CC BY
497
Памяти профессора С.Е. Манойлова посвящается
ЦИТОХРОМ С КАК ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО: ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ, БУДУЩЕЕ
© В. И. Ващенко1, К. П. Хансон2 , П.Д. Шабанов1
1 Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова, 2НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург
Ключевые слова
цитохром С; лекарственные средства; ИБС; клеточная терапия; криобиология
Ващенко В.И., Хансон К.П. - Шабанов П. Д. Цитохром С как лекарственное средство: прошлое, настоящее, будущее // Обз. клин, фармакол. лек. тер. - 2005. - Т. 4, № 1. - С. 27-37.
В обзоре рассмотрена история развития основных направлений цитохромной терапии. Представлена характеристика цитохромов и структура цитохрома С, втом числе его лекарственной формы. Исторический экскурс и функциональная характеристика цитохромов приводится в связи с их практическим применением в лечебных программах. Библиогр. 87 назв.
ВВЕДЕНИЕ
Прошедший век останется в памяти человечества как век крупнейших открытий в области естествознания, которые стали определяющими в развитии перспективных направлений науки в XXI веке. К числу таких открытий, несомненно, нужно отнести разгадку тайны тканевого дыхания и его центрального звена — окислительного фосфорилиррвания. Установлено, что одним из ключевых ферментов дыхательной цепи является цитохром С. За эти фундаментальные работы американцу Джорджу Паладе в
1975 году и бельгийцу Клоду в 1974-м были присуждены Нобелевские премии. Значительный вклад в расшифровку свойств цитохромов внесли отечественные ученые и среди них одними из первых были профессор С.Е. Манойлов и его коллеги. Именно учеником профессора С.Е.Манойлова, Э.Ф. Деркачевым, вместе с сотрудниками Ленинградского НИИ гематологии и переливания крови (Л НИИ Г и ПК) в 1974 году была отлажена технология промышленного производства отечественной лекарственной формы цитохрома С [1]. В обзоре представлена история этих интересных экспериментов, а также роль ленинградских ученых в разработке лекарственной формы цитохрома С.
ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЦИТОХРОМОВ'
Цитохромы были впервые описаны под названием гистогематиндв в 1866 году Мак-Мунном [2]. Их физико-химические свойства и роль в биологическом окислении б£ти установлены значительно позже. В 1925 году американец Кейлин при помощи спектроскопа обнаружил в мышцах насекомых вещества (напоминающие гемосодержащие белки), которые окисляются и восстанавливаются в процессе дыхания. Он назвал их цитохромами и высказал предположение, что они функционируют в цепи переноса электронов, перенося электроны от молекул «топлива» к кислороду [3]. В настоящее время цитохромы обнаружены во всех типах организмов.
Таблица 1. Физические свойства митохондриальных цитохромов
Цитохром Молекулярный вес, 0 Е'О, В Максимум полосы поглощения, нм
а Р У
Ь 30 ООО +0,050 563 532 429
'К 370000 +0,220 554 524 418 •
с 12 500 +0,254 550 521 415
а О/ЩП0П +0,280 600 439
аз. 603,5 443
Длина волны,нм
Рис.1. Спектры поглощения цитохромов: I — окисленная форма; II — восстановленная форма
Они подразделяются на три основных класса —
А, В и С, — в зависимости от положения полос в спектрах поглощения (рис. 1; табл. 1). Восстановленные формы цитохромов каждого из этих трех классов имеют по три четко выраженные полосы в видимой области спектра — сх-полосу, (3-полосу и утполосу (называемую также полосой Соре) [4].
Многие цитохромы были получены в высокоочи-щенном виде. Однако приготовление их в растворимой гомогенной форме оказалось трудной задачей из-за того, что все они, за одним исключением, очень прочно связаны с митохондриальной мембраной, основным источником их получения. Исключением является цитохром С, который очень легко экстрагируется из митохондрий концентрированными солевыми растворами.
Последующие успехи в расшифровке структуры и свойств цитохрома С связаны с работами по его тщательной очистке и получения в кристаллической форме [5]. Это позволило на основе рентгеноструктурного анализа кристаллов цитохрома С определить его структурную формулу (рис. 2). Было установлено, что расположенная в центре железосодержащая протопорфириновая группа связана ковалентно с белком через тиоэфирные мостики между порфириновым кольцом и двумя остатками цистеина в пептидной цепи (образование их происходит в результате присоединения БН-групп к двойным связям винильных групп в позициях 2 и 4 про-топорфирина). Пептидная цепь цитохрома С, состоящая из 104 аминокислотных остатков [6], особым
Рис. 2. Схема структурной формулы цитохрома С из сердечной мышцы человека
образом «обмотана» вокруг гема, образуя гемовую полость (карман). Гем окружен гидрофобными боковыми цепями, в то время как полярные боковые цепи находятся снаружи молекулы.
Особенностью строения цитохрома С является наличие «двух каналов», которые ведут с поверхности молекулы внутрь, к гемогруппе и пространственно приспособлены для входа и выхода электронов.
Цитохром С — единственный из обычных гемсо-держащих белков, в котором имеется особая ковалентная связь между гемом и порфириновыми кольцами. Интересно, что при переходах железа между состояниями Ре(II) и Ре(III) не наблюдается каких-либо конформационных изменений в биокомплексе, что исключает изменение характеристик связи металл-лиганд в ходе реакции (рис. 3).
В этом уникальность цитохрома С, в значительной мере повлиявшая на выбор его в качестве лекарственного средства. Важно при этом помнить, что в живом организме цитохром С находится в сложном взаимодействии с другими цитохромами при выполнении своей биологической функции как окислительно-восстановительного катализатора.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ЦИТОХРОМОВ
В течение XX века в многочисленных экспериментах была детально исследована роль цитохрома С в биоэнергетике живой клетки как
а-кетоглуторат
изоцитрат
in vitro, так и на животных.. Ключевыми следует считать следующие работы:
В 1957 году Ван-Беккум (Van Bekkum D.W.) провел серию экспериментов, добавляя цитохром С к митохондриям из облученной селезенки крыс [7, 8]. Оказалось, что непосредственно после внесения препарата в инкубационную среду в селезеночных клетках повышался коэффициент P/О, через час эффект усилился й достиг максимума через 4 часа. Это явление он назвал «цитохромным эффектом». После дополнительных опытов автор пришел к заключению, что облучение вызывает в митохондриях селезенки дефицит цитохрома С. Позже, в 1963 году, Scalfe и Hill, создав искусственный комплекс цитохрома С с фосфатидилэтаноламином (прообраз искусственных липосом) и вводя его в живые клетки получили аналогичные результаты [9].
