CC BY
40
УДК 616-007.17: 618.146: 576.858.6
Т.Е. Белокриницкая1, Ю.Н. Пономарева1, Ю.А. Витковский1, М.Н. Мочалова2, Н.М. Ладыгина2,
Е.Н. Бунина3, Г.М. Ломнева3
ЦИТОКИН-ОПОСРЕДОВАННАЯ РОЛЬ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В РАЗВИТИИ ЦЕРВИКАЛЬНОЙ ДИСПЛАЗИИ
1Читинская государственная медицинская академия (Чита) 2Читинский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД (Чита) 3Читинский областной диагностический центр (Чита)
Статья посвящена изучению возможной роли HPVв цитокиновой регуляции апоптоза и пролиферации клеток при. цервикальной дисплазии. Приводятся данные исследования цервикальной слизи, и. биопта-тов шейки, матки. 150 пациенток с цервикальной дисплазией. HPV определяли методом. ПЦР, содержание TNF-a, TGF-в — методом. ИФА, апоптоз и пролиферативную активность — иммуногистохимическим методом, с моноклональными антителами, к p53, bcl-2 и PCNA. Развитие предраковых изменений шейки матки, на фоне HPV сопровождалось незначительным, увеличением, экспрессии. TGF-в на фоне стабильных показателей. TNF-a с высокими уровнями экспрессии. PCNA и. наличием, bcl-2, который был обнаружен только при. HPV. Высокое содержание TNF-a ассоциировалось с увеличением, экспрессии. р53 при. хла-мидийной, бактериальной и. цитомегаловирусной инфекции. Однако экспрессия. PCNA была значительно выше при. HPV, в отличие от. других инфекций. При. HPVпрерывается, каскад цитокиновых реакций, направленных на подавление инфекционного агента, что сопровождается высокой пролиферативной активностью на фоне замедления, гибели, трансформированных клеток.
Ключевые слова: цитокины, цервикальная дисплазия, вирус папилломы
CYTOKINE CAUSED ROLE OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS INFECTION IN DEVELOPMENT OF CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA
T.E. Belokrinitskaya1, Y.N. Ponomaryova1, Yu.A. Vitkovsky1, M.N. Mochalova 2,
N.M. Ladygina2, E.N. Bunina3, G.M. Lomneva3
1Chita State Medical Academy, Chita 2Chita Regional AIDS-Centre, Chita 3Chita Regional Diagnostic Centre, Chita
The article is devoted to the study of possible HPV role in cytokine regulation, of apoptosis and proliferation of cells under cervical intraepithelial neoplasia (CIN). The data of the investigation of cervical mucus and. bioptates of cervix uterine in 150 patients with CIN are given. HPV was detected with PCR, TNF-a and TGF-fi content with ELISA, apoptosis and. proliferative activity with immunohistochemical method, with monoclonal antibodies p53, bcl-2, PCNA. Development of CIN in combination, with. HPV was held. with, increased expression, of TGF-в with, unchanged. TNF-a and. high level of PCNA expression, and. bcl-2 which was indicated, only in presence of HPV. High level of TNF-awas associated, with increased p53 expression under chlamydial, bacterial, cytomegalovirus infections. However, PCNA expression was rather high in HPV in comparison, with other infections. HPV with CIN characterized, the changed regulation, of cytokines with high proliferative activity and. diminished, apoptosis.
Key words: cytokines, cervical intraepithelial dysplasia, human papilloma virus
Вирус папилломы человека (Human Papilloma Virus, HPV) является этиологической причиной не только рака шейки матки, но и цервикальной дисплазии [2]. Трансформация клеток, содержащих HPV в диспластическом эпителии, с последующей малигнизацией и инвазией опухоли определяется нарушением механизмов иммунного контроля.
Можно полагать, что HPV инициирует многостадийный процесс трансформации, который контролируется клеточными факторами. Механизмы, определяющие вирусную персистенцию, активно изучаются. Среди них цитокиновые каскады, регулирующие функционирование онкобелков, клеточные онкогены, презентирующие вирусные ан-
тигены и транскрипционные факторы ДНК HPV. Исследования отдельных онкогенов в развитии патологических изменений шейки матки выявили дисбаланс между пролиферацией клеток и апоп-тозом [5, 6, 7]. В регуляции этих процессов важное значение имеют цитокины, в том числе фактор некроза опухолей-а (TNF-а) и трансформирующий фактор роста-Р (TGF-P) [1, 2, 6].
