CC BY
224
УДК: 577.152.32
ЦЕЛЮЛОЗОДЕГРАДУЮЧІ СИСТЕМИ МІКРООРГАНІЗМІВ: БІОСИНТЕЗ, ВЛАСТИВОСТІ ТА СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ОСОБЛИВОСТІ
БОРЗОВА Н. В., ВАРБАНЕЦЬ Л. Д.
Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Огляд присвячено ензиматичним системам мікроорганізмів, що забезпечують біодеградацію целюлози. Розглядаються питання класифікації ендо-, екзоглюканаз та Р-глюкозидаз, регуляції їх біосинтезу в мікробній клітині, загальних властивостей та умов виділення й очищення. Особливу увагу приділено порівнянню целюлозодеградуючих систем аеробних та анаеробних мікроорганізмів, їхнім структурним та функціональним особливостям. Наведено дані щодо сучасних уявлень про механізми біоде-струкції целюлози.
Ключові слова: целюлази, деградація целюлози, властивості, структура та функції целюлаз, механізм дії.
Діяльність цивілізованого суспільства призводить до накопичення відходів, зокрема целюлозовмісних матеріалів, частка яких у промислових та комунальних відходах постійно зростає і на сьогодні в розвинених країнах досягає 50% від загальної кількості [1]. Проблема їх утилізації посідає провідне місце в галузі екології та охорони довкілля. Біотехнологічні методи перероблення й утилізації відходів, які містять лігноцелюлозу, є найбільш прийнятними з екологічних та економічних міркувань. Для цього потрібно оцінити здатність різних мікроорганізмів до деградації природних рослинних матеріалів. Умовно деградація лігноцелюлозних субстратів можна розділити на три стадії: 1) утилізація легкозасвоюваних речовин (вуглеводів тощо); 2) розклад целюлози; 3) деструкція лігніну.
Біодеградацію целюлози — найбільш поширеного на землі біополімера, якому належить центральне місце в кругообігу органічного вуглецю, здійснюють целюлази. Природними продуцентами целюлаз є багато організмів як прокаріотичного, так й еукаріо-тичного походження. Основними мікроорганізмами, що продукують целюлази, є гриби, збудники м’якої та бурої гнилі, а також різні види аеробних і анаеробних бактерій. До ензимів целюлазного комплексу належать ендо-1,4-в-глюканази (ЕС 3.2.1.4), екзоце-
лобіогідролази (ЕС 3.2.1.91), а також в-глю-козидази (ЕС 3.2.1.21) та ендо-в-1,4-глюка-нази, екзоцелобіогідролази (ЕС 3.2.1.91). Целюлолітичні системи, склад і активність їхніх окремих компонентів, що продукуються різними мікроорганізмами, варіюють у досить широких межах. На цей час найперспектив-нішими продуцентами целюлаз з погляду промислового використання є гриби таких родів: Aspergillus, Coriolus, Eupenicillium, Fusarium, Penicillium, Phanerochaete, Physa-rium, Sporotrichum, Trichoderma, Verticil-lium та ін. Серед грибів, здатних розщеплювати кристалічну целюлозу, тільки деякі продукують повні позаклітинні целю-лолітичні системи (ендо-, екзоглюканази та в-глюкозидази), серед них — Trichoderma viride, T. reesei, T. koningii, Penicillum funicu-losum, Fusarium solani. Для культуральної рідини більшості інших грибів характерна відсутність екзоглюканази, тобто ці гриби можуть деградувати тільки аморфні форми целюлози.
Розповсюдження целюлозолітичних ензимів у природі
Природні продуценти целюлаз є серед багатьох організмів як прокаріотичного, так і еукаріотичного походження. Ендо-в-1,4-глюканази ряду бактерій та грибів поряд з іншими гідролітичними ензимами в основному
беруть участь у деградації природної целюлози. Виділяють особливий клас організмів — бактеріальних та грибних фітопатогенів, які реалізують свою целюлазну активність на перших етапах атаки рослин шляхом гідролізу рослинної клітинної стінки [2]. Функції целюлаз у рослині значно ширші та складніші, ніж просто деградація целюлози. У рослинах активація ендо-^-1,4-глюканаз відбувається на різних етапах росту та розвитку, однак механізми участі целюлаз у життєдіяльності рослин до кінця ще не з’ясовано.
Целюлозолітичні ензими продукуються багатьма бактеріями та грибами — аеробними й анаеробними, мезо- та термофільними [3, 4]. Проте, лише незначна кількість грибів і бактерій синтезують високі рівні позаклітинної целюлази, яка здатна до гідролізу кристалічної целюлози [5, 6]. На цей час найбільш дослідженими є целюлазні системи аеробних грибів T. viride, T. reesei, P. pinophilum, Sporotrichum pulverulenlum, F. solani, Talaromyces emersonii і T. koningii [7]. Нещодавно було виділено інші мікроорганізми, зокрема теплолюбні аеробні гриби ( Sporotrichum thermophile, Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophile, Humi-cola insolens), мезофільні анаеробні гриби (Neocallimastix frontalis, Piromonas communis, Sphaeromonas communis), мезо- і термофільні аеробні бактерії (Cellulomonas sp., Cellvibrio sp., Microbispora bispora і Thermo-monospora sp.), анаеробні бактерії (Aceti-vibrio cellulolyticus, Bacteroides cellulosol-vens, Bacteroides succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens і Clostridium thermocellum), актиноміцети (Thermo-monospora fusca), які також здатні активно продукувати целюлази [7]. Серед перелічених мікроорганізмів особливий інтерес становлять термофільні продуценти через їхню здатність синтезувати термостійкі ензими, які загалом стійкі до впливу жорстких умов середовища, зокрема кислих і лужних значень pH і температури до 90 0C. Відомими термофільними целюлозолітичними мікроорганізмами є C. thermocellum, T. fusca, T. auarantiacus S. thermophile, H. insolens і C. thermophile [8-10]. Цим мікроорганізмам також притаманна здатність до гідролізу низки субстратів з мінімальним ризиком забруднення патогенною мікрофлорою.
Визначення целюлазної активності
Різнорідність целюлозних субстратів разом зі складністю целюлозолітичних комп-
лексів, що продукуються різними мікроорганізмами, спонукали до розроблення різних методів визначення целюлолітичної активності. Значні відмінності у природі субстратів, варіації у методах визначення різних целюлазних компонентів та синергізм дії цих компонентів значно ускладнювали порівняння результатів, одержаних у різних лабораторіях. Тому в 1984 р. Комісія IUPAC з біотехнології видала методичні рекомендації щодо стандартів визначення целюлазної активності [11]. Однак запропонований перелік методик не цілком задовольнив ензимологів, оскільки не дозволяв оцінювати всі аспекти специфічності дії целюлаз.
Wood і Bhat [12] провели аналіз методів визначення целюлазної активності, що їх використовують у дослідженні грибних це-люлаз, з метою виявлення переваг і недоліків різних методів. Результати їхньої роботи підсумовано в табл. 1.
Індукція та регуляція продукції целюлаз
Целюлази належать до індуцибельних ензимів. Усі вивчені на цей час продуценти дають найвищий рівень активності під час вирощування на целюлозі [6, 13, 14]. Целобіоза, лактоза та софороза також здатні індукувати синтез повних та неповних це-люлазних комплексів у деяких мікроорганізмів [15]. Синтетичні речовини, такі як палмітат, ацетатний ефір дисахаридів і три-целобіози також можна використовувати для підвищення синтезу целюлаз [13]. Факт високої індукуючої здатності целюлози є дуже цікавим, оскільки цей субстрат, що не є розчинним, не потрапляє у мікробну клітину, однак регулює та індукує синтез целюлаз.
На сьогодні відомо, що в клітині присутній незначний конститутивний рівень целю-лазної активності, який забезпечує первинний гідроліз целюлози до розчинного вуглеводу [16]. Саме цей вуглевод і є справжнім індуктором, який прямо або опосередковано впливає на ДНК, що спричиняє експресію гена, який кодує синтез целюлаз. Так, було показано [17], що конідіально зв’язана цело-біогідролаза Trichoderma гідролізує целюлозу з вивільненням целобіози та целобіоно-8-1,5-лактону, які проникають у міцелій та індукують синтез целюлаз. Разом із цим встановлено, що целобіоза здатна індукувати синтез целюлаз T. viride тільки у високій концентрації (1% і більше) або в присутності таких сурфактантів, як наприклад Tween-80 [18]. Також Garcia-Martinez зі співавт. [19]
Таблиця 1. Субстрати та методи визначення целюлазної активності
Ензим Субстрат Методи та параметри, за якими оцінюють реакцію
Загальна целюлазна активність Бавовняне волокно 1. Оцінка залишку целюлози [59] 2. Залишки редукуючих вуглеводів [60] 3. Зменшення маси [61] 4. Зменшення міцності розтягнення [61]
Фільтрувальний папір Гідроцелюлоза Авіцел та Солка Флок 1. Залишки редукуючих вуглеводів [60, 62]
Забарвлений Авіцел [58] 1. Залишки забарвлених розчинних фрагментів [12]
Екзо-1,4^Б-глюканаза (целобіогідролаза, екзоцелюлаза, авіцелаза) Авіцел Гідроцелюлоза Забарвлений Авіцел [58] 1. Залишки редукуючих вуглеводів [63] 2. Залишки забарвленої целобіози [12]
Аморфна целюлоза [58] 1. Залишки редукуючих вуглеводів [63]. 2. Зниження мутності [64]
Заміщені та незаміщені целоолігосахариди 1. Зменшення редукуючої здатності [63] 2. Аналіз за допомогою ВЕРХ [36]
Ендо-1,4^Б-глюканаза (ендоглюканаза, КМ-целюлаза, ендоцелюлаза) КМ-целюлоза Гідроксіетил-целюлоза 1. Зменшення редукуючих вуглеводів [63] 2. Зниження в’язкості [12]
Заміщені та незаміщені целоолігосахариди 1. Зменшення редукуючої здатності [63] 2. Аналіз за допомогою ВЕРХ [36]
Бавовняне волокно Аморфна целюлоза [58] 1. Зростання лужності [65] 2. Залишки редукуючих вуглеводів [63] 3. Зниження каламутності [64]
¡З-Глюкозидаза або целобіаза Целобіоза Целоолігосахариди 1. Залишки глюкози [12] 2. Зменшення редукуючої здатності [63]
о- або «-нітрофеніл-Р^-глюкозиди 1. Залишки о- або «-нітрофенолу [12]
повідомляють, що целобіоза в концентрації
0,2% індукувала продукцію КМ-целюлази і забезпечувала синтез найвищого рівня целюлаз у присутності 1% целобіози у C. ther-mocellum.