В 1967 году группой российских ученых под руководством профессора С.Е. Манойлова было изучено влияние экзогенного цитохрома С на радиаци-
онно-индуцированный опухолевый рост. Было обос-новано положение, что наблюдаемые под воздействием радиации патологические состояния организма, сопровождаются серьезными нарушениями окислительного фосфорилирования и дыхания [10, 11]. !
Учеником профессора Манойлова, К.П. Хансоном, было высказано предположение, что экзогенный цитохром С способен встраиваться в те места электронно-транспортной цепи митохондрий, которые ранее занимал эндогенный, с последующей нормализацией биоэнергетических процессов в тканях [12]. В дальнейшем, изучая митохондрии лишенные цитохрома С [13,14] методом дифференциальной спектроскопии, экспериментаторы обнаружили в них однотипные, изменения: снижение интенсивности полос поглощения в диапазоне X 520 нм и X 550 нм, которые присущи цитохрому С. При этом интенсивность полос поглощения, характеризующих цитохромы Ь, а и аз оставалась без из-
менений. Потеря митохондриями цитохрома С сопровождалась снижением фосфорилирующей способности митохондрий и нарушением сопряженности процессов окислительного фофорилирования и дыхания. Степень эстерификации неорганического фосфата таких митохондрий снижалась на 70-75 %. Введение экзогенного цитохрома С приводило к повышению интенсивности процессов окислительного фосфорилирования и увеличению коэффициента Р/О. Расчет концентраций цитохромов по пикам спектральных кривых показал достоверное повышение содержания цитохрома С и цитохромов С +С, в цитохром-С-дефицитных митохондриях клеток печени. Таким образом, экспериментально установлено, что лечебный эффект цитохрома С связан с его непосредственным проникновением в патологические клетки и взаимодействием с компонентами дыхательной цепи митохондриальных мембран [10-13]. Все эти изменения профессор С.Е.Манойлов объяснил влиянием ракового токсо-гормона на цитохромные системы митохондрий печени животных— носителей опухолей. Сделан вывод о том, что в организме животных, пораженных опухолевой болезнью, имеет место дефицит цитохромов. Ученые предположили, что введение цитохрома С животным, носителям опухоли, может в той или иной степени восполнить его дефицит и, таким образом, нормализовать биоэнергетические процессы, что, в свою очередь, может оказать тормозящее влияние на рост опухоли. Эти предположения экспериментаторы подтвердили в дальнейших опытах на крысах, которым вводили цитохром С. Гибель всех нелеченных животных произошла в сроки до 25 суток от начала перевивки. У леченных — к 54-му дню погибли 38 животных, 10— остались жить. У некоторых из них опухоль полностью рассосалась. Одновременно отмечено увеличение скорости поглощения кислорода (до 87,3 %) митохондриями печени (без лечения — 63-53 %) и усиление фосфорилирования — до. 68,5 % (43,2 % — без лечения) [15-17]. Комбинированное введение цитохрома С вместе с галактозой и.УТФ вызвало торможение роста саркомы; различия с контрольной группой составили 38 % к 18-м суткам после перевивки. Следовательно, введение цитохрома С животным, носителям опухоли, тормозит ее рост и предотвращает в митохондриях печени падение биоэнергетических процессов.. Сотрудники Хансона сделали заключение о благоприятном действии цитохрома С на течение саркомозависимой болезни. Обобщая свои опыты, авторы сделали вывод, что, проникая в клетку, фермент способен восстанавливать функциональную активность митохондриальных мембран [17-19].
Таким образом, препарат цитохром С можно применять в тех случаях, когда в ткани организма нарушены окислительные процессы, то есть при гипоксии различного генеза. Моделируя перитонит на крысах установили, что внутримышечное введение
цитохрома С снижает содержание лактата в клетках печени и слизистой тонкой кишки [20]. Препарат ингибирует процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), что проявляется в снижении концентрации диеновых конъюгатов и малонового альдегида. По мнению Л.М. Мхитарян [21], механизм лечебного действия цитохрома С заключается в его ингибирующем влиянии на ПОЛ и стимуляции синтеза ингибиторов протеолиза и не зависит от причин, вызвавших состояние гипоксии. С другой стороны, B.C. -Новиков считает, что цитохром С стабилизирует мембраны лизосом и обеспечивает сохранение кислых фосфатаз и ДНК, в основном, в связанном со структурами органелл состоянии [22]. Одновременно с этим повышается прочность связи гидролитических ферментов со структурами лизосом, что, как было установлено позже, является ключевым моментом в механизме антигипоксического действия цитохрома С.
ЦИТОХРОМ С И АПОПТОЗ
В последние годы наблюдается прогресс в изучении природы апоптоза — программированной клеточной гибели. Установлено, что в многоклеточном организме апоптоз выступает как неотъемлемый компонент механизма поддержания гомеостаза, комплементарный делению клеток. Деление клетки является центральным событием в ее жизненном цикле, поэтому основные усилия исследователей были направлены на выявление генов и белков, запускающих процесс деления или способных его останавливать [23]. Не меньшее внимание привлекали и процессы созревания и диф-ференцировки, лежащие в основе осуществления специализированных функций клеток и тканей. Становилось все более очевидным, что для многих нормальных физиологических процессов, а также патологических состояний наряду с выяснением механизмов пролиферации и дифференцировки не менее важным является установление закономерностей гибели клеток [24-25]. Молекулярно-генетические исследования показали, что генетические и метаболические нарушения процессов инициации и/или реализации апоптоза вносят существенный вклад в патогенез ряда заболеваний: злокачественных новообразований, ВИЧ-инфекций, дегенеративных процессов [26, 27].
Благодаря классическим работам нобелевских лауреатов в 2002 году (H.R.Horvitz, S.Brener, J.E. Sulton), стали ясны многие этапы генного контроля процесса апоптоза при помощи каспаз [28, 29]. Значительно меньше было сторонников мнения, что центральным звеном апоптоза является митохондриогенез [30, 31]. Работы последних пяти лет в значительной мере устранили этот досадный пробел [32-36].