Несмотря на активное изучение роли цитоки-нов и факторов роста в патогенезе предраковых и злокачественных заболеваний шейки матки, особенности взаимосвязи цитокинового обмена с пролиферацией и апоптозом клеток цервикального эпителия, инфицированных HPV, изучены недостаточно [10, 11, 12].
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение возможной роли HPV в ци-токиновой регуляции апоптоза и пролиферации клеток при цервикальной дисплазии.
МЕТОДИКА
Нами проведено проспективное исследование соскобов эпителия, слизи цервикального канала и биоптатов шейки матки 150 пациенток с цервикальной дисплазией I — III степени тяжести, которые находились на обследовании и лечении в Читинском областном онкологическом диспансере в 2001 -2004 гг.
Диагностика заболеваний шейки матки включала в себя клинические, кольпоскопические, ци-тогистологические и иммуногистохимические методы исследования. Стадирование предраковых процессов шейки проводилось в соответствии с общепринятой Международной статистической классификацией болезней (1992). Средний возраст обследованных пациенток составил 38,7 ±6,1 года, начиная от 21 года до 46 лет. Контрольную группу составили 30 здоровых женщин, сопоставимым по возрасту, данным анамнеза и не имеющих в настоящее время заболеваний шейки матки.
Забор соскобов эпителия и цервикальной слизи проводился в фолликулиновую фазу овариального цикла до проведения комплексного обследования, биоптатов шейки матки - до начала лечения.
ПЦР-диагностику HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45 типов, CMV-500, HSV-430 I и II типов, Chlamydia trachomatis, проводили по общепринятой методике с применением тест-систем «АмплиСенс-100-R» (Москва) в лаборатории молекулярной диагностики областного диагностического центра г. Читы [9]. Бактериальные инфекции — Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis — диагностировали стандартным бактериоскопическим методом в лаборатории Читинского областного онкологического диспансера.
Определение TNF-a и TGF-P (пкг/мл) в цервикальной слизи проводили с помощью стандартных коммерческих наборов для прямого иммунофермен-тного анализа компании «ПротеинКонтур» (Санкт-Петербург) в клинико-диагностической лаборатории Читинского областного центра СПИД [4].
Апоптоз и пролиферативную активность клеток цервикального эпителия определяли иммуногистохимическим методом в лаборатории патоморфологии областного диагностического центра г. Читы. При изучении пролиферативных процессов использовали определение антигена ядер-пролиферирую-щих клеток (PCNA), при оценке клеточной гибели
— экспрессию онкогенов p53 и bcl-2. Иммуногисто-химическое исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5 мкм. Срезы инкубировали с антителами к PCNA («Dako», Дания, клон PC-10, предварительное разведение), р53 («Dako», Дания, клон DO-7, рабочее разве-дение 1:100), bcl-2 («Dako», Дания, клон 124, рабочее разведение 1:20). Сроки инкубации для всех антител составили 18 ч при температуре 4 °С. Для иммунного окрашивания использовали стрептавидин-биотинпероксидазный метод («Dako», Дания), во всех случаях проводили докрашивание ядер гематоксилином. Подсчет проводили в 20 произвольно выбранных полях зрения при увеличении х 400. Индексы мечения PCNA и р53 рассчитывали как отношение числа позитивно окрашенных ядер к общему числу ядер. При исследовании препаратов, окрашенных антителами к bcl-2, рассчитывали отношение иммуногистохимически позитивных клеток с окрашенной цитоплазмой к общему числу клеток [7, 8].
Данные представлены в виде M ± m, где M — среднее арифметическое, m — ошибка среднего. Для оценки статистически значимых различий полученных данных использовали критерий Стью-дента (t), критический уровень значимости принимался равным 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1.
