (ФНОа), интерлейкинов (ИЛ) 4, 6, 10, 12 и 1р для суммарных РНК, выделенных из клеток по-
Лабораторные мыши ICR
2 4 8 ' 16 1 30 ' 60 1 90 ' 120 ' Сутки после заражения животных
Apodemus agrarius
100-1
805 О
Й 60-I-
л
40-
СО CD
20 -0
IX
ç
О CI
й^зЁГ 60 ' gS>~Wn
4 8
Сутки после заражения животных
Myodes rutilus
4 8 16 30 60 1 90
о „
ct Сутки после заражения животных
]] РНК ВКЭ Щ Патогенный ВКЭ -Ю-- Антиген ВКЭ
Рис. 1. Частоты детекции РНК, белка Е и патогенного ВКЭ в крови диких и лабораторных мелких грызунов после заражения вируссодержащей клещевой суспензией.
сле свертывания 100 мкл крови мышей, с электрофоретиче-ской детекцией продуктов реакций, как описано ранее [12].
Вирусспецифичные антитела в крови животных определяли с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с гусиными эритроцитами [13] и реакции биологической нейтрализации (РБН) [14] с использованием мышей ICR массой 8—10 г, разведения сывороток 1:10 и 100 LD50 штамма ВКЭ 2689 (номер доступа в GenBank (https://www. ncbi.nlm.nih.gov) JQ693478).
Статистическое сравнение выборочных долей и абсолютных количеств проводили с использованием критерия Стьюдента, принят уровень значимости различий p < 0,05. В тексте и таблицах для выборочных долей приведены ошибки репрезентативности [15].
Работу с инфекционным ВКЭ и потенциально опасным материалом выполняли в лаборатории, аттестован-
оригинальные исследования
Таблица 1
Усредненные частоты детекции РНк ВкЭ в пробах крови мелких грызунов в ранний и поздний периоды инфекции после дозированного заражения вирусофорной клещевой суспензией
Вид животных Частоты детекции РНК ВКЭ в крови, %
ранний период поздний период
(2—16 сут) (1—4 мес)
Лабораторные мыши ICR 52,4 ± 6,3 56,7 ± 9,2
Красная полевка 61,8 ± 5,6 70,6 ± 7,9
Полевая мышь 70,0 ± 6,0* 26,7 ± 8,2*
Примечание. * — статистически значимые различия (р < 0,001) между частотами детекции РНК ВКЭ у полевой мыши в ранний и поздний периоды.
ной для работы с патогенами II группы опасности для человека Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Лицензия № 77.99.18.001.Л.000032.03.08 от 05.03.08).
Содержание, кормление, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755).
Результаты
Подкожное дозированное заражение красной полевки M. rutilus и полевой мыши A. agrarius смесью суспензий клещей, спонтанно инфицированных сибирским и дальневосточным типами ВКЭ, проводили для моделирования пер-систенции ВКЭ у адаптированных резервуарных хозяев [10]. Контрольная группа включала неадаптированных к вирусу лабораторных мышей ICR. После заражения у животных не отмечали клинических проявлений КЭ в течение всего периода наблюдений. Однако в крови большинства инфицированных грызунов были выявлены вирусная РНК посредством ОТ-ПЦР-РВ и антиген ВКЭ (титры до 1:20 в ИФА) (рис. 1).
При этом у лабораторных мышей ICR и красных полевок частоты детекции вирусной РНК оставались высокими в ранний и поздний периоды инфекции, составляя в среднем у мышей ICR 52,4 ± 6,3 и 56,7 ± 9,2% соответственно, у красной полевки — 61,8 ± 5,6 и 70,6 ± 7,9% особей соответственно. У полевой мыши в отличие от красной полевки и мышей ICR в поздний период отмечено значимое (p < 0,001) снижение доли образцов, содержащих РНК ВКЭ, — от 70 ± 6,0% в ранний период до 26,7 ± 9,2% — в поздний (табл. 1).