Наиболее последовательными следует считать исследования лаборатории молекулярных механизмов апоптоза Кеттеринского онкологического
НАУЧНЫ^ОБЗОРЬ^^^П
центра (США). Профессор Wang Xiaodong и его сотрудники выполнили ряд блестящих экспериментов, которые продемонстрировали какую важную роль в процессе апоптоза играют митохондрии и цитохр’ом С [37-40]. На схеме (рис. 4) показано, что высвобождающийся из митохондрий цитохром С индуцирует один из главных путей программированной клеточной гибели: цитохром С~Ара/-1—кас-паза-9^каспаза-3—фрагментация ДНК и распад клетки. Выяснению деталей этого процесса посвящены многие современные работы по апоптозу [41-44]. Эти исследования освещают один из возможных путей поиска эффективных средств и методов лечения, .основанных на регуляции процесса апоптоза [45, 46].
ИСТОРИЯ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ЦИТОХРОМА с
В 1974 году был разработан промышленный метод получения отечественного препарата цитохрома С для инъекций. Выпуск его осуществлен на заводе медицинских препаратов бывшего Ленинградского мясокомбината: Перспективным считается промышленный метод получения цитохрома С из ткани сердца ластоногих и создание лекарственной формы препарата из нового вида сырья [47]. Не менее важным является создание таблетиро-ванной формы цитохрома С [48]. Разработана новая технология получения лекарственного препарата, в основу которой положена методика комп-лексирования цитохрома С с фосфолипидами (ФЛ, ОЬ-а-токоферол) [49]. Для снятия ограничений по медицинскому применению цитохрома С в НИИ «Синтезбелок» (Киев) разработаны биотехнологические методы его получения [50]. Последний, как и его аналог животного и дрожжевого происхождения, благоприятно влияет на течение острой ишемии миокарда, способствует улучшению кардиогемодинамики и сокращению размера зоны некроза, а также проявляет антиаритмическую активность. Препарат цитохрома С для инъекций выпускает также ЗАО «Биолек» (Харьков).
ЦИТОХРОМ С В КЛИНИЧЕСКОМ ПРАКТИКЕ
!' -1
1 В качестве лечебного препарата цитохром С впервые в 1953 году применил ВоесИпег, использовав его для лечения больной, отравившейся снотворным (фенодормом). После двух инъекций препарата (30 мг на одну дозу) у больной, находившейся в течение 59 часов в коматозном состоянии, прояснилось сознание, исчез цианоз, восстановились рефлексы. После третьей инъекции наступило выздоровление [7].
При комплексном лечении тифо-паратифозных больных было показано стимулирующее влияние цитохрома С на синтез иммуноглобулинов [51].
Индукторы апоптоза
эптоза —.......
.
? *• пост
Гиперрегуляция транскрипции или
посттрчнсляционная модификация
Конденсация ядра, образование апоптозных телец и гибель клетки
Рис. 4. Схема участия цитохрома С в процессе апоптоза [no JiangX., Wang. X., 2004]
В этой работе продемонстрировано, что уровень иммуноглобулина в в группе больных, леченных цитохромом С, был на 17 % выше по сравнению с лечением традиционным методом. При этом уровень 1дМ и 1дА также пре-вышал исходный уровень, но менее интенсивно. Благодаря стимуляции иммуногенеза на 5-10-й день лечения прекратилось бакте-риовыделение. Положительный эффект цитохрома-С на иммуногенез, по мнению авторов, является результатом его стимулирующего действия на метаболическую активность и тканевое дыхание. Ускорение биохимических процессов в организме усиливает синтез белка, в том числе и иммуноглобулинов. Эти работы вызвали значительный интерес у врачей самого широкого профиля: гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, вирусологов и инфекционистов. Впоследствии был сделан вывод о целесообразности применения цитохрома С при тифо-паратифозных заболеваниях.
■ Таблица 2. Применение цитохрома С при лечении ишемической болезни сердца
Нозологическая форма Разовая доза Лекарственная форма Способ введения Курс’лечения
ИБС 10мг 0,25 %р-р в/в капельно 2 раз/сут 10-14 дней
Острый инфаркт миокарда 0,15-0,6 мг/кг 0,25 % р-р в/в капельно, внутримышечно1-2 раз/сут 5 дней
При анализе причин перинатальной смертности в акушерстве и гинекологии установлено, что смертность внутриутробного плода от гипоксии занимает первое место. Известно, что патологическое течение беременности (токсикозы, перенашивание и др.) сопровождается перерождением плацентарной ткани, нарушением маточно-плацентарного кровообращения и функции плаценты, вызывает остановку поступления лактата и пирувата через плаценту и пуповину. Нередко эти процессы сопровождаются выраженной хронической гипоксией. Установлено, что плацента содержит 6,0-8,0 мг цитохрома С на кг сухого остатка; при тяжелых токсикозах беременности активность цитохрома С и ЦХО значительно снижается. Являясь антигипок-сантом, цитохром С может играть существенную роль в коррекции и лечении вышеупомянутой патологии. Этот способ терапии был осуществлен на практике в 1973 году А.Я. Поляком [52], который представил данные, согласно которым для профилактики и лечения внутриутробной гипоксии плода цитохром С вводили внутривенно (0,5 мг/кг веса) 27 роженицам до и при родах. Выявлено улучшение сердечной деятельности плода в течение часа. По мнению автора, это связано, в основном, с улучшением функции плаценты, а также с непосредственным действием на миокард плода. В последующих публикациях врачей из разных стран было показано, что препарат благоприятно действует при заболеваниях, ведущих к аноксии организма, при состоянии кислородного голодания у новорожденных, при вторичной асфиксии и повреждении центральной нервной системы вследствие родовой травмы у новорожденных.
В хирургии показаны преимущества парентерального введения цитохрома С и гипербарической оксигенации (ГБО) в лечении гнойно-воспалительного процесса челюстно-лицевой области по сравнению с традиционными методами общего лечения и местной обработки ран. Сочетанное применение цитохрома С и ГБО усиливает местную лейкоцитарную реакцию, ускоряет отторжение сенвестров и активирует рост сосудов и нервных окончаний [53]. Восстановление зрелой костной тканы происходит на 7-е сутки, вместо 21-го дня в контроле. Эффективность такого лечения отмечена как в условиях эксперимента при лечении гнойных ран острого остеомиелита нижней челюсти, так и в клинике при лечении больных с флегмонами челюстно-лицевой области.