При диспластических изменениях цервикального эпителия, ассоциированных c HPV высокого риска, нами не было выявлено статистически значимых различий в содержании TNF-a, по сравнению с контрольной группой, в то же время, концентрация TGF-P была увеличена при HPV в 3 раза в сравнении с показателями здоровых женщин (р = 0,000). Экспрессия p53 и PCNA была соответственно в 9 и 6 раз выше, чем в контроле (р = 0,000) (рис. 1). В случаях HPV был обнаружен онкоген bcl-2, экспрессия которого отсутствовала во всех группах сравнения. При сочетании HPV с другими генитальными инфекциями уровень исследуемых цитокинов и р53 значительно превышал аналогичные показатели в контроле и при HPV (р = 0,000). В то же время, индекс PCNA при микстинфекции достоверно уменьшился по сравнению с указанными выше группами (р = 0,000).
Хламидийная инфекция характеризовалась максимальными значениями TGF-P на фоне высоких показателей TNF-a (р = 0,000). Параметры p53 и PCNA также значительно превышали уровень их экспрессии при других инфекциях, однако, высокий индекс PCNA соответствовал показателям при HPV (соответственно р = 0,000 и p = 0,262) (рис. 2).
Таблица 1
Динамика содержания TNF-a, TGF-в и p53, Ь&-2, PCNA при различных генитальных инфекциях, ассоциированных с цервикальной дисплазией, M ± m
Инфекции, число наблюдений (n) Цитокины, пкг/мл Индекс мечения, %
TNF-a TGF-ß p53 bcl-2 PCNA
Здоровые, n = 30 4,4 ± 14,8 52,8 ± 9,1 2,5 ± 1,2 - 10,5 ± 7,9
HPV 16/18, 31/33, 35/45, n = 33 53,9 ± 11,5* p = 0,013 196,4 ± 15,8* 22,3 ± 6,5* 2,7 ± 0,2 58,9 ± 8,9*
CMV, n = 18 98,6 ± 11,0*** 102,6 ± 26,9*** 27,6 ± 6,7*** р = 0,008 - 35,0 ± 5,8***
HSV I и II типа, n = 12 370,7 ± 22,5*** 440,0 ± 65,5*** 25,1 ± 9,5*** р = 0,219 - 43,4 ± 10,0***
Chlamydia trachomatis, n = 12 108,0 ± 36,4*** 1049,0 ± 165,2*** 36,4 ± 16,2*** - 62,5 ± 10,7*** р = 0,262
Бактериальные инфекции, n = 29 417,3 ± 96,5*** 390,5 ± 54,8*** 32,0 ± 10,9*** - 40,1 ± 11,2***
Микстинфекции с HPV, n = 46 286,7 ± 52,4*** 497,9 ± 63,8*** 27,4 ± 9,5*** р = 0,009 - 46,7 ± 9,1***
Примечание: *p = 0,000 - статистическая значимость различий по сравнению с контрольной группой; **р = 0,000 -статистическая значимость различий по сравнению с ИРУ.
Рис. 1. Экспрессия РОЫД при тяжелой цервикальной дисплазии в сочетании с ИРУ. Стрептавидин-биотиновый метод, хромоген-диаминобензидин х 400.
При поражении шейки матки вирусом герпеса I и II типа, цитомегаловирусом были отмечены высокие значения ТЫБ-а и ТСБ-Р (р = 0,000). В свою очередь, экспрессия р53 при герпетической инфекции достоверно не отличалась от аналогичных параметров при ИРУ, а при цитомегаловирусе была несколько выше (соответственно р = 0,219 и р = 0,008), в отличие от показателей РСЫЛ — уровень этого антигена был значительно ниже, по сравнению с ИРУ (р = 0,000).
Бактериальные инфекции сопровождались высокими значениями ТЫБ-а, ТСБ-Р, р53 и РСЫЛ, показатели экспрессии которого не превышали значений при ИРУ (р = 0,000).
Таким образом, развитие предраковых изменений цервикального эпителия на фоне ИРУ, связано с максимальной пролиферативной активностью эпителиоцитов, что проявляется высокими уровнями экспрессии РСЫЛ и наличием Ьс1-2, который выявлялся только при ИРУ. Возможно, именно ИРУ принимает активное участие в инициации этого протоонкогена, способного блокировать апоптоз, опосредованный р53 и самостоятельно индуцировать пролиферативные процессы [10]. Инфицирование шейки матки ИРУ сопровождалось незначительным увеличением экспрессии ТСБ-Р на фоне стабильных показателей ТЫБ-а, которые статистически не отличались от таковых у здоровых женщин. В свою очередь, на примере
Рис. 2. Экспрессия р53 при слабой дисплазии в сочетании с хламидийной инфекцией. Стрептавидин-биотиновый метод, хромоген-диаминобензидин х 400.