Загальновідомим є факт, що продукти трансглікозилювання целобіози є справжніми індукторами целюлаз у T. reesei [13]. Також показано, що софороза ф-1,2-глюкобіоза), яка присутня у зразках глюкози, є ефективним індуктором целюлази у T. reesei та інших видів Trichoderma, навіть у концентрації 0,3 мг/мл, хоча й не індукує целюлазну активність в інших грибів і мутантного штаму T. reesei QM 9414 [20]. Дослідження з використанням інгібіторів синтезу протеїну свідчать, що регуляція утворення це-люлазних ензимів відбувається на трансляційному рівні [21].
Катаболітна репресія — інший механізм, який, як відомо, регулює синтез целюлаз у бактеріях та грибах. У даному разі кінцевий продукт гідролізу целюлози, контактуючи з клітинними протеїнами, утворює
комплекс, який взаємодіє зі специфічним геном на рівні транскрипції та пригнічує синтез целюлаз. Вуглецева катаболітна репресія присутня в E. coli [22], S. cerevisiae [23] і C. thermocellum [24]. Проте Canevascini зі співавт. [25] повідомляють, що синтез целю-лаз регулюється як на рівні індукції, так і катаболітною репресією у S. thermophile. Доказом наявності катаболітної репресії є той факт, що целюлази не утворюються під час вирощування мікроорганізмів на глюкозі, гліцеролі та інших вуглецевих джерелах, які беруть участь у вуглеводному метаболізмі. Однак Messner зі співавт. [26] показали, що введення глюкози у процесі вирощування культури Т. reesei зменшує на 40% синтез тільки 1,4-Р^-глюкан целобіо-гідролази І (ЦБГ), а продукування інших це-люлозолітичних ензимів триває ще протягом 40 год. Оскільки немає доказів того, що саме глюкоза або якийсь катаболіт фактично регулює транскрипцію целюлазних генів, Kubicek рекомендував використовувати термін «катаболітна репресія» [27]. Було
встановлено, що О-глікозилювання целюлаз, яке має місце в ендоплазматичному ре-тикулюмі, може відповідати за секрецію целюлаз у Trichoderma [27]. Оскільки відзначається зниження активності доліхол-фосфат-манозо-синтетази, ключового ензиму шляху О-глікозилювання T. reesei, під час вирощування культури на глюкозі, залишається відкритим питання, що регулює глюкоза — синтез чи секрецію целюлаз. У разі Verticillium albo-atrum позаклітинна секреція ензиму стимулювалася шляхом лімітування вуглецевого живлення. При цьому зменшення продукції целюлаз відбувалось на фоні високої швидкості росту культури [28]. У C. thermocellum швидкий ріст на целобіозі супроводжувався зниженням продукції целюлаз, на відміну від вирощування на кристалічній целюлозі [24]. Однак Bhat зі співавт. [8] не відзначали зменшення швидкості росту, ендоглюканазної або целюлаз-ної активності в разі вирощування C. thermocellum на целобіозі.
Було показано, що кінцеві продукти гідролізу кристалічної целюлози можуть виступати інгібіторами синтезу целюлаз у рубцевого гриба Neocallimastix frontalis RK21 [29]. Зростання швидкості гідролізу бавовни на 82% спостерігалось у N. frontalis RK21 у присутності Methanobrevibacter smithi. Останній використовує кінцеві продукти гідролізу, солі мурашиної кислоти та Н2 як субстрати, зменшуючи тим самим інгібуючий вплив продуктів гідролізу бавовни на целюлази [29]. Хоча вважають, що індукція, катаболітна репресія, інгібування продуктом та лімітування вуглецевого живлення регулюють механізм синтезу целюлаз у бактерій та грибів, на молекулярному рівні це питання потребує детального дослідження.
Біохімічна характеристика та очищення компонентів мікробних целюлазних комплексів
За сучасними уявленнями, більшість це-люлозолітичних ензимів є модульними мультидоменними протеїнами, що містять три функціонально різні елементи (рис. 1): каталітичний домен (КД), целюлозозв’язу-вальний домен (ЦЗД) та лінкер, що їх об’єднує [30]. Окрім цих основних фрагментів у структурі целюлаз різного походження можуть бути присутні й інші елементи, включаючи другий КД, фібронектин-ІІІ-подібні домени, повторювані гідрофобні послідовності так званого когезиндокерино-
вого типу тощо [31]. Як правило, кожен з ензимів целюлазного комплексу представлений рядом множинних форм, що є продуктом як експресії різних генів, так і посттранс-ляційної модифікації — обмеженого протеолізу та (або) деглікозилювання. Ці форми часто мають близькі біохімічні характеристики, що значно ускладнює отримання їх в очищеному вигляді.
Рис. 1. Модель целюлази T. fusca, що базується на PD-структурі 1JS4
Ендоглюканази є найбільш дослідженими компонентами целюлазних комплексів і, як правило, складаються з одного поліпеп-тидного ланцюга. Єдиним винятком є ензим із Sclerotium rolfsii, який має дві субодиниці (22 та 32 кДа), що зв’язані між собою S-S-зв’язком [31]. Частіше молекулярна маса ендоглюканаз з мікробних джерел коливається в інтервалі 30-50 кДа. Із культуральної рідини низки мікроорганізмів виділено низькомолекулярні ендоглюканази з молекулярною масою менше 20 кДа, які, на думку авторів [32], є фрагментами більш висо-комолекулярних попередників.
На цей час вивчено амінокислотний склад багатьох ендоглюканаз [33]. Для всіх ензимів характерним є високий вміст Asp, Glu, Thr, Ser, Gly та дуже мала кількість, або взагалі відсутність, Cys та Met. Високий вміст кислих та оксіамінокислот визначає діапазон ізоелектричних точок ензимів. Як правило, рІ знаходиться в інтервалі 3,0-5,0.
Майже всі ендоглюканази є глікопротеї-нами. Загальний вміст вугдеводів може сягати 50% від загальної маси (табл. 2). Основними компонентами вуглеводної частини є маноза, галактоза, N-ацетилглюкозамін та N-ацетилгалактозамін [34]. Зазвичай до складу целюлазних комплексів входить низка ендоглюканаз, які можуть відрізнятися за сорбційною здатністю до целюлози у сотні разів.
Целобіогідролази до цього часу виділено з меншої кількості джерел, що пов’язано з відсутністю селективних методів визначення їх у суміші з ендоглюканазами. Як
2б
Таблиця 2. Вміст вуглеводів у целюлазах з різних мікробних джерел [33]
Ензим Джерело Вміст вуглеводів, %
Clostridium thermocellum 11,0
Talaromices emersonii 27,7-50,8
Ендоглюканаза Sporotrihum pulverulentum 2,2-10,5
Aspergillus niger A. fumigatus 0
Trichoderma viride 0-15,9
Fusarium lini 5,4-б,5
Penicillium funiculosum 9,0
Целобіогідролаза Sclerotium rolfsii 7,0
Trichoderma reesei 7,0
Trichoderma viride 0-10,0
Aspergillus niger 2,8
A. terreus 0
Целобіаза A. aculeatus 15,0-23,0
Trichoderma reesei 10,0
Trichoderma viride 0-10,0
Gladiolus candidus 9,0
і ендоглюканази, целобіогідролази є в більшості випадків глікопротеїнами з молекулярною масою 55- 65 кДа (табл. 3). Ізоелект-ричні точки містяться в діапазонах 3,8-4,2 та 5,5-6,5. Загалом біохімічні характеристики целобіогідролаз та ендоглюканаз дуже близькі, що ускладнює їх розділення. Це-лобіази звичайно мають більшу молекулярну масу (120-180 кДа), яка може ще й зростати через здатність ензиму до асоціації з утворенням комплексів. Ізоелектричні точки лежать у близькій до нейтральної ділянці, хоча більшість має рІ 4,5-5,5. За адсорбційною здатністю целобіази поступаються іншим компонентам целюлазного комплексу, що дозволяє виділяти їх методами афінної хроматографії на целюлозі.
У табл. 4 подано приклади одержання гомогенних целюлаз з різних мікробних джерел. Як випливає з наведених даних, в усіх випадках для одержання високоочищених ензимів необхідні 4-6 стадій. Окрім подібності різних компонентів комплексів за біохімічними характеристиками, складність процесу отримання очищених целюлаз пов’язана з великою кількістю домішок протеїнової природи (присутністю різних протеїнів та ензимів). Тому для кожного продуцента розробляють оригінальні схеми очищення ензимів. Для фракціонування це-люлаз застосовується практично весь спектр
методів очищення та носіїв (табл. 4). Часто для одержання множинних форм, переважно целобіогідролази, використовують препаративні ізоелектрофокусування та електрофорез, хоча вихід целюлозолітичних ензимів у разі їх використання не перевищує 50%. Висока роздільна здатність методів ВЕРХ дозволяє отримувати окремі це-люлази без попереднього групового
очищення, однак це різко зменшує робочий ресурс колонок. Слід зазначити, що попередня оптимізація умов культивування продуцента за такими показниками, як загальна та питома активність, а також відсутність протеїну значно спрощує виділення та очищення окремих ензимів целюлазного комплексу.
Для тонкого фракціонування очищених груповими методами целюлазних комплексів T. reesei, M. thermophila i A. niger досліджено можливість використання ексклюзійної хроматографії на колонках типу TSK 2000 i 3000 SW (LKB), аніонобмінної ВЕРХ на Mono Q та TsK-DEAE SW, катіоно-обмінної хроматографії на Mono S, високоефективного хроматофокусування на Mono P (Pharmacia), гідрофобної хроматографії на колонках TSK-Phenyl 5PW (LKB).
