CC BY
51
УДК 616.155-097
ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПОПУЛЯЦИОННОГО СПЕКТРА ИММУННЫХ КЛЕТОК КРОВИ И СЛЮНЫ У ЗДОРОВЫХ МОЛОДЫХ ЛЮДЕЙ
Э.Х. Рахматулина*, С.Н. Теплова**, С.А. Коченгина***, Н.Д. Альтман** *Уральское отделение Российской Академии наук,
**Челябинская государственная медицинская академия, ***Челябинская детская областная больница, г. Челябинск
Изучен популяционный состав иммуноцитов слюны на основе авторского метода цитофлуорометрического анализа клеток, экспрессирующих линейный дифференцировочный рецептор СВ45+. Показаны принципиальная возможность применения данного метода для оценки мукозального иммунитета. Результаты цитофлуориметрического анализа состава иммуноцитов слюны предлагается использовать в качестве нормативных при изучении мукозального иммунитета у молодых лиц.
Ключевые слова: мукозальный иммунитет, спектр иммуноцитов слюны, цито-флуориметрический анализ.
Введение. В настоящее время метод проточной цитофлуориметрии является общепринятым для определения популяционного и субпопуляци-онного спектра лимфоцитов крови. До сих пор этот метод не применялся для оценки спектра иммуноцитов слюны. Особенностью современных аппаратных методов иммунологического анализа является их высокая специфичность и чувствительность, возможность регистрации большого числа событий, что позволяет анализировать состав клеток при небольшом их количестве в единице объема изучаемой биологической жидкости [4].
Авторами данной публикации разработан метод определения спектра иммунных клеток слюны (номер патентной заявки 2008120724, приоритет от 23.05.08).
Целью настоящего исследования было цито-флуориметрическое определение популяционного спектра иммунных клеток крови и слюны у молодых лиц, проживающих на Южном Урале.
Материалы и методы исследования. Всего в исследование включено 42 здоровых человека в возрасте от 18 до 30 лет. Средний возраст обследуемых 20,5 года, женщин было 13 человек, мужчин 29. У 11 человек определяли популяционный спектр лимфоцитов крови. Мужчин в группе было 4 и женщин 7 человек, средний возраст составил 20 лет.
Критериями включения служили:
- постоянное проживание в регионе Южного Урала;
- возраст от 18 до 21 лет;
- отсутствие острых или обострений хронических заболеваний;
- отсутствие иммунопатологии;
- отсутствие заболеваний слизистой оболочки ротовой полости.
Критерий исключения:
- несанированные заболевания зубов.
Осмотр ротовой полости стоматологом проводился непосредственно перед взятием исследуемого материала. Слюну забирали у здоровых лиц в соответствии с критериями включения и исключения, принятыми в данной работе. Забор слюны проводили утром натощак, через 10 минут после полоскания ротовой полости водой в сухие пластиковые флаконы без стимуляции слюноотделения. Кровь для анализа популяционного состава лимфоцитов забирали из вены утром натощак. Иммунологические методы исследования: Определение спектра лимфоцитов крови проводили по стандартной методике на проточном цитофлуориметре ВБ БАСБСапШ II с набором моноклональных антител той же фирмы. Подготовка исследуемой слюны и определение клеточного состава иммуноцитов с помощью проточного цито-флуорометра «BD БАСБСапШ II» проводилось по методике, разработанной С.Н. Тепловой, С.А. Ко-ченгиной, Э.Х. Рахматуллиной и др. (2008). Характерной чертой клеточного состава слюны является присутствие в ней не только иммунных клеток, но и эпителиоцитов. Для отличия иммунных клеток от эпителиоцитов использовали линейный дифференцировочный СВ45+ маркер. Другой особенностью клеточного состава слюны является присутствие в ней большого числа нежизнеспособных клеток и клеточного детрита, что требует специальной подготовки проб с помощью отмывочной технологии с использованием специальной среды (КРМ1 с бикарбонатом).
Определение популяционного спектра жизнеспособных иммуноцитов в слюне, экспрессирующих линейный СВ45+ мембранный антиген, проводили
на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II. Для оценки жизнеспособности клеток использовали витальный краситель 7-AAD. Для анализа CD-маркеров применяли моноклональные антитела фирмы Becton Dickinson, серии MultiTest с использованием четырех меток следующими флуоресцентными красителями: Fluorescein izotyocyanat (FITC), Phycoerytrin (PE), Perpidin chlorofhyll protein (PerCP), Allophycocyanin (APC). Использовался оптимизированный лизирующий раствор той же фирмы в рабочем разведении. Во всех случаях проводилась постановка негативного изотипиче-ского контроля [6].
Число жизнеспособных клеток, экспрессирующих общелейкоцитарный линейно-ассоцииро-ванный дифференцировочный антиген CD45+, определяли с помощью метки CD45APC и красителя 7-AAD. Среди популяций иммуноцитов подсчитывали: гранулоциты (CD45+CD13+CD14~), моноциты (CD45+ CD14+ CD 13“), Т-цитотоксические лимфоциты (CD45+ CD3+ CD84), Т-хелперы (CD45+CD3+), NK-клетки (CD45+ CD 56+16+) [5].