Количественные оценки вирусных нагрузок на основании величин пороговых циклов в ОТ-ПЦР-РВ показали, что у лабораторных мышей максимальные значения достигали 2,5Ч05 геномов ВКЭ в 1 мл крови через 2—4 сут после заражения и постепенно снижались до 100 копий РНК в 1 мл к 16-му дню инфекции. Вирусные нагрузки в крови диких грызунов до 5,7Ч09 геном-эквивалентов в 1 мл через 2 сут и от 100 до 3,Ы07 геном-эквивалентов в 1 мл на протяжении 4 мес экспериментальной инфекции без признаков заболевания значительно превышали (p < 0,001) значения для лабораторных животных, что может быть следствием взаимной адаптации ВКЭ и диких мелких грызунов.
Патогенный для лабораторных мышей-сосунков вирус выделяли из крови всех видов грызунов преимущественно в ранней стадии инфекции до 8 сут после заражения (см. рис. 1): у красной полевки — в 66,6 ± 5,6% проб (на 2, 8 и 60-е сутки), у полевой мыши — в 15 ± 7,4% проб и только на 2-е сутки, у ICR — в 16,2 ± 6,1%. При этом инфекционные титры вируса (для мышей ICR массой 8—10 г при внутримозговом заражении) достигали в образцах красной полевки 5,5 lg LD50 а у полевой мыши — менее 2 lg LD50.
Частота экспрессии генов Тп1-цитокинов до заражения составляла у полевой мыши 33,3 ± 11,4%, у красной полевки значимо (p < 0,05) меньше — 6,3 ± 6,3% (рис. 2, а). Через 2 сут после заражения суммарная частота детекции мРНК ИФН-у, ФНОа и ИЛ-12, обеспечивающих развитие преимущественно клеточного иммунного ответа, у полевой мыши возрастала до 50 ± 15,1% (p > 0,05), у красной полевки — до 56,3 ± 12,8% (p < 0,05). В поздней стадии (через 2 мес после заражения) частота экспрессии генов ТЫ-цитокинов снизилась у красной полевки до 22,2 ± 5,0% (p < 0,05), у полевой мыши — до 38,1 ± 7,6% (p > 0,05) (см. рис. 2, а). При этом у последней выявлено статистически значимое
IS
аз s о
0 аз а.
1
CO I
ЮОп
80-
о ои
IS J
g 40
X
£ 20-tx t; о ct
До заражения Через 2 сут Через 2 мес (фон)
Сроки после заражения
- -А— Myodes rutilus
■ Apodemus agrarius
Фон
2 4 8
Сутки после заражения
Физиологический раствор Вируссодержащая клещевая суспензия Безвирусная клещевая суспензия
Рис. 2. Динамика частот экспрессии генов цитокинов ТЫ-пути: у двух видов диких грызунов после введения смеси клещевых суспензий, содержащих ВКЭ (а); у лабораторных мышей ICR после введения физиологического раствора или клещевых суспензий,
содержащих и не содержащих ВКЭ (б).
Таблица 2
Экспрессия генов цитокинов у диких грызунов через 60 сут после дозированного заражения клещевой суспензией, содержащей ВкЭ
Вид животных Частоты детекции РНК цитокинов в крови, %
ТЪ1-путь — цитокины преимущественно клеточного иммунного ответа ТЬ2-путь — цитокины преимущественно гуморального иммунного ответа
ИЛ-1р ИЛ-12 ИФН-у всего** ИЛ-4 ИЛ-10 всего**
22,2 ± 10,1* 57,1 ± 13,7*
22,2 ± 10,1 28,6 ± 12,5
22,2 ± 10,1 28,6 ± 12,5
22,2 ± 5,0 38,1 ± 7,6
22,2 ± 10,1 28,6 ± 12,5
77,8 ± 10,1 71,4 ± 12,5
50,0 ± 8,5 50,0 ± 9,6
Myodes rutilus Apodemus agrarius
Примечание
красной полевки и полевой мыши; ** — усредненное количество положительных результатов для цитоки нов клеточного или гуморального иммунного ответа.
статистически значимые (p < 0,05) различия между частотой детекции ИЛ-1Р у
** _
120
%
ч о с о >s а ю о
§
120 100
(p < 0,05) превалирование доли особей с экспрессией гена ИЛ-ф (табл. 2).
