CC BY
60
УДК 613.84-053.81-073:616.155.2
7. Jarrar D., Chaudry I. H., Wang P. // Int J Mol Med. 1999. Dec. Vol. 4. № 6. P. 575-583.
8. Knaus W., Douglas P., Wagner D. // Chest. 1991. Vol. 100. P. 1619-1636.
9. Le Gall J. P, Lemeshow S., Saulnier F. // JAMA. 1993. Vol. 270. P. 2957-2963.
10. Marshall J. C., Cook D., Cristou N. // Crit.Care. 1995. Vol. 23. P. 1638-1652.
11. Marshall J. C. // Sepsis. 1997. № 1. P. 11-12.
12. Russell J. A., Singer J., Bernard G. R., Wheeler A., Fullkerson W., Hudson L., Schein R., Summer W., Wright P., Walley K. R. // Crit.Care. 2000. Vol. 28. № 10. P 3405-3411.
13. Vincent J. L. Sepsis. 1997. Vol. 1. № 1. P. 53-54.
V V GOLUBTSOV, I. B. ZABOLOTSKIH, S. A. TKACHUK
DEVELOPMENT OF MUL TIPLE ORGAN FAILURE DEPEND ON FUNCTIONAL STA TEA T SEPSIS
The article summaries the results of clinical observation and treatment 59 sepsis patients. Definition were contained
traditional methods of research and omega-potential (OP) registered. Fixed - registration OPfrom -14 up to + 20 mV, after severe sepsis or septic shock, theposttraumaticperiod by serious current is accompanied or organ failure (64,3% after septic shock, 53,3% after severe sepsis). Registration OPfrom -15 up to -25 mV, MODS absence assumes. Registration OPfrom -26 up to -60 mVpredi cti on sepsis or severe sepsis with MODS.
The heaviest condition at septic patients is marked at decompensated functional condition (FC) development of a septic shock that corresponds to 82 (79,3/83) points on scale SAPS II. At patients, whose condition was estimated as a sepsis and a heavy sepsis, on a background subcompensated FC, weight corresponded to 55 (51/56,3) points on SAPSII. The least weight - 51 (46,8/53,4) point, characterized development SIRS or a sepsis on a background compensated FC.
Л. И. КАТЕЛЬНИЦКАЯ, М. К. АХВЕРДИЕВА, А. Э. МАЦИОНИС1, П. Э. ПОВИЛАЙТИТЕ1
ТРОМБОЦИТ - «КЛЕТКА-МИШЕНЬ» ПРИ КУРЕНИИ
ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет», 2ГУЗ «Ростовское областное патолого-анатомическое бюро»
Курение является общепризнанным и достаточно хорошо изученным фактором риска развития многих хронических неинфекционных заболеваний [5-8, 10, 13]. Большинство известных патогенетических механизмов влияния курения на сердечно-сосудистую систему (ССС) описаны у лиц старших возрастных групп, имеющих не один фактор риска и длительный стаж табакокурения. Изменения ультраструктурных параметров тромбоцитов (ТЦ) также изучены у курильщиков со стажем курения не меньше 5 лет, имеющих клинические проявления той или иной патологии ССС. В связи с этим представляет интерес выявление ранних донозо-логических изменений ССС в процессе ее дезадаптации к действию фактора риска.
Материалы и методы
В данное исследование включены здоровые молодые курильщики 17-19 лет с предварительно исключенной сердечно-сосудистой патологией. Стаж курения исследуемых не превышал 2 лет, среднее количество выкуриваемых сигарет - 9,6 ± 0,4 штуки в день.