В 1976 году академик Е.И. Чазов [54] дал теоретическое обоснование применению цитохрома С в
терапевтической практике для лечения сердечной недостаточности и, тем самым, предопределил дальнейшее развитие работ в этом направлении.
В.настоящее время наиболее высокая эффективность цитохрома С в терапевтической практике отмечена при лечении осложнений острого инфаркта миокарда и коррекции гипоксических состояний, связанных с расстройствами мозгового кровообращения и с ишемическими инсультами (табл. 2).
При лечении этим препаратом продемонстрирована положительная динамика ЭКГ, увеличение сердечного выброса, фракции выброса левого желудочка, а также меньшего числа случаев развития левожелудочковой недостаточности. Особо отмечена группа больных с церебро-кардиальными синдромами, у которых после введения препарата происходило снижение церебральных проявлений заболевания и улучшение показателей сердечной деятельности. Цитохром С рекомендовано использовать при комплексной терапии сосудистой патологии мозга [55].
В начале 1970-х гг. значительный вклад в развитие цитохромной терапии в педиатрической практике внесли работы Нарциссова [56-58]. В лечебной стратегии его коллег представлено клинико-цитохимическое обоснование эффективности метаболической коррекции цитохромом С при лечении острой осложненной формы пневмонии у детей раннего (1 мес-2 года) возраста. Установлено, что период восстановления активности ряда ферментов (СДГ, НАДН,НАДФН2-дегидрогеназ) у больных детей после применения цитохрома С наступал в 2-3 раза быстрее, чем у 41 ребенка, леченных традиционно. Анализ клинических параметров в динамике показал, что у больных, получивших цитохром С (независимо от его дозы), улучшение наступило раньше, в частности, исчезновение токсикоза— на 4-6 сут, дыхательной недостаточности и цианоза — на 4-9 сут, нормализация температуры — на 6-8 сут, прибавка в массе тела и улучшение аппетита — на 3-9 сут. Нарастание уровня гемоглобина и нормализация лейкоцитарной формулы происходили на 4-6 сут раньше, чем у больных, получавших традиционную терапию. В результате сократились сроки пребывания в стационаре детей, леченных цитохромом С, в среднем, на 5-9 дней [58].
Таким образом, анализ известных к настоящему времени клинических данных по применению цитохрома С показывает, что наиболее эффективно применение этого препарата у больных обструктивного синдрома, сердечно-сосудистой недостаточности, гипотрофии, рахита, анемии, родовой травмы и ас-
фиксии (в анамнезе). Биохимическим показанием к применению препарата было снижение активности СДГ, НАДН, НАДФН2-Диафораз в нейтрофилах крови. Считается, что действие препарата направлено на восстановление ферментного статуса этих клеток, где цитохром С корригирует процессы клеточного дыхания, нормализует нарушенные процессы окислительного фосфорилирования и энергообеспечения и восстанавливает их иммунологическую активность.
ЦИТОХРОМ С В ТРАНСФУЗИОЛОГИИ И КРИОБИОЛОГИИ
В настоящее время в клинической практике для лечения коматозных, гипоксических состояний организма, а также при нарушении гемопоэза при лучевой болезни и бесплодии наряду с криоконсервированием компонентов крови все чаще используют криобиологические технологии. Большое влияние на этот процесс оказали открытые в 1Э7б|-1976 гг. учеными.Украины механизмы крио-поврехедения биологических структур и функций при исследовании гемопоэтических клеток [59, 60]. Одним иЗ|Таких механизмов является потеря митохондриями цитохрома С [61]. Через 10 лет этот феномен был подтвержден другими исследователями на гепатоцитах [62] и дрожжах [63]. Теоретически обоснованы технологии, способные изменять уровень гомеостаза человека^ Установлено, что благоприятный эффект криоконсервирования связан с селекцией (отбором) устойчивых форм за счет элиминации неустойчивых. Этот процесс сопровождается модификацией цитохимических и цитоэнзимологи-ческих реакций. «Селекция» размороженных клеток костного мозга рассматривается как единый процесс отбора и изменчивости. Было высказано предположение, что в основе изменчивости лежит деконденсация хроматина в охлажденных и криоконсер-вированных клетках. Эта концепция позволила обосновать благоприятное стимулирующее, трансформирующее и мутагенное (с гетерозисным эффектом) свойство криоконсервирования[64-67].
Вышеупомянутая концепция послужила теоретическим обоснованием цитохромной терапии для разработки способов повышения морфофункцио-нальнь'1х свойств охлаждённых и криоконсервиро-ванны^с биообъектов с целью использования их в клинической практике. Как уже отмечалось, одним из основных механизмов криоповреждения является потеря митохондриями цитохрома С с последующим развитием внутриклеточной гипоксии. Поэтому введение цитохрома С должно приводить к ак-тивации жизненно важных внутриклеточных процессов и обеспечивать более высокий уровень гомеостаза. Впоследствии экспериментальные и клинические исследования подтвердили это положение. В 1987 году Логинов и Обозная [68] обнаружили достаточно хороший эффект цитохромной те-
рапии при краниоцеребральной гипотермии (КЦГ). Показано, что в группе животных (крысы линии Вис-тар), которым ежедневно вводили цитохром С (30 мг/кг веса) все животные к концу 6-х суток выжили и подверглирь самосогреванию (в контроле — 100%-я гибель). В лейкоцитах опытных животных обнаружено повышенное значение НСТ-теста и содержания катионных белков (в 2 раза большее) по сравнению с животными, которые не подвергались КЦГ. Проведенный математический анализ показал, что активация бактерицидной и фагоцитарной функции лейкоцитов коррелируете повышением выживаемости животных.
Эти экспериментальные данные были использованы в лечебной: практике Ю.А. Арцыбушевым во 2-й Городской клинической больнице (Харьков), где было пролечено 22 больных с острыми отравлениями (алкоголь, наркотики), находящихся в коматозном состоянии [69]. Контрольную группу составили 30 аналогичных больных, леченных традиционной гипотермией (без цитохрома С). В результате проведенного лечения сократилась продолжительность коматозного состояния и пребывание больного в реанимационном отделении, в среднем, на 3-5 суток. Аналогично былинпролечены 32 больных с ишемической и геморрагической патологиями, находящихся в коматозном состоянии в клинике нейрореани-мационного отделения (МСЧ №1 «Турбоатом», Харьков). После 1-2 инъекций цитохрома С больные вышли из коматозного состояния, включая и тех, кто не поддавался традиционным методам терапии.