Частоты экспрессии генов №2-цитокинов, обеспечивающих развитие преимущественно гуморального иммунного ответа, были статистически сход- | ными у разных видов диких мелких грызунов на протяжении всего периода наблюдений, составляя до заражения у полевой мыши 62,5 ± 12,5% особей, у красной полевки — у 40,9 ± 10,7%, через 2 мес после заражения у красной полевки — 50 ± 8,5%, у полевой мыши — 50 ± 9,6% (см. табл. 2).
Экспрессию генов цитокинов у лабораторных мышей ICR исследовали в ранний период после подкожного введения вируссодержащей и безвирусной клещевых суспензий спонтанно инфицированных клещей, а также физиологического раствора (рис. 2, б). Различия частот определения РНК цитокинов преимущественно клеточного иммунитета у лабораторных и диких грызунов после введения вируссодержа-щей суспензии состояли в их активации у диких грызунов через 2 сут инфекции и, напротив, относительном ингибировании у мышей ICR (см. рис. 2, а, б). Показана супрессия генов цитокинов клещевыми суспензиями без ВКЭ в ранних стадиях инфекции до 8 сут после заражения с возможным подавлением специфического клеточного иммунитета, что необходимо для формирования последующей персистен-ции ВКЭ. При этом снижение частот детекции цитокинов после введения вируссодержащей суспензии было более кратковременным — до 2 сут. Необходимо отметить сходное увеличение частот детекции цитокинов ТЫ-пути через 2 сут у лабораторных мышей после введения физиологического раствора и у диких грызунов после заражения вируссодержащими клещевыми суспензиями с последующим снижением до фоновых значений (см. рис. 2, а, б), что могло быть обусловлено адаптированностью резервуарных хозяев к ВКЭ. Для противовоспалительных регуляторных интерлейкинов (ИЛ-4 и ИЛ-10) отмечена одновременная активация без иммуносупрессии с максимумом через 4 дня после заражения и последующим снижением до фоновых значений через 16 сут инфекции, что, возможно, обеспечивало последующую индукцию гуморального иммунитета [16—18]. Таким образом, в ранней стадии инфекции лабораторных мышей клещевыми суспензиями, содержащими ВКЭ, происходила индукция транскрипции РНК цитокинов преимущественно гуморального иммунитета
с подавлением экспрессии генов цитокинов Th1.
Вируснейтрализующие антитела у всех видов мелких грызунов, антигемаг-глютинины к ВКЭ у диких животных были обнаружены через 30 сут и оставались в детектируемых количествах до 4 мес инфекции (рис. 3). В отличие от диких зверьков у мышей ICR антигемагглю-тинины появились раньше — на 8-е сутки. Средняя геометрическая титров антиге-магглютининов для серопозитивных особей за весь период составляла у красной полевки 54, у полевой мыши — 23,8, у мышей ICR через 8—16 сут — 61.
Xf-----<>
16 30 Сутки после заражения
60
90
120
Myodes rutilus
16 30 60 Сутки после заражения
-о------о
2 4 8 16 30 60
Сутки после заражения
-о- Вируснейтрализующие антитела —
Антигемагглютинины
Рис. 3. Частоты выявления вируснейтрализующих и подавляющих гемагглюти-нацию антител к ВКЭ у мелких грызунов после заражения вируссодержащими
клещевыми суспензиями. Антигемагглютинины у мышей ICR в период 30—120 сут после заражения не исследовали.
Обсуждение
Моделирование персистентной инфекции у лабораторных мышей и массовых видов диких грызунов — основных прокормителей преимагинальных фаз иксодовых клещей — красной полевки M. rutilus и полевой мыши A. agrarius [8—10] осуществляли посредством дозированного подкожного заражения смесью суспензий спонтанно инфицированных клещей двух видов, доминирующих на исследуемой территории, — Ixodes persulcatus P. Schulze, 1930, и Ixodes pav-lovskyi Pomerantsev, 1946 (со значительным превалированием (p < 0,001) доли последнего — в среднем 70,8 ± 0,7%) [10], спонтанно инфицированных сибирским и дальневосточным генетическими типами ВКЭ.