Таблиця 3. Властивості целюлаз
Ензим Джерело M^., кДа рН-опти- мум Термо- оптимум Специфічність
Целюлаза, родина 5, ЦЗД 3 [66] Bacillus amyoliquefaciens 54,0 7,0 50 0С Авіцел, КМ-целюлоза, Р-глюкан, ксилан
Ендоглюкана-за, родина 5 [67] Bacillus licheniformis 37,0 6,0 65 0С «-НФ-целобіозид, Р-глюкан ячменю, ліхенан
Ендоглюканаза [68] Bacillus agaradhaerens 38,0 7,0-9,4 60 0С КМ-целюлоза
Ендоглюканаза [69] Рекомбінантна 41,2 6,5 45 0С Р-Глюкан ячменю, ліхенан
Ендоглюканаза [70] Thermomonospora sp. 14,2 5,0-9,0 50 0С Целюлоза, ксилан
Ендоглюканаза [71] Penicillium occitanis mutant Pol 6 31,0 та 28,0 рІ 3,0 та 7,5 60 та 50 0С КМ-целюлоза, фосфорильо-вана целюлоза, Р-глюкан, ксилан
Екзо-1,4^-глю-каназа[72] Clostridium stercorarium 87,0 5,0-6,0 (рІ 3,9) 75 0С Авіцел, КМ-целюлоза, Р-глюкан ячменю
Екзоглюканаза [73] Chaetomium olivaceum 88,0 5,2 45 0С а-Целюлоза, фільтрувальний папір
Целобіогідро-лаза[74] Paenibacillus sp. 118,0 І © °° 45 0С Ацидильована целюлоза, Авіцел, целодекстрини
ß-Глюкозидаза [75] Piptoporus betulinus 36,0 4,0 (рІ 2,6) 60 0С Целобіоза та целоолігосаха-риди, відщеплює галактозу, манозу та ксилозу від оліго-сахаридів
ß-Глюкозидаза, родина 3 [76] Aspergillus niger 200,0 3,0-4,5 65 0С Целобіоза
Целобіаза, Cel8A [77] Lysobacter sp. 41,0 5,0 40 0С КМ-целюлоза, хітозан, колоїдний хітозан та хітин, розчинний хітозан
Ксиланаза[78] Syncephalastrum racemosum Cohn. 29,0 8.5 10.5 50 0С Ксилан
Ксилоглюкана-за [79] Aspergillus japonicus Chrysosporium lucknowense Trichoderma reesei 32.0 78.0 75,0105,0 pI 2,8 pI 3,8 pI 4,1-4,3 НД Ксилоглюкан тамаринду
Примітка: НД — немає даних.
Структурно-функціональна характеристика целюлазних систем аеробних та анаеробних мікроорганізмів
Найповніше на цей час охарактеризовано целюлазні системи грибів РНапегосНаеіе сНгувоврогіит, Б. риіоегиіепшт [6], ¥. воіапі [35], Р. ^ипісиІовит/ріпорНіІит [36], Т. етег-вопіі [37], Т. Ьопіпціі [38] і Т. геезеі [27]. Целюлазні системи цих грибів складаються з ендо-1,4-Р^-глюканази [1,4-Р^-глюкан глюканогідролаза; ЕС 3.2.1.4], екзо-1,4-Р-0-глюканази [1,4-Р-О-глюкан целобіогідрола-за (ЦВГ), ЕС 3.2.1.91] та Р-глюкозидази [це-лобіаза або Р^-глюкозид глюкогідролаза; ЕС.3.2.1.21] (табл. 5).
Ендоглюканази хаотично атакують фос-форильовану целюлозу, КМ- та аморфну целюлозу з вивільненням целоолігосахаридів. ЦБГ гідролізують фосфорильовану целюлозу та авіцел, послідовно відщеплюючи целобіозу з нередукуючого кінця [12]. За допомогою мічених целоолігосахаридів було показано, що ЦБГ здатна відщеплювати целобіозу також і з редукуючого кінця [39]. Ендоглюканази та ЦБГ діють синергічно, забезпечуючи гідроліз кристалічної целюлози, а Р-глюкозидаза завершує гідроліз, перетворюючи целобіозу на глюкозу. Екзо-Р^-глюканази (ЕС 3.2.1.74) Р. іипіси-іовит і Т. етегвопіі каталізують відщеплення глюкозних залишків з нередукуючого кінця целодекстринів і не кооперуються
Таблиця 4. Очищення та характеристика одержаних ензимів целюлазного комплексу
з різних мікробних джерел
Продуцент Етапи очищення Характеристика препарату
Chrysosporium lucknowense[80] Ультрафільтрація, обессолювання на ак-рилексі П2 (Reanal, Угорщина), аніонообмінна хроматографія на колонці Source 15Q (Pharmacia, Швеція), аніонообмінна хроматографія на колонці Mono Q, хрома-тофокусування на Mono Р Виділено 6 ендоглюканаз з м.м. 25 (рІ 4,0), 28 (рІ 5,8), 44 (рІ 6,0), 47 (рІ 5,7), 51 (рІ 4,8) та 6о кДа (рІ 3,7) і 2 цело-біогідролази — 65 кДа (рІ 4,5) та 43 кДа (рІ 4,2). рН-оптимум для всіх ензимів — у діапазоні 4,5-6,0
Clostridium ther-mocellum [81] Осадження сульфатом амонію, ультрафільтрація крізь полісульфонову мембрану, іонообмінна хроматографія на DEAE-сефарозі, гель-фільтрація на сефарозі CL-4B та сефакрилі S-300, хроматофоку-сування на Mono Р 2 ендоглюканази — 75,9 та 44,7 кДа, рІ 5,0 та 5,9, рН-оптимум — 5,7 та 4,8
Anaerocellum ther-mophilum [81] Осадження сульфатом амонію та багаторазова гель-фільтрація на Акрилексі Р6 у діапазоні концентрацій сульфату амонію Ендоглюканази (одна гідролізує КМ-це-люлозу, а друга — фільтрувальний папір), ензими стабільні при рН 4,0-8,0 та термостабільні (період інактивації при 85 0С — 150 хв)
Fibrobacter succinogenes [82] Афінна хроматографія, іонообмінна хроматографія на DEAE-Sepharose CL-6B у градієнті NaCl, хроматографія на гідроксіапатиті, концентрація за допомогою SDS-ПААГ Виділено EG1, Cel9B, Cel9BABTD, Cel5H, Cel8B, ClCBase, Cel10A з активністю 84, 40, 47, 0,31, 1,08, 14,2 та 11,6 Од/мг. ЦЗД мали Cel5H, ClCBase, Cel10A. Стимулюються у присутності Ca2+ або Mg2+
Cryptococcus sp. [83] Ультрафільтрація, аніонообмінна хроматографія на DEAE-5PW, гель-фільтрація на TSK-Gel G3000SW Карбоксиметилцелюлаза, 34 кДа, термооптимум 40-50 0С, рН-оптимум 3,5. Гідролізує Авіцел, КМ-целюлозу, SIGMA-CELL(R)
Trametes hirsuta [84] Осадження сульфатом амонію, іонообмінна хроматографія на DEAE-Sepharose CL-6B, гель-фільтрація на Toyoperl HW 50S Ендоглюканаза рекомбінантна, рН 5,0, стабільна в діапазоні 3,0-8,0, термооптимум 50 0С. Високоспецифічна щодо кристалічної целюлози
Pyrococcus horikoshii [85] Фракціонування сульфатом аммонію, аніонобмінна хроматографія на HitrapQ Ендоглюканаза, гідролізує _р-нітрофеніл целобіозу, КМ-целюлозу, Авіцел
Lysobacter sp. [77] Фракціонування сульфатом амонію, іонообмінна хроматографія на SP Toyoperl 650 M, ультрафільтрація, гель-фільтрація на Superdex 200, 2 послідовні хроматографії на сефарозі НР у градієнті NaCl Целобіаза та хітозаназа, целобіаза гомологічна до ß-1,3-1,4-D-глюканази з Bacillus circulans WL-12 та ендоглюканази B. circulans
Bacillus megaterium [86] Афінна хроматографія на целюлозі та гель-фільтрація на Sepharose 4B Целюлосоми з целюлазами та ксиланаза-ми, специфічні до КМ-целюлози та Авіцелу
Ceriporiopsis sub-vermispora [87] Гель-фільтрація на Sephacryl S-300 Дві ß-глюкозидази, 57 та 110 кДа, гідролізують _р-нітрофеніл-глюкозид та целобіозу
Trichoderma sp. [88] Гель-фільтрація на Sephacryl S-200, іонообмінна хроматографія на DEAE-Sephadex A-50, афінна хроматографія на Con A-Sepharose, хроматофокусування на Mono-P (HPLC) Ендоглюканаза, 51 кДа, гомологічна до Trichoderma reesei
Trichoderma harzianum [89] Хроматографія на Sephacryl S-300, DEAE-Sephadex A-50, та Mono P ß-Глюкозидаза, 75 кДа
з ендоглюканазами для гідролізу кристалічної целюлози. Гриби коричневої гнилі (Poria placenta, P. carbónica) на відміну від грибів, збудників білої (S. pulverulentum) та м’якої гнилі (F. solani, P. pinophilum, T. reesei), продукують тільки ендоглюканази [40].
Більшість грибних целюлаз є глікопро-теїнами і мають множинні форми. Чотири імунологічно споріднені ЦБГ з Т. viride відрізняються одна від одної складом нейтральних вуглеводів [41]. Так само чотири ендоглюканази з Т. ешегвопіі відрізнялися
Таблиця 5. Компоненти целюлаз аеробних грибів та характер їхньої дії на целюлозні ланцюги
Ензим ЕС код Синонім Тип дії
Ендо-1,4-Р^-глюканаза EC 3.2.1.4 Ендоглюканаза, ендоцелюлаза ^ § І
Екзо-1,4-Р^-глюканаза EC 3.2.1.91 Целобіогідролаза, екзоцелюлаза Г-Г-Г-Г- Т Відщеплює целобіозу від відновлювального та невідновлювального кінця
Екзо-1,4-Р^-глюканаза ЕС 3.2.1.74 Екзоглюканаза, глюкогідролаза Г-Г-Г-Г- Т Відщеплює глюкозу з невідновлювального кінця
Р-Глюкозидаза EC 3.2.1.21 Целобіаза Г-Г Г-Г-Г-Г Т Т Відщеплює глюкозу від целобіози та корот-коланцюгових целоолігосахаридів
Примітка: «Г-Г» — зв’язані глюкозні залишки.
тільки за ступенем глікозилювання [42]. Показано, що на відміну від них, ЦБГ І і ІІ, які продукуються культурами T. reesei і P. funi-culosum, є імунологічно неспорідненими, а дві ЦБГ з Fusarium lini відрізнялися за амінокислотним складом [7].
Загалом вважають, що позаклітинні це-люлазні компоненти більшості грибів існують як індивідуальні об’єкти. Однак є дані щодо агрегації позаклітинних целюлаз у T. reesei [43]. Цей комплекс складається з шести протеїнів і виявляє целюлазну, в-глюкозидазну і ксиланазну активності. Можливо, протеїни зв’язуються з іншими компонентами клітинної стінки із залученням іонів Са2+ [43]. Хоча багато грибів виділяють окремі целюлазні компоненти в культуральну рідину, ще остаточно не з’ясовано, як ці компоненти взаємодіють на поверхні кристалічної целюлози, забезпечуючи її повний гідроліз.