М.И. Крамар в 1990 году совместно с врачами роддома № 5 Харькова в качестве стимулятора активности и подвижности спермиев, хранившихся в условиях гипотермии (8’С), использовали цитохром С в пределах 10:6 М. В результате проведенных исследований (около 2000 образцов спермиев) удалось активизировать их подвижность и переживае-мость на 30-32%, что дало возможность повысить фертильность мужских гамет и способствовало увеличению частоты наступления беременности [70]. У всех новорожденных, родившихся после искусственного оплодотворения, отсутствовали признаки асфиксии, гемолитической желтухи и статуса недоношенности, что нередко встречается при использовании традиционных методов.
Положительный эффект действия низких температур и цитохрома С в лечении бесплодия связывают с открытием феномена деконденсирующего эффекта криоконсервирования и активации процессов транскрипции. Позже к подобному заключению пришли и другие исследователи, которые показали положительную связь между деконденсацией хроматина в половых клетках млекопитающих (человека и свиньи) и оплодотворяющей способностью сперматозоидов [71, 72]. Потерю оплодотворяющей способности спермиев мужчин связывают с гиперкон-денсацией хроматина. Таким образом, основываясь на концепции криообновления Обозной [64-66], можно ожидать, что при направленном изменении
ЛЕКЦИИ ДЛЯ ВРАЧЕЙ
морфофункциональных свойств репродуктивных (яйцеклетки) и половых (сперматозоиды) клеток будут получены организмы, с выраженным уровнем функциональной активности, сверхустойчивые к различного вида экстремальным факторам и бактериальной флоре.
С 1973 года благодаря экспериментальным работам В.Д. Каргина и его коллег (ЛНИИ Г и ПК)
[73], цитохром С используется для хранения размороженного костного мозга. Через десять лет, в 1983 году (Львовский НИИ Г и ПК), А.Б. Савчиком успешно проведена трансплантация размороженных клеток костного мозга, обогащенных цитохромом С
[74]. Предварительные исследования показали, что восстановленные с помощью цитохрома С после криоконсервирования (-196’С) и длительных сроков хранения (3-10 лет) клетки костного мозга человека по активности СДГ (тест на функциональную активность) превосходят контроль и сохраняют активность фермента до 15-21 сут (1 сут в контроле). Активность СДГ в клетках эмбриональной печени человека в аналогичных условиях эксперимента сохраняется до 10-21 сут 3 сут в контроле).
Клеточные эксперименты впоследствии были подтверждены на организменном уровне. Так, согласно данным Савушкиной и Цветковой [75], при использовании криоконсервированных спермий сибирского осетра и карпа их жизнеспособность составляла лишь 10-40%, в отличие от свежезаготов-ленных (90-100%). Однако при осеменении икры размороженными спермиями, обработанными цитохромом С, значительно возрос процент выклева личинок икры и их средняя масса. Молодь осетров и карпа также отличалась большей средней массой тела, а также более высоким уровнем гематологических, биохимических и иммунологических параметров.
В настоящее время установлено, что многие геномы млекопитающих, в том числе человека, содержат 20-30 нуклеотидных последовательностей, родственных гену цитохрома С крысы [76]. В 1997 году опубликовано сообщение об идентификации РНК-связанных белков холодового шока (стр) в клетках человека. Было продемонстрировано, что результатом активации матричной активности РНК является повышенная выживаемость клеток животных и человека [77, 78]. Следовательно, перспектива получения более жизнеспособного потомства с помощью криобиологических технологий оправдалась и теоретически, и практически.
Несомненна перспективность цитохромной терапии с использованием криобиологических технологий по сравнению с непосредственным применением цитохрома С. Это обусловлено следующими обстоятельствами:
• Во-первых, низкие температуры регулируют гены, активирующие цитохром С и уровень НАД/ НАДН, определяющий транспортную функцию цитохрома через наружную митохондриальную мембрану [79].
• Во-вторых, при действии низких температур увеличивается концентрация цитохромов и отношение цитохромовС+С-|/А в митохондриях. Это убедительно продемонстрировано на гомогенатах печени [80].
• В-третьих, более длительное воздействие холода приводит к увеличению митохондриогенеза, концентрации цитохромов и появлению митохондрий с новыми свойствами, более устойчивыми к повреждающим факторам. Усиление митохондриогенеза под действием низких температур связано с морфологическими изменениями этих структур — увеличивается объем митохондрий и плотность поверхности митохондриальных крист на объем митохондрий [81, 82]. Иными словами, низкие температуры благоприятно изменяют морфофункциональные свойства митохондрий и их мембран, вследствие чего формируются новые взаимоотношения цитохрома С с митохондриальными мембранами.
• В-четвертых, одной из наиболее существенных транспортных функций цитохрома С является способность его индуцировать пиноцитоз [83]. Пиноцитоз, как активный процесс, связан с жизнедеятельностью цитоплазмы. Активация пиноцитоза обычно ведёт к повышению интенсивности клеточного обмена. Как показали специальные исследования [84], низкие температуры модифицируют клеточные мембраны, облегчая прохождение субстратов, в том числе, цитохрома С, через плазматическую мембрану. Трансформация низкими температурами клеточных мембран и способность фермента к пиноцито-зу — существенные факторы, усиливающие эффект цитохромной терапии на клеточном уровне.
Таким образом, обнаруженные и обоснованные профессором С.Е. Манойловым и его последователями феномены цитохромов на молекулярном уровне получили блестящее подтверждение в цитохромной терапии в современной клинике. Не исключено, что стимулирующее действие цитохрома С на процесс криообновления трансфузионных средств является современной перспективой цитохромотерапии и отражает эффективность цитохромной терапии на молекулярном уровне.
Литература
1. Сидорова Н.Д., Хотянович В.К., Дубровская Л.И. и др. Выделение цитохрома С из сердца крупного рогатого скота в производственных условиях// Лечебные препараты из крови и тканей. —Л.: ЛНИИГиПК, 1974. -С. 124-126.