Заражение животных смесью генетических типов ВКЭ обусловлено высокими частотами смешанных инфекций у клещей и млекопитающих на территории Новосибирской области [10, 19]. Доза заражения 2,9 lg LD50 ВКЭ соответствовала инфекционным титрам ВКЭ у имаго иксодовых клещей при спонтанном инфицировании в природной популяции [10]. Применение комплекса высокочувствительных и специфичных молекулярно-биологических и вирусологических методов позволило выявить РНК и белок Е ВКЭ у большинства инфицированных диких и лабораторных грызунов в течение 4 мес при отсутствии признаков КЭ (учащенное дыхание, тремор конечностей, спазмы, парезы и параличи с летальными исходами через несколько часов), а патогенный для лабораторных мышей-сосунков ВКЭ — преимущественно на ранних стадиях инфекции до 8 сут после заражения. Вирусные нагрузки у диких грызунов через 2 сут после экспериментального заражения превышали средние количества ВКЭ при спонтанном вирусоносительстве у диких грызунов [10] и экспериментальной инфекции лабораторных мышей. Ранее [20] у большинства особей красной полевки и полевой мыши через 2—3 сут после экспериментального подкожного заражения ВКЭ определяли эпизоотически значимую виру-семию с титрами 3 lg LD50/0 03 и более [21] для лабораторных мышей. При этом у красной полевки такой уровень вирусе-мии развивался при инфекции высоко- и умеренновирулент-ными штаммами (титры при подкожном заражении мышей 7 и 5,2 lg LD50 соответственно), у полевой мыши — умеренно-и слабовирулентными штаммами (титры 5,2 и 3,5 lg LD50 соответственно). В совокупности данные подтверждают роль красной полевки и полевой мыши как резервуарных, а не индикаторных хозяев ВКЭ, несмотря на существенные различия в частотах вирусоносительства, вызванные, возможно, их приуроченностью к разным биотопам [8—10, 19], — в природных популяциях красная полевка, как и иксодовые клещи, обитает в лесных биотопах, а полевая мышь — на более открытых пространствах [8] с меньшей численностью таежного клеща, для развития которого необходима влажность лесной подстилки. Пониженные частоты вирусоноситель-ства у полевой мыши по сравнению с красной полевкой как в эксперименте на поздних стадиях персистенции (см. табл. 1 и рис. 1), так и в естественных условиях в природных популяциях [9, 10, 19] могут быть обусловлены различиями врожденной резистентности. Иммунная реактивность A. agrarius также была выше по сравнению сM. rutilus [22, 23].
До заражения и после 2 мес персистенции ВКЭ частоты детекции мРНК цитокинов T-хелперного ответа 1-го типа у полевой мыши превышали таковые у красной полевки при сходных уровнях экспрессии генов цитокинов №2-пути. Статистически значимое (p < 0,05) превалирование доли особей с экспрессией гена ИЛ-ф, возможно, обусловило пониженные частоты вирусоносительства у полевой мыши по сравнению с красной полевкой в период персистенции как в эксперименте (см. табл. 1 и рис. 1), так и в естественных условиях у спонтанно инфицированных зверьков [9, 10, 19]. Подавление экспрессии генов цитокинов смесью безвирус-
оригинальные исследования
ных клещевых суспензий (см. рис. 2, б), возможно, обусловлено иммуносупрессивными свойствами слюны клещей [24]. Различия в динамике изменения частот детекции РНК цито-кинов при введении смеси клещевых суспензий, содержащих и не содержащих ВКЭ, могли быть вызваны разведением ви-руссодержащей смеси в 5 раз физиологическим раствором для достижения наиболее распространенных в природных популяциях титров вируса.
Персистенция ВКЭ у мелких грызунов происходила после индукции экспрессии генов ИЛ-4 и ИЛ-10 ТЬ2-пути преимущественно гуморального иммунного ответа в присутствии вируснейтрализующих и ингибирующих гемагглютинацию антител, возможно, вследствие внутриклеточной локализации адаптированного к грызунам вируса, а также внеклеточной секреции и циркуляции антител.