Дослідження на анаеробних грибах рубця свідчать про те, що ці мікроорганізми відіграють певну роль у початковій колонізації і деградації лігноцелюлози у рубці [44]. Було показано, що ці гриби продукують позаклітинні целюлази та ксиланази, які забезпечують деградацію лігноцелюлози [45].
Описано анаеробні целюлолітичні гриби, що належать до родів Neocallimastix, Caco-myces, Orpinomyces, Piromyces, і Rumino-myces. На відміну від аеробних грибів, система N. frontalis — багатокомпонентний ензиматичний комплекс, що має назву фактора розчинення кристалічної целюлози (ФРКЦ). Його молекулярна маса — 700 кДа; складається з ряду субодиниць з молекуляр-
ною масою від 68 до 135 кДа [46]. Поки що не вдалося роз’єднати ФРКЦ без втрати специфічної активності щодо кристалічної целюлози. Присутність багатокомпонентного комплексу цього гриба свідчить про можливість гідролізу кристалічної целюлози за механізмом, подібним до механізму дії анаеробної бактерії C. thermocellum. Целюлази N. frontalis (RK 21) — найефективніші з відомих на цей час деструкторів кристалічної целюлози, оскільки відіграють важливу роль у перетравленні целюлози в рубці. Тому видається цікавим дослідити механізм целюлозної деградації за допомогою целю-лазної системи цього гриба.
Полісахаридгідролазні системи, що синтезуються аеробними грибами, найповніше вивчено на прикладі ензимів родів Tricho-derma, Penicillium, Fusarium, Humicola, Phanerochaete, Schizophillium [31]. Кількість «целюлолітичних» протеїнів у цих системах визначається десятками, але зазвичай більшість із них є гомологами або ж множинними формами обмеженого набору основних компонентів, які відрізняються структурою та механізмом дії. Так, у складі найбільш досліджених комплексів T. reesei та Н. insolens таких компонентів не менше семи: дві целобіогідролази (І і ІІ, родини 6/В та 7/С відповідно) і, принаймні, п’ять ендо-глюканаз: І (7/С); ІІ (5/А5); ІІІ (12/Н); IV (61), V (45/к), VI (6/В) — у дужках вказано належність КД до відповідної структурної родини. В останні роки з’явилися відомості щодо існування у грибів ендоглюканази VI, здатної міцно сорбуватися на целюлозі; частина з них, окрім КД, несе ЦЗД родини І,
причому у різних грибів ЦЗД, ймовірно, не закріплено за строго визначеними родинами КД. Поряд із цим у складі целюлозолітичної системи грибів виявлено ряд ксиланаз (родини 10/F, 11/G) та мананаз (5/А1), частина з яких також несе ЦЗД. Загальна кількість генів, які беруть участь у розкладі рослинного субстрату та більш-менш координовано індукуються целюлозою, целобіозою, лактозою, софорозою або арабітом та репресуються глюкозою, становить близько 20 і розташовані вони у різних хромосомах гриба. Крім cbhl, cbh2, egll, egl2, egl3, egl4, egl5, xynl, xyn2, manl, які відповідають вищезазначеним ензимам T. reesei, це — bgll, bgl2 (гени в-глюко- та ксилозидази), axel (ген ацетилксиланестерази), glrl (ген в-глюку-ронідази), arfl (ген a-L-арабінофуранозида-зи), agll, agl2, agl3 (гени а-галактозидаз). Ензими, які їх кодують, беруть участь у відщепленні замісників в основних ланцюгах геміцелюлоз [47]. Механізм взаємодії різних типів целюлаз у процесі деградації впорядкованої целюлози, а також характерне явище синергізму целюлазних систем обговорюються досить давно. Однак спроби звести всі феномени до екзо-, ендосинергізму, який спостерігається в амілаз, виявилися марними. По-перше, треба відзначити більше різноманіття структурних типів целюлолітич-них ензимів. Іноді навіть не вдається провести паралель між ендо- та екзогідрола-зами, що беруть участь у процесах деградації целюлози та крохмалю.
Основним елементом грибних целюло-золітичних систем є ЦБГ І [48]. За механізмом дії вона істотно відрізняється від відповідної екзогідролази амілолітичної системи — в-амілази. Як і всі гідролази родини 7/С, грибна ЦБГ І зберігає конфігурацію зв’язку в продуктах реакції та каталізує процеси трансглікозилювання. Низькомолекулярні субстрати вона атакує поблизу відновлювального кінця. Особливістю ЦБГ І є активний центр, який являє собою не звичайну для ендогідролаз заглибину (ложбину), а наскрізний тунель вздовж увігнутої частини в-сендвіча, перекритий зверху гнучкими петлями, які зшиті дев’ятьма S-S-містками [31]. Встановлено, що КД містить 10 субсайтів зв’язування глюкозних залишків — від -7 до +3. Можливий механізм каталізу включає зв’язування целононаози на субсайтах від -7 до +2, утворення целобіози на аглюконових ділянках +1 та +2 й карбокатіону гептанози на субсайтах від -7 до -1, його ковалентне зв’язування із залишком Е212, гідроліз глікозилензиму та
десорбцію продуктів. Ензим не має абсолютної специфічності до положення 4-ОН у вуглеводного залишка, що локалізується на субсайті -2: він може діяти на флуорогенні похідні як целобіози, так і лактози. Є досить багато даних про те, що ЦБГ І здатна генерувати на поверхні целюлози нові кінцеві групи, що свідчить про наявність у неї не тільки екзо-, а й ендогідролазних властивостей [49]. Однак досі не ясно, як це відбувається з огляду на тунельну структуру активного центру.
Саме ЦБГ І необхідна для розщеплення нативної целюлози, причому у цьому процесі беруть участь усі три складові: КД, С-кінцевий ЦЗД та лінкер, що їх пов’язує. Припускають, що ензим використовує вільну енергію глікозидного зв’язку для руйнування кристалічної структури субстрату, однак як саме, ще не встановлено.
У другої екзоглюканази — ЦБГ ІІ активний центр утворюється двома поверхневими петлями на жорсткій структурі незавершеної тріозофосфат-ізомеразної структури (ТІМ-барел) і має форму більш короткого тунелю завдовжки 2 нм. Усередині його розташовані 4 сайти зв’язування глюкозних залишків: -2, -1, +1, +2 (нумерація від зв’язку, що розщеплюється). Окрім того є ще один підсайт +4, розміщений поза тунелем. Ензим містить К-кінцевий ЦЗД родини І. Специфічність ЦБГ ІІ вузька — ензим не діє на гетерозидний зв’язок у флуороген-них похідних целоолігосахаридів.
Одна з двох основних ендоглюканаз Т. геевеі, ендоглюканаза І [47], належить до тієї самої родини, що й ЦБГ І (7/С), і має близьку третинну структуру. Однак у неї активний центр має вигляд щілини. Ендоглю-каназа І розщеплює як целобіозиди, так і лактозиди 4-метилумбеліферону, а на кси-лані має таку саму активність, як і в разі використання похідних целюлози. У процесі гідролізу ензим віддає перевагу внутрішнім зв’язкам у целотетра-, пента- та гексаозі, а в присутності високих концентрацій цело-тріози (12-20 мМ) має здатність до трансглікозилювання. На ксилотри-, тетра-, пента-та гексаозі він виявляє специфічність до гідролізу другого від відновлювального кінця зв’язку, віддаючи перевагу субстратам з довшим ланцюгом. У різних грибів ензим може як містити, так і не містити С-кінцевий ЦЗД.
Ендоглюканаза ІІ грибних целюлазних систем належить до родини 5/А5 зі структурою ТІМ-барела та розташуванням активного центру на кінцях четвертого й сьомого
в-тяжів. За специфічністю дії на целооліго-сахариди цей ензим істотно відрізняється від ендоглюканази І, яка є строго специфічною щодо похідних целюлози. Ендоглюканаза ІІ ефективніше знижує ступінь полімерізації КМ-целюлози, для неї менш характерними є реакції переносу з участю целотріози, хоча вони й не виключаються. До її складу входить К-кінцевий ЦЗД родини І.
Ендоглюканази І і ІІ та ЦБГ І і ІІ є основними в ензиматичній системі Т. геевеі і синтезуються грибом синхронно у співвідношенні приблизно 6:1,5:1:1, хоча їхні гени розміщені на різних хромосомах. Саме цим ензимам приписують основну роль у синергічній деградації впорядкованої целюлози. Інші, мінорні, ендоглюканази (знайдено не менше трьох), можливо, потрібні для утворення індуктора целюлаз.
Грибна ендоглюканаза ІІІ (Т. геевеі) є невеликим протеїном (218 АК), який не містить ЦЗД. Активний центр ендоглюканази ІІІ, розташований у глибокому каньйоні між в-листами, може вміщувати 5 глюкозних залишків. Їй притаманна висока здатність до реакцій трансглікозилювання.
Ендоглюканазу ГУ', яка належить до нової родини 61, охарактеризовано відносно недавно і поки немає даних про її просторову структуру і механізм каталізу.
Ендоглюканазу V виявлено у багатьох грибів. Цей ензим має невеликий КД, згорнутий у 6в-барел (родина 45/К), активний центр у вигляді тунелю з шістьма сайтами зв’язування і ЦЗД родини І на С-кінці. На відміну від інших ендоглюканаз, цей ензим перетворює конфігурацію біля аномерного центру в продуктах гідролізу. Ензим не розщеплює ксилани, манани та галактоманани.
Особливістю ензиматичної системи
Н. іпвоіепв є не знайдена в інших грибів ендоглюканаза УІ, яка близька до ЦБГ ІІ та ряду бактеріальних ендоглюканаз родини 6/В. У цьому ензимі відсутній ЦЗД. Найбільшу активність він виявляє на целогексаозі й подібно до ЦБГ ІІ переважно розщеплює другий з невідновлювального кінця глікозидний зв’язок.
Слід відзначити також деякі модульні ензими, які входять до складу целюлазно-геміцелюлазного комплексу грибів, що несуть ЦЗД і, відповідно, залучені до реакцій на поверхні целюлози. Це передусім ксила-наза ¥. охуэрогиш (10/Р) та в-мананаза Т. гее-веі (5/А1) [31].