2. Okunuki К., Kamen M.D., Sekuzu I. Structure and fuktion of cytochromees. — Tokyo: Univ. Tokyo Press, 1967. — 287p.
3. Keilin D. The history of cell respiration and cytochromes. — NY: Cambridge Univ. Press, 1966. —319 p.
4. Lardy H. A., Ferguson S. M. Oxidative phosphorylation in mitochondria //Ann. Rev. Biochem. — 1969. —
Vol. 38.-P. 991-1034.
5. Shibata N., Suto K., Ichimura E. et al. Crystalization and MAD data collection of high-molecular weight cytochrome С from Desulfovibrio vulgaris//Protein Pept. Letters. - 2004. - Vol. 11.N1.-P. 93-96.
6. Tsoneva I., Nikilova S., Georgieva M. et.al. Induction ofapoptosis by electrotransfer of positively charged proteinsas Cytochrome С and HistoneHl into cells// Biochem. Biophys. Acta. —2005. — Vol. 1721, N 1-3. — P. 55-64.
7. Ван-БеккумД. Окислительное фосфорилирование в некоторых радиочувствительных тканях при облучении //Ионизирующие излучения и клеточный метаболизм; пер. с англ. — М.: Иностр. лит., .1958. — С. 104-112.
8. Van Bekkum D. W. Oxidative phosphorylation
in irradiated tissues//Chem. Weekbl. — 1957. —
Vol. 53. - P. 233-238.
9. ScaifeF., Hill B. The uncoupling of oxidative phosphorylation by ionizing radiationin. II. The stability of mitochondria lipids and cytochrome С // Canad. J. Biochem. Physiol. - 1963. - Vol. 41. — P. 1460-1468.
10. Манойлов С. E., Хансон К. П. Влияние экзогенного цитохрома С на окислительное фосфорилирование в митохондриях, выделенных из тканей облученных животных // Вопр. мед. химии. — 1964. — Т. 10, №4,- С. 410-412.
11. Хансон К. П., Манойлов С. Е., Полосова П. Г. Влияние экзогенного цитохрома Сна окислительное фосфорилирование в некоторых органах животных при экспериментальном опухолевом росте и лучевой болезни//Митохондрии. М.:Наука, 1967. — С. 68-71.
12. Хансон К.П. К вопросу о механизме нарушения окислительного фосфорилирования при общем облучении крыс летальными дозами рентгеновских лучей: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Л.: ЦНИРРИ, 1964. - 23с.
13. Манойлов С.Е., Орлова Б.А. Применение спектральных методов исследования для изучения состояния железосодержащих соединений в животном организме при облучении его рентгеновскими лучами // Вопр. радиобиол. — Л., 1960. — С. 152-157.
14. Манойлов С.Е., Нестерова Л. А. Орлова И. А. и др. Действие цитохрома С, галактозы и уридинтрифосфата на рост перевиваемых опухолей // Вопр. онкологии. — 1973. — Т. 19, N9 7. — С. 62-65.
15. Манойлов С.Е., Деркачев Э.Ф. Действие рентгеновых лучей на цитохрома С in vitro //Вопр. мед. химии. — 1965. — Т. 11, № 1. — С. 95-99.
16. Манойлов С.Е. Биохимические основы злокачественного роста. —Л.: Медицина, 1971. —232 с.
17. Валькович А.А., Хансон К.П. Соотношение структурного состояния хроматина и биосинтеза быстрометящихся ядерных РНК в тимусе крыс, подвергнутых общему рентгеновскому облучению// Вопр. мед. химии. - 1976. - Т. 22, №5. - С. 643-648.
18. Дергачев Э.Ф., ХансонК:П. Роль энергетических процессов и интерфазной гибели лимфоидных клеток при воздействии ионизирующей радиации // Влияние радиации на регуляторные процессы
в клетках. //Мат. симп. Пущино, 1978. — С. 67-71.
19. Дергачев Э.Ф., Фомина Э.В., Посохов B.C. Метаболические изменения в тимоцитах
при воздействии радиации и глюкортикоидов ■ и их роль в интерфазной гибели // Интерфазная гибель облученных клеток. — Обнинск: М3 СССР,
1979.-С. 10-13.
20. Слепнева Л.В.,Ханевич М. Д., Зыбина Н.Н. и др. Состояние биоэнергетических процессов в печени и слизистой тонкой кишки при экспериментальном перитоните и возможности их коррекции цитохромом С // Цитохром С и его клиническое применение. -Л.:ЛНИИГиПК, 1990. - С. 27-31.
21. МхитарянЛ.М. Механизм лечебного действия цитохрома С при остром вирусном гепатите В // Эксперим. и клин. мед. — 1987. — Т. 27, № 6. —
С. 585-589.
22. Новиков B.C. Применение цитохрома С для нормализации нарушения резистентности // Цитохром С и его клиническое применение.—Л.: ЛНИИГиПК, 1990. - С. 52-57.
23. NorburyC., Nurse P. Animal cell cycles and their control// Ann. Rev. Biochem. — 1992. — Vol. 6. — P. 441-470.
24. Хансон К. П. Программированная клеточная гибель (апоптоз): молекулярные механизмы и роль
в биологии и медицине //Вопр. мед. химии. —
1997. - Т. 43, № 5: - С. 402-414.
25. Хансон К. П. Роль апоптоза в старении и возрастной патологии //Усп. геронтол. — 1999. —Вып. З. —
С. 103-110.
26. AmiesenJ. С. Programmed cell death and AIDS: from hypothesis to experiment//Immunol. Today. — 1991.-Vol. 13; N 10.-P. 388-391.
27. Bursch W. Cell death by apoptosis: significance for regulation of homeostasis of cell number and its disturbance during cancer development // Growth Regul. and Carcinogenesis. — 1992. — Vol. 2. — P. 327-341.
28. Horvitz H.R. Genetic control of programmed cell death in the nematode Caenorhabditis elegans // Cancer Res. — 1999. — Vol. 59, N 7(Suppl). —
P. 1701-1706.
29. HengartnerM.O., Horvitz H.R. Activation ofC. elegans cell death protein CED-9 by an amino-acid substitution in a domain conserved in Bcl-2//Nature. — 1994. —
Vol. 369, N6478. -P. 318-320.
30. Buttke T.M., Sandstrom PA. Oxidative stress
as a mediator of apoptosis//Immunol. Today. —
1994. -Vol. 15.,-P. 7-10.
31. Compton М. M., Cidlowski J.A. Thymocyte apoptosis:
A model of programmed cell death//ТЕМ. — 1992. — Vol. 3, N 1.-P. 17-23.