Заключение
При экспериментальном моделировании персистенции ВКЭ посредством подкожного заражения диких мелких грызунов смесью суспензий клещей, спонтанно инфицированных сибирским и дальневосточным типами вируса, количественные оценки показали высокие вирусные нагрузки до 1000 вирусных частиц на ядерную клетку крови в присутствии специфических антител, что исключает ингибирова-ние репликации геномных РНК или экспрессии генов ВКЭ. Поверхностный антиген Е ВКЭ и вирусспецифические антитела способны к перекрестным иммунологическим реакциям в тест-системах с моноклональными антителами и эталонными штаммами вируса соответственно [9], что может свидетельствовать о конформационной стабильности вирусных антигенов. Следовательно, в качестве возможного механизма персистенции ВКЭ у диких и лабораторных грызунов остается принять третий из вышеперечисленных способов [1] — вирусопосредованное модулирование иммунного ответа, о чем свидетельствовал дисбаланс провоспалительных цито-кинов и, следовательно, возможные нарушения клеточного иммунитета.
Финансирование. Исследования выполнены при финансовой поддержке грантов N° 83, 135, интеграционных программ Сибирского отделения РАН и Федеральных программ фундаментальных научных исследований 2013-2020 (VI.51.1.5).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1, 2, 9, 13, 18 см. REFERENCES)
3. Коренберг Э.И., Помелова В.Г, Осин Н.С. Природноочаговые инфекции, передающиеся иксодовыми клещами. М.: Наука; 2013.
4. Верета Л.А. Иммунология клещевого энцефалита по материалам экспериментальных и клинико-эпидемиологических исследований в очагах Приамурья: Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. М.: 1969.
5. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. Хронический клещевой энцефалит. Новосибирск: Наука; 1986.
6. Бахвалова В.Н., Панов В.В., Потапова О.Ф., Матвеева В.А., Матвеев Л.Э., Морозова О.В. Персистенция вируса клещевого энцефалита в организме диких мелких млекопитающих и в культурах пермиссив-ных клеток. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2007; (11): 79-86.
7. Филиппова Н.А. Систематика и эволюция. В кн. Филиппова Н.А., ред. Таежный клещ Ixodes persulcatus Schulze (Acarina, Ixodidae): морфология, систематика, экология, медицинское значение. Ленинград: Наука; 1985: 97-187.
8. Панов В.В. Мелкие млекопитающие лесопарковой зоны ННЦ - прокормители преимагинальных фаз таёжного клеща. В кн: Власов В.В., Репин В.Е., ред. Инфекции, передаваемые клещами в сибирском регионе. Новосибирск: Сибирское отделение Российской академии наук; 2011: 35-50.
10. Бахвалова В.Н., Чичерина Г.С., Панов В.В., Глупов В.В., Морозова О.В. Биоразнообразие вируса клещевого энцефалита в ик-содовых клещах и мелких млекопитающих на территории Новосибирской обл. Инфекционные болезни. 2015; 13(4): 15-21.
original research
11. Морозова О.В., Гришечкин А.Е., Бахвалова В.Н., Исаева Е.И., Подчерняева Р.Я. Динамика репродукции вируса клещевого энцефалита в культурах клеток. Вопросы вирусологии. 2012; 57(2): 40-3.
12. Морозова О.В., Бахвалова В.Н., Чичерина Г.С., Потапова О.Ф., Исаева Е.И. Сравнение экспрессии генов цитокинов у мышей, иммунизированных или заражённых вирусом клещевого энцефалита. В кн. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., ред. Интерферон - 2011. Сборник научных статей к 80-летию академика РАМН ФИ. Ершова. М.; 2012: 461-5.
14. Дерябин П.Г., Лебедева Г.А., Логинова Н.В. Реакция нейтрализации тогавирусов на мышах и культурах клеток. В кн.: Гайда-мович С.Я., ред. Арбовирусы (методы лабораторных и полевых исследований). М.: Наука; 1986: 120-6.
15. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа; 1980.
16. Сартакова М.Л., Коненков В.И. Структурные основы межклеточных взаимодействий в процессе представления антигенов Т-лимфоцитам: молекулы главного комплекса гистосовмести-мости, как одна из составляющих частей тримолекулярного комплекса. Успехи современной биологии. 1997; 117(5): 568-83.
17. Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В., Воробьева М.С. Активность цитокинов при иммунизации вакциной против клещевого энцефалита в эксперименте. Вопросы вирусологии. 2003; 48(2): 22-5.
19. Бахвалова В.Н., Чичерина Г.С., Панов В.В., Глупов В.В., Морозова О.В. Распределение генетических типов вируса клещевого энцефалита среди спонтанно инфицированных иксодовых клещей и мелких млекопитающих на территории Новосибирской области. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2015; 20(4): 26-34.
20. Бахвалова В.Н. Эпизоотическое состояние природного очага клещевого энцефалита и особенности вирусной популяции в лесостепном Приобье (Западная Сибирь). Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Кольцово; 1995.
21. Чунихин С.П. Экспериментальные исследования по экологии вируса клещевого энцефалита. Вопросы вирусологии. 1990; 35(3): 183-8.
22. Мак В.В., Панов В.В., Добротворский А.К., Мошкин М.П. Сопряженная изменчивость иммунореактивности и агрессивности у самцов красной полевки (Clethrionomys rutilus) и полевой мыши (Apodemus agrarius). Зоологический журнал. 2002; 81(10): 1260-4.
23. Москвитина Н.С., Кравченко Л.Б., Мак В.В., Добротворский А.К., Панов В.В., Андреевских А.В. и др. Иммунореактивность разных демографических групп в городских популяциях полевой мыши Apodemus agrarius (Rodentia, Muridae). Зоологический журнал. 2004; 83(4): 480-6.
24. Балашов Ю.С. Роль слюнных желез иксодовых клещей (Ixodi-dae) в регуляции процесса питания. Паразитология. 1994; 28(6): 437-44.
REFERENCES
1. Brian T.D. Viruses and the Cellular Immune Response. New York: Marcel Dekker; 1993.
2. Donoso Mantke O., Karan L.S., R^ek D. Tick-borne encephalitis viruses: a general overview. In: R^ek D., ed. Flavivirus Encephalitis. Rijeka: InTech; 2011: 133-56.
3. Korenberg E.I., Pomelova V.G, Osin N.S. Natural-focus Tick-borne Infections [Prirodnoochagovye infektsii, peredayushchiesya iksod-ovymi kleshchami]. Moscow: Nauka; 2013. (in Russian)
4. Vereta LA. Immunology of tick-borne encephalitis based on data of experimental and clinic-epdemiological research in natural foci of Amur region: Diss. Moscow: 1969. (in Russian)
5. Pogodina V.V., Frolova M.P., Erman B.A. Chronic Tick-borne Encephalitis [Khronicheskiy kleshchevoy entsefalit]. Novosibirsk: Nau-ka; 1986 (in Russian)
6. Bakhvalova V.N., Panov V.V., Potapova O.F., Matveeva V.A., Mat-veev L.E., Morozova O.V. Persistence of tick-borne encephalitis virus in organisms of wild small mammals and in permissive tissue cultures. Dal'nevostochnyy zhurnal infektsionnoy patologii. 2007; (11): 79-86. (in Russian)
7. Filippova N.A. Systematics and evolution. In: Filippova N.A., ed. Taiga Tick Ixodes Persulcatus Schulze (Acarina, Ixodidae): Morphology, Systematics, Ecology, Medical Importance [Taezhnyy kle-shch Ixodes persulcatus Schulze (Acarina, Ixodidae): morfologiya,
sistematika, ekologiya, meditsinskoe znachenie]. Leningrad: Nauka; 1985: 97-187. (in Russian)
8. Panov V.V. Small mammals of forest-park zone of Novosibirsk Scientific center - hosts of immature taiga. In: Vlasov V.V., Repin V.E., eds. Tick-Borne Infections in Siberian Region [Infektsii, peredavae-mye kleshchami v sibirskom regione]. Novosibirsk: Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; 2011: 35-50. (in Russian)
9. Bakhvalova V.N., Dobrotvorsky A.K., Panov V.V., Matveeva V.A., Tkachev S.E., Morozova O.V. Natural tick-borne encephalitis virus infection among wild small mammals in the South-Eastern part of Western Siberia, Russia. Vector Borne Zoonotic. Dis. 2006; 6(1): 32-41.