Ензиматичні системи актиноміцетів та аеробних бактерій мають низку спільних рис з ензимами грибів. Найбільш дослідже-
ними вони є у бактерій С. fimi i P. fluorescens subsp. cellulosa та актиноміцета T. fusca. Грампозитивна бактерія С. fimi утворює ендоглюканази CenA, B, C та D, ЦБГ CbhA та
B, екзоглюканазу-ксиланазу Cex та ксила-нази XynDl, XynD2. Їхні молекули побудовані з кількох автономних модулів і мають довжину поліпептидного ланцюга від 400 до майже 1100 залишків. СепА має КД родини 6/В та N-кінцевий ЦЗД типу ІІа, розділені лінкером. СепВ — великий мультидоменний протеїн з КД родини 9/Е2 та жорстко зв’язаним з ним ЦЗД типу ІІІЬ, а також С-кінце-вим ЦЗД типу ІІа. Між двома ЦЗД розташовані розділені лінкерами три повтори фібронектин ІІІ-подібного домену, що, ймовірно, відповідає за зв’язування ензиму на клітинній мембрані або за утворення позаклітинного мультисубодиничного комплексу ензимів. СепС має КД родини 9/Е1 та N-кінцевий ЦЗД типу IV, які розділені лінкером. Цей тип ЦЗД специфічний щодо аморфної целюлози.
Серед екзогідролаз С. fimi Cex (10/F) має незвичайну субстратну специфічність, оскільки здатний розщеплювати як целюлозу, так і ксилан. Особливістю ЦЗД Cex є його здатність до міцної сорбції на кристалічній целюлозі, хітині та, меншою мірою, на аморфній целюлозі.
Окрім цього було клоновано ендоманана-зу Man26A та ß-манозидазу Man2A С. fimi. У бактерії Man26A піддається протеолізу і, можливо, є єдиною мананазою; показано, що цей ензим частково зв’язаний з клітинами.
Відносно більш проста ензиматична система термофільного мікроміцета T. fusca складається з шести компонентів Е1-Е6, що містять ЦЗД родини ІІ. Два ензими, Е3 та Е6, є екзоцелюлазами, причому Е3 діє з не-відновлювального, а Е6 — з відновлюваль-ного кінця. Е1, Е2 та Е5 — ендоцелюлази, а Е4 має проміжні властивості та здатність посилювати дію як ендо-, так і екзоцелюлаз. Подібність цієї системи із системою С. fimi пояснюють конвергентною еволюцією. Крім глюканаз, до складу целюлазної системи актиноміцетів входить також термостабільна ксиланаза А, що належить до родини 11/G.
У стрептоміцетів також знайдено целю-лази родини 5/А2, 6/В, 9/Е1 та ксиланазу 11/G. Додатково виявлено мананазу (5/А4) і ксиланазу (10/F), які не містять ЦЗД, а також ацетилксиланестеразу та хітиназу, що несуть ЦЗД родин ІІЬ та ІІа відповідно.
Целюлазні системи С. fimi та актиноміцетів можна розглядати як перехідні між грибами і бактеріями. Незавершена структура
ТІМ-барела ендоглюканази Е2 з T. fusca відрізняється від аналогічної структури грибної ЦБГ ІІ тим, що у неї вкорочені петлі, які перекривають тунель активного центру, через що він має форму улоговини. Ця глю-каназа має найбільшу активність щодо КМ-та аморфної целюлози і погано розщеплює кристалічний субстрат. Ензим Е4 T. fusca не має аналогів серед грибних целюлаз. Його КД є (а,а)6-барелом, у якого петлі на С-кінці внутрішніх спіралей формують активний центр. З N-кінця до нього жорстко прикріплений імуноглобуліноподібний ЦЗД із 90 залишків, які укладено у вісім в-тяжів. При цьому вхід в активний центр є продовженням ЦЗД. Таким чином, активний центр складається ніби з двох частин — відносно плоскої, характерної для ЦЗД, та щілиноподібної, притаманної КД.
Бактерія P. fluorescens subsp. cellulosa утворює целюлолітичну систему, ще меншою мірою подібну до системи грибів. До неї входить не менш ніж три ендоглюканази, цело-декстриназа, п’ять ксиланаз та чотири ма-нанази, а крім цього присутній широкий спектр ензимів, що відщеплюють бокові групи в геміцелюлозах [50]. Відзначають подібність двох ензимів псевдомонад: ендоглюканази родини 5/А5 Ralstonia solanacearum та CelB P. fluorescens родини 45/К з ензимами грибів — ендоглюканазами ІІ і V T. reesei та
Н. insolens.
В ензиматичних системах псевдомонад, бацил та Ervinia spp. не виявлено типових ЦБГ. Тому їхня функція, імовірно, не зводиться до утилізації целюлози. Деякі з цих ензимів беруть участь у фітопатогенезі, полегшуючи проникнення мікроорганізму до клітини хазяїна або утворюючи сигнальні молекули-олігосахариди, які регулюють фітоімунні реакції [51]. У зв’язку з цим особливий інтерес становить структурна подібність окремих ендоглюканаз та ксила-наз сапрофітних грибів і фітопатогенних бактерій, що може розкрити дійсну функцію численних компонентів целюлозолітич-ної системи мікроорганізмів.
Серед анаеробних бактерій найбільш дослідженими є целюлазно-геміцелюлазні системи термо- та мезофільних клостридій. Целюлосоми С. thermocellum містять до 26 поліпептидів, серед них ідентифіковано 12 целюлаз ендо- та екзоглюканазного типу, 3 ксиланази, асоційовані з ацетилксиланес-теразними та ферулоїлестеразними доменами, ліхеназа та некаталітичний протеїн, що має назву інтегруючого целюлосому протеїну А (СірА) або скафолдину [31]. Зв’язу-
вання забезпечують консервативні гідрофобні повторювання (2x24 залишка), так звані докерини типу І та комплементарні їм рецептори скафолдину, так звані когезини типу І. Важливу роль у когезиндокериновій взаємодії відіграють іони Са+2 [31]. Когези-нові домени складені у вигляді дев’ятитяже-вих в-барелів, подібних за структурою до ЦЗД родин ІІ та ІІІ, незважаючи на повну відсутність гомології. Крім 9 когезинів типу І, скафолдин несе ЦЗД родини ІІ, а також особливий тип докерину на С-кінці (тип ІІ), який не взаємодіє з когезинами типу І. Коге-зини типу ІІ для цього докерину містяться в протеїнах, присутніх у 8-шарі. Таким чином, скафолдин має у своєму складі необхідні структурні фрагменти для формування целюлосом, для їх фіксації на поверхні клітини та для прикріплення до целюлозного субстрату.
На прикладі ендоглюканази D клостри-діальних целюлосом, які не містять власних ЦЗД, показано, що активність ензимів щодо мікрокристалічної целюлози багаторазово зростає в разі фіксації на нативному або мутантному скафолдині, який несе ЦЗД та єдиний модуль когезину І.
Серед ензимів, фіксованих у целюлосомі, знайдено не тільки ендоглюканази, а й ЦБГ [52]. Найбільш відома з них — ЦБГ Се18(88), що належить до родини 48/Ь. У цій родині розшифровано просторову структуру Се№ — так званої процесивної ендо-екзоглюканази мезофільної клостридії. Її К-кінцевий КД має структуру (а,а)6-барела з активним центром у вигляді тунелю, що заглиблюється на 2/3 довжини внутрішніх спіралей з боку К-кінця. Зовні тунель переходить у відкриту заглибину, що дозволяє ензиму виявляти властивості як екзо-, так і ендо-глюканази. Загальна довжина активного центру становить не менше восьми ангідро-глюкозних залишків.
С. сеііиіоіуНсиш — ще одна анаеробна бактерія, будову целюлосоми якої досліджено. Крім скафолдину, до її складу входить шість целюлазних ензимів (СеІА — Се№% які зв’язані каркасним протеїном з когезин-докериновими комплексами. У клостридій цей тип взаємозв’язку є видоспецифічним: когезини ензимів мезофілів не впізнають до-керини термофілів і навпаки.
Целюлазно-геміцелюлазні системи анаеробних бактерій істотно відрізняються від ензимних систем аеробів, що пояснюється специфічністю середовища існування. Аероби секретують ензими у невеликий об’єм водної плівки. Відсутність конвекції уможливлює
(за наявності ЦЗД) іммобілізацію ензимів на субстраті поблизу клітини-продуцента та створення у плівці стійкого комплексу з ефективним дифузійним транспортуванням продуктів гідролізу усередину клітини. У анаеробів аналогічна секреція ензимів призвела б до втрати їх продуцентом та розділення необхідного набору активностей конвективними токами навколишньої рідини. Тому в цих організмів целюлозолітичну систему упаковано в целюлосоми та поліце-люлосоми, які зв’язані з поверхнею клітини. Таким чином забезпечується транспортування продуктів гідролізу від субстрату до прикріпленої клітини мікроорганізму [52]. При цьому в анаеробів трапляються і компоненти «розділених» ензиматичних систем. У свою чергу, аероби можуть мати ензими, у яких поряд із ЦЗД бувають модулі типу фібронектин ІІІ-зв’язувальних доменів, які відповідають за зв’язування з клітиною та/або утворення протеїнових асоціатів на поверхні целюлози.
Вважають, що еволюційно більш досконалі аеробні мікроорганізми пішли шляхом відбору спеціалізованих «маломодульних» ензимів, які пристосовані до вузького конкретного завдання в малому об’ємі рідини, тимчасом як давніші анаероби зберегли універсальні багатомодульні ензими або утворення типу целюлосом [31].
Целюлозолітичні ензими, яким у традиційній номенклатурі відведено 4 позиції, в сучасній класифікації об’єднані у 15 з 80 відомих структурних родин та кілька підродин глікозилгідролаз, причому до них віднесено і дві родини з численної групи ксиланаз. Целюлазно-геміцелюлазні ензими є в родинах 5(А), 6(В), 7(С), 8ф), 9(Е), 10^), 11^), 12(Н), 26(1), 44^), 45(К), 48^), 51, 60 та 61. Ця номенклатура стосується тільки структури КД.
Слід наголосити, що кількість структурних типів 1,4-в-глюкозилгидролаз порівняно з ензимами, що діють на а-глюкозидні зв’язки, значно ширша. Останні представлені тільки трьома родинами. Цікавим є те, що розщеплення ксиланів у еволюційно віддалених організмів відбувається за участю тільки двох родин. Ксиланази у природі майже завжди знаходять поряд з целюлаза-ми, а їхній субстрат за масштабами відтворення близький до целюлози, хоча значно складніший за неї за своєю хімічною структурою. Проте ксиланази, як і амілази, побудовані більш однорідно, ніж целюлази, можливо тому, що еволюційно ці ензими значно молодші за целюлази.
Крім цього, целюлази розділяють на родини за будовою ЦЗД та лінкерів. Прийняту у наш час класифікацію целюлазно-геміце-люлазних ензимів за структурою КД та ЦЗД наведено в роботі Рабиновича та співавт. [53].