хламидийной инфекции, очевидно, что ТЫБ-а индуцировал экспрессию ТСБ-Р, который затем подавлял его секрецию, деактивируя макрофаги [3]. Высокое содержание ТЫБ-а в эндоцервикальной слизи ассоциировалось с высокими уровнями экспрессии проапоптозного гена р53 при хламидийной, бактериальной инфекции и цитомегаловиру-се. Однако, экспрессия РСЫЛ, отражающего пролиферативную активность цервикального эпителия, была значительно выше при ИРУ, в отличие от других инфекций, что может быть обусловлено стимулирующим влиянием на пролиферацию протоонкогена Ьс1-2 с подавлением апоптоза. Косвенным подтверждением этого может являться локализация Ьс1-2-позитивных клеток в тех же участках опухолей, в которых локализовались р53 и РСЫЛ-позитивные клетки.
Полученные данные убедительно свидетельствуют об активном участии папилломавирусной инфекции в цитокиновой регуляции процессов апоптоза и пролиферации клеток при цервикальной дисплазии. Возможно, что при ИРУ прерывается каскад цитокиновых реакций, направленных на подавление инфекционного агента, что сопровождается высокой пролиферативной активностью на фоне замедления гибели трансформированных клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бережная М.Н. Система интерлейкинов и рак / М.Н. Бережная, В.Ф. Чехун. - Киев: ДИА, 2000. - 224 с.
2. Бохман Я.В. Руководство по онкогинекологии / Я.В. Бохман. — Л.: Медицина, 1989. — 464 с.
3. Зубова С.Г. Молекулярные механизмы действия фактора некроза опухолей-а и трансформирующего фактора роста-Р в процессе ответа макрофага на активацию / С.Г. Зубова, В.Б. Окулов / / Иммунология. — 2001. — №5. — С. 18 — 21.
4. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т. Нго, Г.М. Ленхофф. — М.: Мир, 1988. — 444 с.
5. Кулаков В.И. Апоптоз в клинике гинекологических заболеваний / В.И. Кулаков, Г.Т. Сухих, Р.Г. Гатаулина // Проблемы репродукции. — 1999.
- № 2. - С. 15-26.
6. Лушников Е.Ф. Гибель клетки (апоптоз) / Е.Ф. Лушников, А.Ю. Абросимов. — М.: Медицина, 2001. - 192 с.
7. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - Казань, 2004. -456 с.
8. Хариет Э.Р. Иммуноцитохимия: электронная микроскопия / Э.Р. Хариет, К.С. Гаттер // Молекулярная клиническая диагностика. Методы // Под ред. С. Херрингтон, Дж. Макги. - М.: Мир, 1999. - 558 с.
9. Хейди М. Бауэр Применение ПЦР для диагностики папилломавирусных инфекций гениталий / Хейди М. Бауэр, Е. Грир, М. Мишель Мано / / Молекулярная клиническая диагностика. Методы // Под ред. С. Херрингтон, Дж. Макги. - М.: Мир, 1999. - 558 с.
10. Both cell proliferation and apoptosis increase with lesion grade in cervical neoplasia but not correlate with human papillomavirus type / C. Isacson, T.D. Kessis, L. Hedrick, K.R. Cho // Cancer Res. - 2000. - Vol. 56 (4). - Р. 667-674.
11. Suppression of TNF-alpha mediated apoptosis by EGF in TNF-alpha sensitive human cervical carcinoma cell line / H. Akca, S.Y. Akan, A. Yanikoglu, O.N. Ozes / / Growth Factors. — 2003. — Mar., 21 (1). — P. 31—39.
12. Tyring S.K. Human papillomavirus infections: epidemiology, pathogenesis, and host immune response / S.K. Tyring // J. Amer. Acad. Dermatol.
- 2000. - Vol. 43. - P. 218-226.