Статистическая обработка проведена применением программного комплекса Statistica for Windows версия 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США). В таблицах представлены данные в виде средней арифметической (М), доверительного интервала (195) универсальной средней - медианы (Me) и меж-квартильного интервала (Q25-Q75).
Результаты и обсуждение. Полученные результаты определения основных популяций лимфоцитов крови у обследуемых здоровых молодых лиц, проживающих на Южном Урале, представлены в табл. 1, в которой приведены общее число наблюдений (п), средняя арифметическая (М) и
ний этих показателей во всех случаях перекрывают друг друга [1].
Нами впервые разработан и использован метод цитофлуориметрической оценки иммуноцитов слюны.
У-Ч О Н
о »о— о CN -
7 25/03/09-Saliva
CD45+
I 11ММ|-1 11111И|-1.till ГГГ[—П 1111П|—г
102 10а 10і 10s CD45 АРС-А
Клеточный состав слюны: иммуноциты (СР45+), эпителиальные и другие клетки (С045"), клеточный детрит (дебрис)
Рисунок демонстрирует результат цитофлуо-риметрического определения всей совокупности клеток слюны. Как следует из рисунка, в ротовой полости обнаруживаются в максимальном количестве С045- клетки, к которым относятся в основном эпителиоциты. В большом количестве в слюне представлены клетки, экспрессирующие линейный дифференцировочный маркер С045+, включающие все иммуноциты: гранулоциты, макрофаги, популяции лимфоцитов. Достаточно большую область на графике занимает клеточный дебрис, т.е. фрагменты разрушенных клеток ротовой полости.
Результаты цитофлюориметричекого определения спектра лимфоцитов крови у молодых людей, проживающих на Урале
Таблица 1
Показатель п М І95 Me Q25-Q75
CD3 % 11 74 68,5-77,3 72,7 69,6-78,1
CD4 % 11 43 37,2-48,3 47,4 37,4-49,4
CD8 % 11 28 19,3-47,8 26,2 23,15-35,5
CD4/CD8 11 1,6 1,22-2,12 2,0 1,1-2,0
CD19 % И 11 9,3-13,9 10,95 9,48-14,3
CD( 16+56+) % 11 12 7,87-16,7 11,3 7,2-17.7
интервал достоверности (195), а также медиана (Me) и интерквартильный размах (СЬз-СЬз)-
Далее для сопоставления полученных данных с результатами других авторов в табл. 2 приведены материалы цитофлюориметрического определения спектра лимфоцитов крови, опубликованные разными исследователями из разных регионов, вместе с полученными нами показателями.
Как следует из табл. 2, процентное содержание основных популяций лимфоцитов крови (CD3, CD4, CD8, CD 19, CD 16/56) при цитофлуоримет-рическом определении, по данным разных лабораторий, практически совпадает, интервалы колеба-
Далее в слюне было определено число жизнеспособных С045+ клеток (табл. 3) с помощью красителя 7-А АО.
Средние показатели численности популяций жизнеспособных иммуноцитов в слюне (средняя арифметическая и интервал достоверности, а также медиана и квартальный размах), у 42 молодых людей, которые были определены с помощью проточной цитофлуориметрии, приведены в табл. 3. Среди жизнеспособных С045+ клеток преобладающими в слюне здоровых молодых людей были популяции лейкоцитов, экспрессирующих маркеры гранулоцитов (С045+С013+), количество кото-
Проблемы здравоохранения
Таблица 2
Сопоставление результатов цитофлюориметричекого определения спектра иммунных клеток крови у молодых людей Южно-Уральского региона с результатами других исследователей
Показатель
Интервал
колебаний
показателей
Интервал
колебаний
показателей
Интервал
колебаний
показателей
Интервал
колебаний
показателей
CD3%
56-86
60-80
59-85
63-82
CD4%
33-58
33-50
29-57
29-53
CD8%
13-39
16-39
11-38
18-43
CD4/CD8
1,4-2,5
1,2-2,0
1,5-2,6
1,22-2,12
CD19%
5-22
5-22
6,4-23
7-18
CD (16+56) %
5-26
5,6-31
5-22
CD 16%
3-20
CD56%
5-25
Литературный
источник
Laurence J., et aL, 1993 [8]
Луговская C.A. и др., 2005 [2]
Kretowski A., et al., 1999 [7]
Данные
настоящего
исследования
рых было равно 80,95 %. Достаточно представительной была популяция макрофагов (С045+ СОМ4), медиана которой составила 20,65 % от жизнеспособных иммуноцитов. Минимальной была доля лимфоцитов в слюне, процент которых составлял 0,8 от общего количества жизнеспособных С045+клеток.
Распределение субпопуляций лимфоцитов оценивалось в пределах общей популяции жизнеспособных лимфоцитов, число которых принималось за 100 %. Оказалось, что доля Т - лимфоцитов (CD45+ СВЗ4) в слюне составила 19,5 %, Т хелперов (С045+С04+) - 19,7 %, Т цитотоксических клеток (С045+С084) - 0,65 %. Соотношение Т - хелперов и Т - цитотоксических клеток было равным 30,3. Число В-лимфоцитов (СБ45+СВ19+) равным 2,01 % [3].