Механізм ензиматичної деструкції целюлози
Целюлази каталізують гідроліз целюлози (клітковини), яка в природних матеріалах зв’язана з багатьма іншими сполуками: геміцелюлозою, пектином, лігніном, крохмалем. Природні матеріали містять целюлозу, структура якої має різне співвідношення аморфних ділянок і кристалів. Тому целюлоза не є рівноцінним субстратом для дії ензимів і для деструкції потребує їх комплексу. Невідомо, чи існують ділянки менш упорядкованих ланцюгів у мікрофібрилах целюлози. Реакція целюлаз з високоупоряд-кованою целюлозою відрізняється від їх взаємодії з менш упорядкованою целюлозою.
КМ-целюлозу й Авіцел багато дослідників використовують як субстрати. Целюлази, які інгібуються КМ-замісниками, не можна виявити, застосовуючи ці субстрати. Кристалічна целюлоза, така як Авіцел, повільно деградується більшістю очищених це-люлаз і тому потребує більше часу для реакції. Було зроблено спроби знайти субстрат, з яким будь-яка целюлаза здатна реагувати задовільно і швидко. Нерозчинний цело-олігосахарид із середнім ступенем полімеризації 20, який утворюється внаслідок гідролізу порошку целюлози соляною кислотою, як виявилося, придатний для цього. У будь-якому разі для характеристики різних компонентів целюлаз грибів потрібен ряд субстратів.
Як вже зазначено вище, целюлазні комплекси, що продукуються різними мікроорганізмами, є поліензимними системами, які складаються з ензимів різної молекулярної будови та способу дії на целюлозу. Слід пам’ятати, що через велике різноманіття це-люлазних комплексів та індивідуальних ензимів, які їх складають, а також унаслідок складності будови та великої кількості форм целюлози неможливо дати однозначну та вичерпну картину дії целюлазного комплексу на целюлозу. У спрощеному вигляді її подано на рис. 2.
Основними чинниками, що впливають на властивості целюлазних комплексів, є індивідуальні властивості ендоглюканаз, ЦБГ, а також співвідношення між активностями цих ензимів. До індивідуальних
Кристалічна целюлоза
Глюкоза
Целобіоза або целотетроза
Рис. 2. Три типи реакцій, що каталізуються целюлазами:
1 — розщеплення нековалентних зв’язків у кристалічній структурі целюлози (ендоцелюлази); 2 — гідроліз окремих ділянок целюлози до олігосахаридів (екзоцелюлази);
3 — гідроліз ди- та тетрасахаридів до глюкози (Р-глюкозидази)
властивостей належать спосіб дії на целюлозу та молекулярна активність, їхня здатність адсорбуватися на целюлозі, рН- і температурні оптимуми дії та стабільність.
Співвідношення між ендоглюканазною та целобіогідролазною активностями в комплексі залежать від генетичних властивостей штаму-продуцента. Вкрай важливою є можливість прояву синергізму, тобто явища взаємного посилення дії ензимів, а також їхньої здатності до адсорбції на поверхні це-люлаз. Давно встановлено, що чим міцніше ензими сорбуються на целюлозі, тим вищою є їхня здатність до глибокого гідролізу кристалічної целюлози.
Розглянуті закономірності ензиматичної деструкції целюлози найбільш характерні для грибних целюлаз. Характерною особливістю бактеріальних целюлаз є структурованість їх у великі агрегати — целюлосоми.
Незважаючи на накопичення значного обсягу даних щодо вивчення структури окремих ензимів целюлазно-геміцелюлазних систем мікроорганізмів, і досі складно говорити про кардинальні зміни в розумінні механізмів ензиматичної деградації упорядкованої целюлози. Ще на початку 80-х років стало очевидним, що в гідролізі целюлози беруть участь ендоглюканази, які мають додатковий центр зв’язування з целюлозою — сорбційний центр, який отримав назву ЦЗД. Ендоглюканази, які слабо сорбуються,
найактивніше гідролізують зовнішні аморфні ділянки, але не зачіпають упорядкованої частини целюлози [54]. Їх було виявлено в мінорних кількостях у повноцінних целюлозних комплексах грибів Т. гвввві та Р. еНгузозрогіиш. При цьому в комплексі домінували протеїни, які міцно сорбуються і відіграють головну роль у розкладі кристалічної целюлози.
Здатність ензимів, що містять ЦЗД, переміщуватися від однієї частинки субстрату до іншої, встановлено при сумісному застосуванні звичайної та міченої фарбником целюлози [55]. Підтверджено й факти, що свідчать про відсутність ендоглюканаз, які міцно зв’язуються з целюлозою, у целюлаз-них комплексах А. підєг, А. foetidus, що не розщеплюють впорядковану целюлозу. Ен-доглюканази аспергілів належать до родини 12/Н, яка не містить ЦЗД [31].
Загалом механізм гідролізу целюлози виглядає так (рис. 3). Ензим міцно адсорбується на нерозчинному субстраті за рахунок взаємодії ЦЗД з його поверхнею. КД, зв’язаний з ЦЗД через гнучкий лінкер, здійснює серію каталітичних актів, розщеплюючи доступні глюкозидні зв’язки, при цьому десорбції ензиму в розчин не відбувається. Украй важливою обставиною є властивість ЦЗД руйнувати високовпорядковану кристалічну структуру бавовняних волокон без розщеплення глюкозидних зв’язків.
Б
Аморфна
Кристалічна
і
Кристалічна
о.
Глюкоза Целобіоза Целоолігосахариди О Ендоглюканаза Екзоглюканаза І
0 Глюкозидаза ¡О^
Екзоглюканаза ІІ
8
1 шщ
Аморфна і—; :
клітинна
стінка
І '-8Ч8ч* ІДШ : ІІ
і’ ' у£> Глікокалікс
0 Ендоглюканаза >!. Екзоглюканаза з докерином з Докерином
п Когезинові % Екзоглюканаза
і-і домени з докерином
£5 Целобіозо/целодекстрин фосфорилаза ^ Вуглеводзв’язувальний модуль
Рис. 3. Схема гідролізу аморфної та мікрокристалічної целюлози грибними аеробними (А) та бактеріальними анаеробними (Б) целюлазними системами. Забарвленими клітинами позначено редукувальні кінці [90]
Такі волокна з порушеною кристалічною структурою набагато легше піддаються гідролітичній деструкції під дією інших целюлаз.
Адсорбційна здатність ензимів, що не містять ЦЗД, дуже мала, і в разі дії на целюлозу вони здійснюють один або декілька послідовних каталітичних актів, після чого ензими можуть легко переноситись у розчині до нових ділянок поверхні нерозчинного субстрату. Як правило, такі ензими не здатні розщеплювати кристалічну целюлозу, а можуть діяти тільки на аморфні (дефектні) ділянки волокон.
Практичне використання целюлаз
Целюлази широко використують у різних галузях: у сільському господарстві (для годівлі тварин), харчовій, текстильній, паливній та хімічній промисловості, у паперовому виробництві, у медико-фармацевтич-них, генно-інженерних технологіях та в процесах знешкодження відходів.
У харчовій промисловості целюлази застосовують під час екстракції фруктових соків та олій із насіння; для освітлення соків; у процесі очищення бобів сої під час виробництва соєвих соусів; для виділення протеїнів сої та кокосових горіхів; з метою ефективного одержання кукурудзяного та картопляного крохмалю; для желатинізації морських водоростей, аби поліпшити їхні харчові властивості; для одержання агару
з морських водоростей та деградації лігно-целюлози з метою одержання харчових добавок [16, 56, 57]. Їх також використовують для підвищення поживної якості продуктів бродіння, для відновлення зневоднених овочів та сухих супів, у виробництві цело-олігосахаридів, глюкози та інших розчинних вуглеводів із целюлозних відходів, для видалення клітинних стінок, що полегшує виділення ароматичних речовин, протеїнів, полісахаридів [57]. У пивоварному та винному виробництві целюлази застосовують для гідролізу в-1,3 та в-1,4 глюканів, які присутні в низькосортному ячмені, для полегшення фільтрації пива, покращання аромату вин. Рекомбінантні дріжджі, які продукують в-1,3- та в-1,4-глюканази, також використовують у пивоварінні. Целюлази застосовують і як добавки до харчування жуйних тварин та для попередньої обробки лігноце-люлозної сировини й силосу, щоб полегшити процес травлення жуйних тварин, лущення пшеничних зерен [57]. Цікавим прикладним аспектом використання целюлазних генів є їх клонування для отримання транс-генних тварин, які зможуть секретувати це-люлази в шлунково-кишковому тракті для поліпшення перетравлювання грубої їжі [16].
У текстильній промисловості целюлаза-ми послуговуються для біошліфування грубої бавовняної тканини з метою одержання джинсових тканин, для видалення
мікрофібрил, які утворюються на тканинах під час різних циклів обробки, для відновлення м’якості та яскравості бавовняних тканин [16, 56].
Поряд із цим целюлази або суміші глю-каназ можуть бути корисними для утворення рослинних та грибних протопластів у процесі одержання гібридних штамів у різноманітних генетичних експериментах [44].
Таким чином, целюлази мають широкі можливості для застосування в різних технологічних процесах, однак для цього потрібні масштабні дослідження їхніх властивостей та специфічності. Ці дослідження
ЛІТЕРАТУРА
1. Экологическая биотехнология / Под ред. К. Ф. Форстера, Д. А. Дж Вейза. — Л.: Химия. — 1990. — 384 с.
2. Ebel J. Oligoglucoside elicitor-mediated activation of plant defense // Bioessays. — 1998. — V. 20, N7. — Р. 569-576.
3. FangX., Yano S., Inoue H. et al. Lactose enhances cellulase production by the filamentous fungus Acremonium cellulolyticus // J. Biosci. Bioeng. — 2008. — V. 106, N2. — Р. 115-120.
4. Ljungdahl L. G., Eriksson K. E. Ecology of microbial cellulose degradation // Adv. Mic-rob. Ecology. — 1985. — V. 8. — P. 237-299.
5. Johnson E. A., Sakajoh M., Halliwell G. et al. Saccharification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum // Appl. Environ. Microbiol. — 1982. — V. 43, N5. — Р. 1125-1132.
6. Wood T. M. Properties of cellulolytic enzyme systems // Biochem. Soc. Trans. — 1985. — V. 13, N2. — P. 407-410.
7. Bhat I.S., Bhat S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications // Biotechnol. Adv. — 1997. — V. 15, N3/4. — P. 583-620.