32. Nomura M., Nomura N., Newcomb E.W.et al. Geldanamycin induces mitotic catastrophe and subsequent apoptosis in human glioma cells//J. Cell Physiol. —
2004. - Vol. 201, N3.-P. 374-384.
33. Nachshon-KedmiМ., YannaiS., Fares F.A. Induction of apoptosis in human prostate cancer cell line, PC3, by 3,3'-diindolylmethane through the mitochondrial pathway //Brit. J. Cancer. —2004. — I/o/. 91, N 7. —
P. 1358-1363.
34. Chopin V., SlomiannyC., HondermarckH., Le Bourhis X. Synergistic induction ofapoptosis in breast cancer cells by cotreatment with butyrate and TNF-alpha, TRAIL, or anti-Fas agonist antibody involves enhancement of death receptors’ signaling and requires P21(waf1) // Exp. Cell Res. - 2004. - Vol. 298, N 2. -
P. 560-573. .
35. Stahnke K., Mohr A., LiuJ. etal. Identification
of deficient mitochondrial signaling in apoptosis . resistant leukemia cells by flow cytometric analysis of intracellular.cytochrome C, caspase-3 and apoptosis //Apoptosis. — 2004. — Vol. 9, N 4. —
P. 457-465. . .
36. RashmiR., KumarS., Karunagaran D. Ectopic expression ofHsp70 confers resistance and silencing its expression sensitizes human colon cancer cells
to curcumin-induced apoptosis //
Carcinogenesis. — 2004. — Vol. 25, N 2. —
P. 179-187.
37. Budihardjo I., Oliver H., LutterM. etal. Induced apoptosis//Ann. Rev. Cell Dev. Biol. — 1999. — Vol. 15, N2.-P. 269-290.
38. Du C. Y., Fang M., Li Y.C.etal. Cytochrome С//Cell. —
2000. - Vol. 102, N1.-P. 33-42.
39. Parrish J., LiL.L., KlotzK. et.al. Cytochrome С//
Nature. -2000. - Vol. 412. -P. 90-94.
40. WangX.D., Yang C.L., ChaiJ.J. et.al. Cytochrome С// Science. -2001.- Vol. 298. -P. 1587-1592.
41. Nagahara Y., Shinomiya Т., Kuroda S. et.al. Phytosphingosine induced mitochondria-involved apoptosis//CancerSci. —2005. — Vol. 96, N2. —
P. 83-92.
42. Lee H.J., Wang C. J., Kuo H.C. etal. Induction apoptosis ofluteolin in human hepatoma HepG2 cells involving mitochondria translocation of Bax/Bak and activation of JNK//Toxicol. Appl. Pharmacol. —2005. — Vol. 203, N2.-P. 124-131.
43. Ко C.H., Shen S.C., Hsu C.S., Chen Y.C. Mitochondrial-dependent, reactive oxygen species-independent apoptosis by myricetin: roles ofprotein-kinase C, cytochrome C, and caspase cascade // Biochem. Pharmacol. — 2005. — Vol. 69, N 6. —
P. 913-927. i
44. Haga N., Fujita N., Tsuruo T. Mitochondrial aggregation precedes cytochrome С release from mitochondria during apoptosis // Oncogene. — 2003. —
Vol. 22, N 36. - P. 5579-5585.
45. Jiang X., Wang X. Cytochrome С-induced apoptosis // Ann. Rev. Biochem. —2004. — Vol. 73. — P. 87-106.
46. Ващенко В. И. Ингибиторы топоизомераэ как лекарственные средства. Механизм их действия //
Обз. клин, фармакол. лек. тер. — 2003. — Т. 2, № 4. — С. 2-15.
47. АлексееваН.Н., СлепневаЛ.В., СеливановЕ.А. Лечебная эффективность цитохрома С выделенного из миокарда различных видов животных
при геморрагическом шоке // Цитохром С и его клиническое применение. — Л.: ЛНИИГиПК, 1990. - С. 20-24.
48. Андрианова И.Г., Сидорова Н.Д., Селиванов Е.А. Результаты клинического изучения инъекционной и таблетированной формы цитохрома С//
Цитохром С и его клиническое применение. — Л.: ЛНИИГиПК, 1990. - С. 30-37.
49. Балыкова Л.А., Балашов В.П., Костин А.Я., Серпов Л.Н. Влияние цитохрома С биотехнологического производства на течение ранних постокклюзионных и реперфузионных аритмий //Бюлл. эксп. биол. мед. - 1999. —№ 1. — С. 89-91.
50. Кривцова И. М., Алексеева Н. Н. Цитохром С-фосфолипидный комплекс (получение и изучение в эксперименте) //Цитохром С и его клиническое применение. -Л.:ЛНИИГиПК, 1990.-С. 74-78.
51. Мусабаев И.К, Мецкан Т.И., Хамитов М.Х. Применение цитохромов С в комплексном лечении больных тифо-паратифозными заболеваниями: мат. IV съезда гигиенистов, санитарных врачей, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов Узбекистана. — Ташкент: Медицина, 1980. — С. 29-30.
52. Поляк А.Я. Применение цитохрома С для профилактики и лечения гипоксии внутриутробного плода // Физиология и
патология беременности и дети. — Л., 1973. — С. 136-140.
53. Балин В.Н., Лотовин А.П. Применение цитохрома С в оксигенобаротерапии в гнойной хирургии челюстно-лицевой области //Цитохром С и его клиническое применение. — Л.: ЛНИИГиПК,
1990. - С. 65-68.
54. Чазов Е. И., Николаева Л. Ф. Пути воздействия на некоторые метаболические процессы в сердечной мышце при ее недостаточности //Арх. анатомии. — 1976. —№9.— С. 3-8.
55. Основы клинической фармакологии и рациональной фармакотерапии: руководство для практикующих врачей. — М.: Бионика, 2002. — 368 с.
56. Нарцисов Р. П. Проблемы пргнозирования здоровья детей. -М.: НИМИ, 1987. -63 с.
57. Нарцисов Р. П. Цитохимия ферментов
в профпатологии. — М.: Медицина, 1975. — 120 с.
58. ГаджиевА.А., НарцисовР.П., ГасановС.Ш., Гашимова РА. Клинико-цитохимическое обоснование эффективности цитохрома С в метаболической коррекции при осложненной форме острой пневмонии у детей раннего возраста // Педиатрия. — 1990. —
№ 1.-С. 111-112.