Объектами электронно-микроскопического и морфометрического исследования являлись фракции тромбоцитов (ТЦ) из периферической крови 8 курильщиков и некурящих доноров того же возраста, полученные в одинаковых временных и климатических условиях. Выделенные фракции в течение трех минут промывали холодным фосфатным буфером (рН 7,2-7,4) и затем обрабатывали для электронной микроскопии, делая срезы с кусочков размером не более 1 мм3. Использовали общепринятые методы обработки материала [9]. Фиксацию осуществляли в 2,5%-ном растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) в течение 1,5 часа при температуре 40 С и пост-фиксировали при той же температуре в 1%-ном раство-
ре четырехокиси осмия на том же буфере в течение одного часа. Проводку осуществляли в автомате для электронно-микроскопической проводки «Linx» (Leika, Германия) по стандартной прикладной программе. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим и азуром11-основным фуксином. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме «Ultracut» (Leica, Германия), контрастировали в аппарате «Ultrastаiner» (Leica) и просматривали в электронном микроскопе Philips EM-208. Для морфометрического анализа использовали ультратонкие срезы фракции ТЦ. Вывод изображения на компьютер осуществляли с помощью телекамеры «Gatan» (USA), снабженной контрольным монитором. Использовали аппаратно-программный комплекс для морфометрии AnalySis (Soft-Imaging Software, Germany), включающий PC/Pentium-100 и прикладные программы ввода и анализа изображения. Для анализа вводили поля зрения при увеличении x 5200, наиболее оптимальном для точного и одновременного измерения морфометрических параметров всей клетки и внутриклеточных структур ТЦ. Калибровку осуществляли введением изображения стандартной калибровочной решетки (Sigma) при том же увеличении. Также использовали лицензированный пакет программ для морфометрии «Sigma/Scan Image» (Jendal Scientific, Germany). Для объективизации данных пользовались методом случайного систематического подбора препаратов, описанным в литературе [11]. Проводили случайный отбор 3 блоков от каждого человека, наличие ТЦ контролировали под световым микроскопом на полутонких срезах. C выбранных блоков получали серию полутонких срезов. Шаг серии составлял 8 микрон, после чего получали серию ультратонких срезов для анализа в электронном микроскопе и последующей морфометрии. Строго соблюдалось требование
одинаковой толщины (300 ангстрем) и контраста. Для стандартизации контраста обработку срезов на сетках проводили одновременно в аппарате иКгаБ1атег (Ьеюа) и использовали фирменные (1_еюа) стандартные наборы растворов уранилацетата и цитрата свинца. С каждого образца вводилось 50 случайных полей зрения, таким образом, морфометрировалось по 150 ТЦ от каждого человека. Количественная оценка ультраструктуры ТЦ проводилась по следующим базовым параметрам: площадь, периметр, максимальный диаметр, минимальный диаметр ТЦ. Оценка состояния гра-нуломеров ТЦ проводилась по следующим базовым параметрам: количество, площадь светлых а-гранул, количество, площадь темных гранул. При вычислении периметра учитывали также плазматические мембраны внутренней примембранной системы вакуолей ТЦ, связанной с наружной плазматической мембраной. Вычислялись производные параметры: процентное соотношение средней площади, занимаемой гранулами (светлыми или темными), к средней площади ТЦ; число гранул (светлых или темных) на один тромбоцит; отношение среднего периметра ТЦ к средней площади.
Результаты исследования
Нами получено, что ультраструктура ТЦ из фракций некурящих доноров соответствует нормальному строению неактивных кровяных пластинок здоровых людей, описанному в работах других авторов, применявших сходные методы обработки тромбоцитарных фракций [1, 4]. Так, основная часть ТЦ имеет округлую или сферическую форму, наружная мембрана, как правило, покрыта хорошо выраженным слоем гликокаликса (рис. 1). Гиаломер, или цитоплазма ТЦ, имеет мелкогранулярную структуру. По периферии клетки цитоплазма выглядит, как узкий ободок, не содержащий орга-нелл, за исключением единичных, беспорядочно разбросанных частиц гликогена. Органоидная часть, или грануломер, представлена одной-двумя мелкими митохондриями, многочисленными цистернами и трубочками системы канальцев, вакуолярным аппаратом и гранулами, свободно располагающимися в цитоплазме. Визуально наблюдается также некоторая вариабельность в количестве, электронной плотности и рас-
Рис. 1. Ультраструктура тромбоцита в контрольной фракции некурящих доноров. Ув. 48 000.
Условные обозначения: Т - тромбоцит, г - гранула, стрелка - гликокаликс
пределении гранул, однако они всегда располагаются в цитоплазме свободно, не формируют конгломератов в центральной части клеток.