В целом, общая закономерность распределения лимфоцитов в слюне напоминает распределение соответствующих субпопуляций в крови: максимально в изучаемой биологической жидкости представлены Т лимфоциты, из них Т хелперы и в меньшей степени Т цитотоксические клетки и В лимфоциты. Особенностью популяционного состава лимфоцитов слюны является более низкое содержание Т клеток и Т хелперов, чем в крови, очень низкое количество Т цитотоксических лимфоцитов и соответственно высокий иммунорегу-ляторный индекс - соотношение СВ4/СВ8 клеток, достигающий 30,3.
Таким образом, в настоящее время в иммунологии стандартным методом оценки системного
Спектр иммунных клеток слюны у молодых людей, проживающих на Южном Урале (п = 42)
Таблица 3
Показатель М І95 Me (Q25-Q75)
Число жизнеспособных CD45+ клеток в % от общего числа клеток слюны 49,3 37,4-61,2 48,2 38,7-58,7
CD45 +CD13+ в % от общего числа жизнеспособных CD45+ клеток слюны 74,41 52,00-95,00 80,95 61,00-93,10
CD45 +CD14 +в % от общего числа жизнеспособных CD45+ клеток слюны 20,3 9,6-40,0 20,3 19,1-21,0
Число лимфоцитов в % от общего числа жизнеспособных CD45+ клеток слюны 0,8 0,2-3,6 0,6 0,2-1,3
CD45 + CD3+ в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 17,8 17,6-20,0 19,5 19,2-19,7
CD45 +CD4+ в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 15,6 13,2-20,0 19,7 17,4-19,8
CD45 +CD8 +в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 1Д 0,50-2,20 0,65 0,08-1,48
CD4/CD8 в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 13,9 9,0-26,4 30,3 13,3-217,5
CD45 +CD19 +в % от общего числа жизнеспособных лимфоцитов слюны 2,2 1,0-4,0 2,0 1,5-2,4
CD45+ CD(16+56+) в % от общего числа CD45+ жизнеспособных клеток слюны 5,6 1,4-14,6 1,8 1,1-11,5
иммунитета является определение показателей крови, для чего используются самые современные технологии, включая метод проточной цитофлуо-риметрии для анализа популяционного состава лимфоцитов крови [9]. Этот метод до сих пор не нашел широкого применения для оценки спектра иммуноцитов других биологических жидкостей организма, в частности для анализа клеточного состава слюны. В то же время изучение особенностей мукозального иммунитета, содержания иммуноцитов в секретах, омывающих слизистые оболочки, которые являются основными входными воротами для поступления различных микробных агентов в организм, представляет теоретический и практический интерес, т.к. имеются топические особенности ответа мукозоассоциированной лимфоидной ткани на различные антигены. Изучение этих особенностей делает необходимым разработку аппаратных методов анализа клеточного и молекулярного состава различных биологических жидкостей. В данной статье приведено содержание иммуноцитов в крови и в слюне молодых людей, проживающих на Южном Урале, по материалам проточной цитофлуориметрии слюны, что можно использовать в качестве норм для оценки иммунных параметров слюны.
Литература
1. Зуева, Е.Е. Иммунофенотипирование в диагностике острых лейкозов / Е.Е. Зуева // Российский медицинский журнал. — 2003. — Т. 4. — С. 471-478.
2. Луговская, С А. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов / С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, Н.Н. Тупицин. - М., 2005.
3. Симонова, А.В. Фенотип лимфоцитов крови при воспалительных заболеваниях человека / А.В. Симонова. -М.: ИНТО, 2001.
4. Чередеев, А.Н. CD-маркеры в практике клинико-диагностических лабораторий / А.Н. Чередеев, Н.К. Горлина, И.Г. Козлов // Клиническая лабораторная диагностика. — 1999. — Мб. -С. 25-31.
5. Flow cytometry analysis of OKT4 epitope deficiency in South African children / E.J. Hughes, E.A. Goddard, P. Bouic, D. W. Beatty // Clin Exp Immunology. -1994. -№98 (3). — P. 526.
6. Immunobiology, б-th edition // Garland Science. -New York and London, 2005.
7. Analysis of recently activated, memory and naive lymphocyte T subsets in the peripheral blood of patients with Graves' disease and insulin-dependent diabetes mellitus / A. Kretowski, J. Mysliwiec, D. Turo-wski, I. Kinalska // Rocz Akad Med Bialymst. - 1999. -У. 44. -P. 226-234.
8. Laurence, J. Т-Cell subsets in Health, Infectious Disease, and Idiopathic CD 4+ T Lymphocytopenia / J. Laurence // Annals of Internal Medicine. — 1993. - V. 119 (1). - P. 55-62.
9. Lymphocyte subset reference ranges in adult Caucasians / T. Reichert, M. De Bruyere, V. Deneys et al. // Clin Immunol Immunolpathoi. - 1991. - V. 60. -P. 190-208.
Поступила в редакцию 18 декабря 2009 г.