8. Bhat S., Goodenough P. W., Owen E. et al. Cellobiose: A true inducer of cellulosome in different strains of Clostridium thermocel-lum // FEMS Microbiol. Lett. — 1993. — V. 111. — P. 73-78.
9. Jindou S., Xu Q., Kenig R. et al. Novel architecture of family-9 glycoside hydrolases identified in cellulosomal enzymes of Acetivibrio cellulolyticus and Clostridium thermocellum // FEMS Microbiol. Lett. — 2006. — V. 254, N2. — Р. 308-316.
10. Sugden C., Bhat M. K. Cereal straw and pure cellulose as carbon sources for growth and
розвиваються досить швидко. Значного прогресу досягнено в розумінні синтезу це-люлаз, біохімії деградації целюлози, клону-ванні та експресії целюлазних генів та встановленні 3^-структури деяких целюлаз. Головними лімітуючими ланками у використанні комерційних препаратів целюлаз є вихід, стабільність, специфічність та вартість одержання. Тому майбутні дослідження слід зосередити на створенні високопродуктивних, термо- та рН-стійких продуцентів целюлаз, із широкою субстратною специфічністю та високою каталітичною ефективністю, використовуючи недорогі середовища та ензимні технології.
production of plant cell wall degrading enzymes by Sporotrichum thermophile // World J. Microbiol. Biotechnol. — 1994. — V. 10.— P. 444-451.
11. Ghose T.K. Measurement of cellulase activities // Pure Appl. Chem. — 1987. — V. 59, N2. — P. 257-268.
12. Wood T. M., Bhat M. K. Methods for measuring cellulase activities // In: W.A. Wood,
S.T. Kellogg, (Eds.), Meth. Enzymol. — 1988. — V. 160. — P. 87-112.
13. Ryu D. D. Y., Mandels M. Cellulases: biosynthesis and applications // Enzym. Microb. Technol. — 1980. — V. 2. — P. 91-102.
14. Stewart B. J., Leatherwood J. M. Depressed synthesis of cellulase by Cellulomonas // J. Bacteriol. — 1976. — V. 128. — P. 609-615.
15. Nisizawa T., Suzuki H., Nisizawa K. Inductive information of cellulase by sophorose in Trichoderma viride // J. Biochem. — 1971. — V. 70. — P. 375-385.
16. Beguin P., Anbert J. P. The biological degradation of cellulose // FEMS Microbiol. Rev. — 1993. — V. 13. — P. 25-58.
17. Kubicek C. P., Messner I. L., Gruber F. et al. The Trichoderma reesei cellulase regulatory puzzle — from the interior life of a secretory fungus // Enz. Microb. Technol. — 1993. — V. 15. — P. 90-99.
18. Reese E. T., Lola J. E., Parrish F. W. Modified substrates and modified products as inducers of carbohydrases // J. Bacteriol. — 1969. — V. 100. — P. 1151-1154.
19. Garcia-Martinez D. V., Shinmyo A., Madia A et al. Studies on cellulase production by Clostridium thermocellum // Eur. J. Appl. Microb. Biotechnol. — 1980. — V. 9. — P. 189-197.
20. Sternberg D., Mandels G. I. L. Induction of cellulolytic enzymes in Trichoderma reesei by sophorose // J. Bacteriol. — 1979. — V. 139. — P. 761-769.
21. Nisizawa T., Suzuki H., Nisizawa K. Inductive information of cellulase by sophorose in Trichoderma viride // J. Biochem. (Tokyo). —
1972. — V. 71. — P. 999-1007.
22. Pastan I., Adhya, S. Cyclic Adenosine 5’ monophosphate in Escherichia coli // Bacteriol. Rev. — 1976. — V. 40. — P. 527-551.
23. Entian K. D., Hilbnerg F., Opitz H. et al. Cloning of hexokinase structural genes from Saccharomyces cerevisiae mutants with regulatory mutations responsible for glucose repression // Mol. Cell. Biol. — 1985. — V. 5. — P. 3035-3040.
24. Johnson E. A., Bouehof F., Demain A. L. Regulation of cellulase formation in Clostridium thermocellum // J. Gen. Microbiol. —
1985. — V. 131. — P. 2303-2308.
25. Canevascini G., Coudray M. R, Rey J. P. et al. Induction and catabolic repression of cellu-lase synthesis in the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile // Ibid. — 1979. — V. 110. — P. 291-303.
26. Messner R, Kubicek-Pranz E. M., Gsur, A. et al. Cellobiohydrolase II is the main conidial bound cellulase in Trichoderma reesei and other Trichoderma strains // Arch. Microbiol. — 1991. — V. 155. — P. 601-605.
27. Kubicek C. P. The cellulase proteins of T. reesei: structure, multiplicity, mode of action and regulation of formation // Adv. Bio-chem. Eng. — 1992. — V. 45. — P. 1-27.
28. Cooper R. M., Wood R. K. S. Induction of synthesis of extracellular cell wall degrading enzymes in vascular wilt fungi // Nature. —
1973. — V. 246. — P. 309-311.
29. Wood T. M., Wilson C. A., McCrae S. L. et al. A highly active extracellular cellulose from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix frontalis // FEMS Microbiol. Lett. — 1986. — V. 34. — P. 37-40.
30. Tomme P., Warren R. A., Gilkes N. R. Cellulose hydrolysis by bacteria and fungi // Adv. Microbial. Physiol. — 1995. — V. 37. — Р. 1-81.
31. Рабинович М. Л., Мельник М. С., Болобова А В. Структура и механизм действия целюло-литических ферментов // Биохимия. — 2002. — Т. 67, вып. 8. — C. 1026-1050.
32. Kanda T., Wakabayashi K. Purification and properties of a lower-molecular-weight endo-cellulase from Irpex // Biochem. J. — 1980. — V. 87. — P. 1625-1634.
33. СиницынА П., Гусаков А В., Черноглазое В. М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов / М.:Издательство МГУ. — 1995. — С. 119-120.
34. Рабинович М. Л., Черноглазое В. М., Кле-сов А. А. Классификация целлюлаз, их распространенность, множественные формы и механизмы действия целлюлаз // Биоконверсия целлюлозы,: микробиология
и биохимия. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. — М., 1988. — Т. 11. —
С. 8-149.
35. Wood T. M., McCrae S. L. Cellulase from Fusarium solani: purification and properties of the C1 component // Carbohyd. Res. — 1977. — V. 57. — P. 117-133.
36. Bhat K. M., Hay A J., Claeyssens M,, Wood T. M. Study of the mode of action and site specificity of the endo-(1-4)-[3-D-glucanases of the fungus Penicillium pinophilum with normal, 3H labelled, reduced and chromogenic cellooligosaccharides // Biochem. J. —
1990. — V. 266. — P. 371-378.
37. McHale A., Coughlan M. P. Synergistic hydrolysis of cellulose by components of the extracellular cellulase system of Talaro-myces emersonii // FEBS Lett. — 1980. — V. 117. — P. 319-322.
38. Wood T. M., MeCrae S. L. Purification and some properties of the extracellular a-glu-cosidase of the cellulolytic fungus, Tricho-derma koningii // J. Gen. Microbiol. —
1982. — V. 128. — P. 2973-2982.
39. Vrsanska M., Biely P. The cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei QM 9414: action on cello-oligosaccharides // Carbohydr. Res. —
1992. — V. 227. — P. 19-27.
40. Eriksson K. E., Wood T. M. Biodegradation of cellulose // Biosynthesis and Biodegradation of Wood Components (Higuchi T., ed.). — New York: Academic Press, 1985. — P. 469-503.
41. Gum E. K. Jr., Brown R. D. Jr. Structural characterization of a glycoprotein cellulase,
1,4-13-D-glucan cellobiohydrolase C from Trichoderma viride // Biochem. Biophys. Acta. — 1976. — V. 466. — P. 371-386.
42. Moloney A. P., McCrae S. I., Wood T. M. Isolation and characterization of the 1,4-13-D-glucan glucanohydrolases of Talaromyces emersonii // Biochem. J. — 1985. — V. 225. — P. 365-374.
43. Sprey B., Lambert C. Titration curves of cel-lulases from Trichoderma reesei: demonstration of cellulase-xylanase-b-glucosidase containing complex // FEMS Microbiol. Lett. —
1983. — V. 18. — P. 217-222.
44. Banehop T. The anaerobic fungi in rumen fibre digestion // Agric. Environ. — 1981. — V. 6. — P. 339-348.
45. Lowe S. E., Theodorou M. K., Trinei A. P. J. Cellulase and xylanase of an anaerobic rumen fungus grown on wheat straw, wheat straw holocellulose, cellulose and xylan // Appl. Environ. Microbiol. — 1987. — V. 53. — P. 1216-1223.
46. Wilson C. A., Wood T. M. The anaerobic fungus Neocallimastix frontalis: isolation and properties of a cellulosome-type enzyme fraction with the capacity to solubilize
hydrogen bond-ordered cellulose // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 1992. — V. 37. — P. 12б — 129.
47. Srisodsuk M., Lehtio J., Linder M. et al. Trichoderma reesei cellobiohydrolase I with an endoglucanase cellulose-binding domain: action on bacterial microcrystalline cellulose // J. Biotechnol. — 1997. — V. б7, N1-3. — P. 49-б7.
48. Sinitsyn A. P., Gusakov A. V., Grishutin S. G. et al. Application of microassays for investigation of cellulase abrasive activity and backstaining // J. Biotechnol. — 2001. — V. 89, N2-3. — P. 233-238.
49. Barr B. K., Hsieh Y.-L., Ganem B., Wilson D. B. Identification of two functionally different classes of exocellulases // Biochemistry. — 1996. — V. 3б, N2. — P. б86-б92.
60. Charnock S. J., Spurway T., Xie H. et al. The topology of the substrate binding clefts of glycosyl hydrolase family 10 xylanases are not conserved // J. Biol. Chem. — 1998. — V. 273, N48. — Р. 32187-32199.
61. Озерецковская О.Л., Леонтьева Г.В., Ча-ленко Г.И. и др. О природе олигосахаринов картофеля // Прикл. биохим. микробиол. —
1993. — Т. 29, № б. — С. 7б7-764.
62. Morag E., Bayer E. A., Hazlewood G. P. et al. Cellulase Ss (CelS) is synonymous with the major cellobiohydrolase (subunit S8) from the cellulosome of Clostridium thermocellum // Appl. Biochem. Biotecnol. — 1993. — V. 43, N2. — P. 147-1б1.
63. Рабинович М. Л., Мельник М. С., Болобо-ваА.В. Целлюлазы микроорганизмов (обзор) // Прикл. биохим. микробиол. — 2002. — Т. 38, №4. — C. 3бб-373.