10. Bakhvalova V.N., Chicherina G.S., Panov V.V., Glupov V.V., Morozova O.V. Biodiversity of tick-borne encephalitis virus in ixodid ticks and small mammals in Novosibirsk region. Infektsionnye bolezni. 2015; 13(4): 15-21. (in Russian)
11. Morozova O.V., Grishechkin A.E., Bakhvalova V.N., Isaeva E.I., Podchernyaeva R.Ya. Dynamics of reproduction of tick-borne encephalitis virus in tissue cultures. Voprosy virusologii. 2012; 57(2): 40-3. (in Russian)
12. Morozova O.V., Bakhvalova V.N., Chicherina G.S., Potapova O.F., Isaeva E.I. Comparison of cytokine gene expression in mice immunized or infected with tick-borne encephalitis virus. In: Ershov F.I., Narovlyanskiy A.N., eds. Interferon - 2011. Digest of scientific articles for 80 th anniversary of Academician of the Russian Academy of medical SciencesF.I. Ershov [Interferon - 2011. Sbornik nauchnykh statey k 80-letiyu akademika RAMN F.I. Ershova]. Moscow; 2012: 461-5. (in Russian)
13. Clarke D.H., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination-inhibition with arthropod-borne viruses. Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1958; 7(5): 561-73.
14. Deryabin P.G., Lebedeva G.A., Loginova N.V. Neutralization reaction of togaviruses in mice and tissue cultures. In.: Gaydamovich S.Ya., ed. Arboviruses (methods of laboratory and field research). Moscow: Nauka; 1986: 120-6. (in Russian)
15. Lakin G.F. Biometria [Biometriya]. Moscow: Vysshaya shkola; 1980. (in Russian)
16. Sartakova M.L., Konenkov V.I. Structural bases of intercellular interactions in the process of presentation of antigens to T-lymphocytes: molecules of maor histocompatibility complex as one from constituting parts of trimolecular complex. Uspekhi sovremennoy biologii. 1997; 117(5): 568-83. (in Russian)
17. Ignat'ev G.M., Otrashevskaya E.V., Vorob'eva M.S. Activity of cytok-ines during immunization with the vaccine against tick-borne encephalitis in experiment. Voprosy virusologii. 2003; 48(2): 22-5. (in Russian)
18. Mansfield K.L., Johnson N., Phipps L.P., Stephenson J.R., Fooks A.R., Solomon T. Tick-borne encephalitis virus - a review of an emerging zoonosis. J. Gen. Virol. 2009; 90(Pt. 8): 1781-94.
19. Bakhvalova V.N., Chicherina G.S., Panov V.V., Glupov V.V., Morozova O.V. Distribution of tick-borne encephalitis virus genetic subtypes among spontaneously infected ixodid ticks and small mammals in Novosibirsk region. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. 2015; 20(4): 26-34. (in Russian)
20. Bakhvalova V.N. Epizootic status of natural focus of tick-borne encephalitis and features of the viral population in forest-steppe Ob region (Western Siberia): Diss. Kol'tsovo; 1995. (in Russian)
21. Chunikhin S.P. Experimental studies of tick-borne encephalitis virus ecology. Voprosy virusologii. 1990; 35(3): 183-8. (in Russian)
22. Mak V.V., Panov V.V., Dobrotvorskiy A.K., Moshkin M.P. Correlated variability of immunoreactivity and aggression of red vole (Clethrionomys rutilus) males and fiels mice (Apodemus agrarius). Zoologicheskiy zhurnal. 2002; 81(10): 1260-4. (in Russian)
23. Moskvitina N.S., Kravchenko L.B., Mak V.V., Dobrotvorskiy A.K., Panov V.V., Andreevskikh A.V., et al. Immunoreactivity of different demographic groups in urban populations of field mice, Apodemus agrarius (Rodentina, Muridae). Zoologicheskiy zhurnal. 2004; 83(4): 480-6. (in Russian)
24. Balashov Yu.S. The role of salivary glands of ixodid ticks (Ixodidae) in the regulation of feeding process. Parazitologiya. 1994; 28(6): 437-44. (in Russian)
Поступила 19.01.17 Принята в печать 28.02.17