59. ЦуцаеваА.А., Гольцев А. Н., Попов Н.Н. и др. Криоиммунология. — Киев.: Наукова думка, 1988. — 188 с.
60. Обозная Э.И., Пушкарь Н. С., Маркова О.П., Панков Е.Я. Цитохимия замороженной клетки. — Киев.: Наукова думка, 1981. — 176 с.
61. Обозная Э.И., Маркова О. П. Некоторые пути восстановления биоэнергетики клеток криоконсервированного костного мозга// Пробл. гематол. — 1976. — № 9. — С. 6—10.
62. Petrenko A. Yu., Subbota N.P. Inhibition on thenactivity of mitochondrial electron transport chain by low temperature: losses of cytochrome С // Cryo-Letters. — 1986. -N 7.-P. 395-402.
63. Mori Yoki, Suzuki Hiroko, Nei Tokio. Freezing ingury in the yeast respiratory system//Cryobiology. —
1986. - Vol. 23, N1.-P. 64-71.
64. Обозная Э.И., Панков Е.Я. Цитохимия костного мозга при криоконсервировании: Атлас. — Киев: Наукова думка, 1989. —256 с.
65. Обозная-Печенежская Э.И., Грищенко В.И., Панков Е.Я. Криобиология обновления: факты и перспективы //Пробл. криобиол. — 1993. —№4.—
С. 11-20.
66. Грищенко В.И., Обозная-Печенежская Э.И.,
Панков Е.Я. Обновление биологических структур и функций с помощью низких температур и криоконсервирова-ния — новое направление
в биологии и медицине // Пробл. криобиол. —
1995. —№ 4. — С. 3-10.
67. Грищенко В.И., Обозная Э.И., Панков Е.Я. Качественное обновление: свойства клеток после криоконсервирования //Усп. совр. биол. — 1989. —
Т. 108, № 2. — С. 299-309.
68. Логинов С. И., Обозная Э. И. Прогностическое значение цитохимических показателей клеток костного мозга при пролонгированной краниоцеребральной гипотермии //Сб. науч. тр. Казахстанского пед. ин-та им. Аба я. - Алма-Ата,
1987.-С. 68-71.
69. Логинов С.И., Обозная Э.И. Способ лечения экзотических ком // Патент № 1822761. — 1993. — Бюлл. №21.
70. Грищенко В.И., Алексеевская Э.И., Крамар М.И. Способ повышения жизнеспособности охлажденных
спермиев человека //Патент № 38000А Украина. —
2001. —Бюлл. №4.
71. Chart P.L., Fredway D.R. Assotiation of human sperm nuclear decondensation and in vitro penetration ability// J. Androl. - 1992. - Vol. 24, N2.-P. 77-81.
72. Roure D., Hamamah S., Nicolle J. C., Lansac J.
Chromatin alterations induced by freeze-thaving influense the fertilising ability of human sperm //
J. Androl. - 1991. - Vol. 14, N5.-P. 328-335.
73. СлепнёваЛ.В., МанойловС.Е., Криворучко Л.И.
Исследование механизма лечебного действия цитохрома С/В кн.: Лечебные препараты из крови и тканей. — Л.: ЛНИИ Г и ПК, 1974. -С. 131-133.
74. Обозная Э.И., СавчикА.П. Способ подготовки замороженных клеток костного мозга к использованию // Патент № 1441504. — 1993. — Бюлл. № 21.
75. Савушкина С. И., Цветкова Л. И. Рост молоди карпа, полученной с применением криоконсервированной спермы в условиях водоема, охладителя ГРЭС// Рыбное хозяйство. Сер. Аквакультура. — 1994. —
№ 1.-С. 17-18.
76. BrounG.G., Simpson М.V. Novel seaturese of animal mtDNA evalution as shown byseguenses of two rat cytochrome oxidase subunit genes //Proc. Nat. Acad. Sci. Biol. Sci. - 1982. - Vol. 79, N10.-P. 3246-3250.
77. Danno S., Nishiyama H., HigashisujiH. et.al. Increased transkript level of Rbm3, a member of the glicine-rich RN-binding protein femility, in human cells in response to cold stress // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1997. - Vol. 236, N3.-P. 804-807.
78. Danno S., Itoh K., Matsuda Т., Fujita J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein,
in Sertoli cells of cryptorchid testis //Amer. J. Pathol. —
2000,- Vol. 156, N5.-P. 1685-1692.
79. Мохова C.H., Жйгачева И: В. Концентрация цитохромов в митохондриях гомогената печени при адаптации к холоду // Митохондрии. Аккумуляция энергии и регуляция ферментативных процессов. — М.: Наука, 1977. — С. 138-143.
80. Storey К.В. Freeze-induced gene expression in vertebrates//35th Ann. Meeting of Soc.
Cryobiology.— Pittsburg, USA, 1998. — P. 167.
81. Nicolson D. W., Cohler H., Neupert W. Import of cytochrome С into mitochondria: cytochrome С heme lyase//Eur. J. Biochem. — 1987. — Vol. 164, N 1. —
P. 147-157.
82. СеравинЛ.Н. О различиях механизмов пиноцитоза и фагоцитоза (на примере A. Proreus)//
Цитология. — 1968. — Т. 10, № 4. — С. 506-526.
83. Dumont М. Е., Chlichter I. V., Cardillo Т. S. et al. Cys 2 encodes a factor involved in mitochondrial import of yeast cytochrome С//Mol. Cell. Biol. — 1993. —
Vol. 3,N 10. - P. 6442-6451.
84. HuhJ.E., KangK.S., Ahn V.S. et al. Milabris phalerlata induces apoptosis bycaspase activation following cytochrome с release and Bid cleavage //Life Sci. — 2003. - Vol. 73, N17.- P. 2249-2262.
85. Ben-AriZ., Schmilovotz-Weiss H., BelinkiA. etal. Quanculatig soluble cytochrome с in liver disease
as a marker of apoptosis // J. Intern. Med. — 2003. — Vol. 254, N2.-P. 168-175.
86. Зинченко В.А. Терапия гипоксических нарушений при расстройствах мозгового кровообращения
и применение цитохрома Свих коррекции // Цитохром С и его клиническое применение. — Л.: ЛНИИГиПК, 1990. -С. 39-41.