64. Черноглазов В. М., Клесов А. А. Изоферменты эндоглюканазы в целлюлазных комплексах: различное сродство к целлюлозе и неодинаковая роль в гидролизе нерастворимого субстрата // Биохимия. — 1983. — Т. 48, №3. — С. 369-377.
бб. Рабинович М. Л., Новикова Т. В., Клесов А. А., Березин И. В. Специфичность сорбции цел-лобиогидролазы I Trihoderma reesei на производных целлюлозы // Биоорг. химия. —
198б. — Т. 11. — С. 1343-1347.
66. Coughlan M. P. Cellulases: Production properties and applications // Biochem. Soc. Trans. — 198б. — V. 13. — P. 40б-406.
67. Mandels M. Applications of cellulases // Ibid. — 198б. — V. 13. — P. 414-41б.
68. Wood T. M. Preparation of crystalline, amorphous and dyed cellulose substrates // Wood, W. A., Kellogg, S. T. (Eds.), Meth. Enzymol. — 1988. — V. 160. — P. 19-20.
69. Wood T. M. The cellulase of Fusarium solani. Resolution of the enzyme complex // Bio-chem. J. — 1969. — V. 11б. — P. 4б7-464.
60. Schiraldi C., Martino A., Acone M. et al. Effective production of a thermostable alpha-glucosidase from Sulfolobus solfatari-cus in Escherichia coli exploiting a microfiltration bioreactor // Biotechnol. Bioeng. —
2000. — V. 70, N6. — Р. 670-676.
61. Wood T. M., MeCrae S. L. The purification and properties of the C1 component of Tricho-derma koningii cellulases // Biochem. J. — 1972. — V. 128. — P. 1183-1192.
62. Mandels M., Andreotti R., Roche C. Measurement of saccharifying cellulase // Biotechnol. Bioeng. Syrup. — 1976. — V. 6. — P. 17-23.
63. Somogyi M. Notes on sugar determination // J. Biol. Chem. — 19б2. — V. 19б, N1. — P. 19-23.
64. Nummi M., Fox E.C., Niku-Paavola M. L. et al. Nephelometric and turbidometric assays of cellulase activity // Anal. Biochem. — 1981. — V. 116. — P. 133-136.
6б. Marsh C. B., Merola G. V., Simpson M. E. Experiments with an alkali swelling-cen-trifuge test applied to cotton fiber // Text. Res. J. — 19б3. — V. 23. — P. 831.
66. Lee Y. J., Kim B. K., Lee B. H. et al. Purification and characterization of cellulase produced by Bacillus amyoliquefaciens DL-3 utilizing rice hull // Biores. Technol. — 2008. — V. 99, N2. — Р. 378-386.
67. Bischoff K. M., Rooney A. P., Li X. L. et al. Purification and characterization of a family б endoglucanase from a moderately thermophilic strain of Bacillus licheniformis // Biotechnol. Lett. — 2006. — V. 21. — Р. 1761-176б.
68. Hirasawa K., Uchimura K., Kashiwa M. et al. Salt-activated endoglucanase of a strain of alkaliphilic Bacillus agaradhaerens // Antonie Van Leeuwenhoek. — 2006. — V. 89, N2. — Р. 211-219.
69. Voget S., Steele H. L., Streit W. R. Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase // J. Biotechnol. — 2006. — V. 126, N1. — Р. 26-36.
70. Manikandan K., Jagtap S., Rao M., Ramaku-mar S. Crystallization and preliminary X-ray characterization of a thermostable low-mole-cular-weight 1,4-beta-D-glucan glucohydro-lase from an alkalothermophilic Thermomo-nospora sp. // Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. — 2006. — V. 62, Pt. 4. — Р. 38б-387.
71. Chaabouni S.E., Mechichi T., Limam F. et al. Purification and characterization of two low molecular weight endoglucanases produced by Penicillium occitanis mutant Pol 6 // Appl. Biochem. Biotechnol. — 200б. — V. 12б, N2. — Р. 99-112.
72. Bronnenmeier K., Rucknagel K. P., Staudenbauer W. L. Purification and properties of a novel type of exo-1,4-beta-glucanase (avicelase II)
from the cellulolytic thermophile Clostridium stercorarium // Eur. J. Biochem. —
1991. — V. 200, N2. — Р. 379 — 385.
73. El-Gindy A. A., Saad R. R., Fawzi E. Purification and some properties of exo-1,4-beta-glu-canase from Chaetomium olivaceum // Acta Microbiol. Pol. — 2003. — V. 52, N1. — Р. 35-44.
74. Sanchez M. M., Pastor F. I., Diaz P. Exomode of action of cellobiohydrolase Cel48C from Paenibacillus sp. BP-23. A unique type of cellulase among Bacillales // Eur. J. Bio-chem. — 2003. — V. 270, N13. — Р. 2913-2919.
75. Valaskova V., Baldrian P. Degradation of cellulose and hemicelluloses by the brown rot fungus Piptoporus betulinus — production of extracellular enzymes and characterization of the major cellulases // Microbiology. — 2006. — V. 152, Pt. 12. — Р. 3613-3622.
76. Seidle H. F., Marten I., Shoseyov O., Huber R. E. Physical and kinetic properties of the family 3 beta-glucosidase from Aspergillus niger which is important for cellulose breakdown // Protein J. — 2004. — V. 23, N1. — Р. 11-23.
77. Ogura J., Toyoda A., Kurosawa T. et al.
Purification, characterization, and gene analysis of cellulase (Cel8A) from Lysobacter sp. IB-9374 // Biosci. Biotechnol.
Biochem. — 2006. — V. 70, N10. — Р. 2420-2428.
78. Sapre M. P., Jha H., Patil M. B. Purification and characterization of a thermostable-celulase free xylanase from Syncepha-lastrum racemosum Cohn. // J. Gen. Appl. Microbiol. — 2005. — V. 51, N6. — Р. 327-234.
79. Grishutin S. G., Gusakov A.V., Markov A.V. et al. Specific xyloglucanases as a new class of polysaccharide-degrading enzymes // Biochim. Biophys. Acta. — 2004. — V. 1674, N3. — Р. 268-281.
80. Бухтояров Ф. Е., Устинов Б. Б., Салано-вич Т. Н. и др. Целлюлазный комплекс гриба Chrysosporium lucknowense: выделение и характеристика эндоглюканаз и целло-биогидролаз // Биохимия. — 2004. — Т. 69, № 5. — С. 666-677.
81. Столбова В. В. Целлюлазы термофильных анаэробных бактерий : (Биосинтез, выделение, свойства) Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — 1994. — 20 с.
82. Qi M., Jun H.-S., Forsberg C. W. Characterization and synergistic interactions of Fibro-bacter succinogenes glycoside hydrolases // Appl. Environ. Microbiol. — 2007. — V. 73, N19. — Р. 6098-610б.
83. Thongekkaew J., Ikeda H., Masaki K., IefujiH. An acidic and thermostable car-boxymethyl cellulase from the yeast Cryptococcus sp. S-2: Purification, characterization and improvement of its recombinant enzyme production by high cell-density fermentation of Pichia pastoris // Protein Expr. Purif. — 2008. — V. 60, N2. — P. 140-146.
84. Nozaki K., Seki T., Matsui K. et al. Structure and characteristics of an endo-beta-1,4-glu-canase, isolated from Trametes hirsuta, with high degradation to crystalline cellulose // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 2007. — V. 71, N10. — Р. 237б-2382.
8б. Kim H. W., Takagi Y., Hagihara Y., Ishikawa K. Analysis of the putative substrate binding region of hyperthermophilic endoglucanase from Pyrococcus horikoshii // Biosci. Bio-technol. Biochem. — Ibid. — Р. 2б8б-2б87.
86. Beukes N., Pletschke B. I. Effect of sulfur-containing compounds on Bacillus cellulo-some-associated CMCase and Avicelase activities // FEMS Microbiol Lett. — 2006. — V. 264, N2. — Р. 226-231.
87. Magalhaes P. O., Ferraz A., Milagres A. F. Enzymatic properties of two beta-glucosi-dases from Ceriporiopsis subvermispora produced in biopulping conditions // J. Appl. Microbiol. — 2006. — V. 101, N2. — Р. 480-486.
88. Sul O. J., Kim J. H., Park S. J. et al. Characterization and molecular cloning of a novel endoglucanase from Trichoderma sp. C-4 // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2004. — V. 66, N1. — Р. 63-70.
89. Yun S. I., Jeong C. S., Chung D. K. et al. Purification and some properties of a beta-glucosidase from Trichoderma harzianum type C-4 // Biosci. Biotechnol. Biochem. —
2001. — V. 6б, N9. — Р. 2028-2032.
90. Lynd L. R., Weimer P. J., van Zyl W. H. et al. Microbial eellulose utilization: fundamentals and biotechnology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 2002. — V. 66, N3. — Р. б06-б77.
ЦЕЛЛЮЛОЗОДЕГРАДИРУЮЩИЕ СИСТЕМЫ МИКРООРГАНИЗМОВ: БИОСИНТЕЗ, СВОЙСТВА И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ
Н. В. Борзова, Л. Д. Варбанец
Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев
Е-mail:varbanets@serv.imv.kiev.ua
Обзор посвящен энзиматическим системам микроорганизмов, которые обеспечивают биодеградацию целлюлозы. Рассмотрены вопросы классификации эндо-, экзоглюканаз и Р-глю-козидаз, регуляции их биосинтеза в микробной клетке, биохимических свойств, а также условий выделения и очистки. Особое внимание уделено сравнению целлюлозодеградирующих систем аэробных и анаэробных микроорганизмов, их структурным и функциональным особенностям. Приведены современные данные о возможных механизмах биодеструкции целлюлозы.
Ключевые слова: целлюлазы, деградация целлюлозы, свойства, структура и функции цел-люлаз, механизм действия.
THE CELLULOSE DEGRADING SYSTEMS OF MICROORGANISMS: BIOSYNTESIS, PROPERTIES, STRUCTURAL AND FUNCTIONAL CHARACTERISTICS
N. V. Borzova, L. D. Varbanets
Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua
Enzyme systems of microorganisms that provide biodegradation of cellulose are discussed. Particular attention is given to endo-, exoglu-canases, and P-glucosidases classification, its biosynthesis regulation in microbial cells, biochemical properties and isolation and purification procedures as well. The review is focused on cellulose degrading systems of aerobe and anaerobe microorganisms, their structure and functional characteristics. Data concerning possible mechanism of cellulose destruction are discussed.
Key words: cellulase, degradation of cellulose, properties, structure and function of cellulases, mechanism of action.