При исследовании тромбоцитарных фракций курильщиков выявлены существенные ультраструктурные сдвиги. Обращает внимание деформация ТЦ: практически все они имеют уродливую отросчатую форму, формирование как крупных, толстых отростков в виде пузырей, так и тонких, бичевидных отростков (рис. 2). ТЦ курильщиков располагаются более плотно, чем в контроле, имеет место формирование плотных контактов между их отростками. Большая часть тромбоцитов курильщиков оказалась вакуолизирована за счет расширения периферической и внутренней системы канальцев, выявлено значительное количество деграну-лированных клеток, появляются крупные мегатромбоциты, содержащие увеличенное количество гранул. Регистрируются ТЦ с повышенной электронной плотностью цитоплазмы. Псевдоподии причудливой формы, плотное расположение тромбоцитов, формирование межклеточных контактов между отростками, конденсация грануломера расцениваются нами как признаки активации и повышенной адгезивной способности тромбоцитов [2-4]. О повышенной проагрегацион-ной способности тромбоцитов курильщиков говорит появление в цитоплазме четко визуализируемых тяжей микрофиламентов, особенно многочисленных в периферических участках и вокруг грануломера. Выраженные отличия регистрируются по содержанию и распределению гранул гликогена в цитоплазме (рис. 3). Если в контрольной серии гликоген располагался равномерно по всей цитоплазме в виде отдельных частиц, то у курильщиков отмечено формирование периферических «озер», состоящих из конгломератов гликогена. Увеличение содержания и перераспределение гликогена могут быть расценены как компенсаторная реакция в ответ на гипоксическое повреждение ТЦ. Тромбоцитам большинства млекопитающих характерен высокий уровень энергетического обмена, поэтому ТЦ являются уязвимыми к любому гипоксическому повреждению. Повышение агрегации, формирование тесных конгломератов из клеток, как и само вдыхание табачного дыма, способствуют развитию гипоксии отдельных ТЦ.
Рис. 2. Ультраструктура тромбоцитарной фракции из крови курильщиков. Отросчатые и вакуолизированные формы клеток, осмиофильные ТЦ.
Ув. 15 500
Рис. 3. Конденсация грануломера в тромбоците из крови курильщика, увеличение содержания и перераспределение глыбок гликогена. Ув. 25 000. Условные обозначения: г - гранулы, стрелками указаны скопления гликогена
При этом значение средней площади ТЦ достоверно не изменяется, хотя и имеется тенденция к ее уменьшению. Значительно и достоверно (р<0, 01) - на 13% -увеличивается такой производный параметр, как длина мембраны тромбоцита, приходящаяся на 1 мкм2 его площади. Этот параметр косвенно характеризует состояние мембранорецепторного аппарата ТЦ, судя по выявленным сдвигам, его размеры и функциональная активность в группе курильщиков увеличены. Вполне вероятно, что у курильщиков констатирован феномен «расслабления» наружной мембраны ТЦ, который и приводит к формированию отростков и псевдоподий. Морфометрическое исследование параметров грануломера проводилось отдельно для а-гранул и для
Морфометрические параметры тромбоцитов курильщиков и некурящих доноров (М + м)
Параметр Контроль Курильщики
Периметр тромбоцитов (мкм) 9,58 ± 0,340 10,61 ± 0,274 *
Площадь тромбоцитов (мкм2) 2,42 ± 0,089 2,35 ± 0,073
Длина мембраны, приходящейся на 1 мкм2 4,24 ± 0,173 4,83 ± 0,129 **
% площади тромбоцитов, занимаемой темными гранулами 0,86 ± 0,137 1,69 ± 0,134 **
% площади тромбоцитов, занимаемой альфа-гранулами 5,17 ±0,624 7,19 ± 0,728 *
Площадь темных гранул (мкм2) 0,0311 ± 0,0011 0,0403 ± 0,0011***
Периметр темных гранул (мкм) 0,06761±0,01241 0,7625±0,01090***
Число темных гранул на 1 клетку 0,69 ± 0,084 1,04 ± 0,124*
Площадь альфа-гранул (мкм2) 0,0287 ± 0,00047 0,0331 ±0,00043***
Периметр альфа-гранул (мкм) 0,6484 ± 0,00538 0,6905±0,00471***
Число альфа-гранул на 1 клетку 4,43 ± 0,403 4,77 ± 0,345
Для получения более полных и объективных данных об ультраструктурных альтерациях тромбоцитов, связанных с курением, а также для выявления минимальных сдвигов в их тонком строении проводилось морфометрическое изучение некоторых параметров ультраструктуры кровяных пластинок. Результаты морфометрического анализа ТЦ в контрольной группе и в группе курящих представлены в таблице.
Анализ результатов исследования, представленный в таблице, свидетельствует о том, что курение приводит к достоверному (р<0,5) увеличению средней протяженности наружной мембраны ТЦ - на 10%, что по-видимому, связано с установленным при визуальном наблюдении фактом деформации ТЦ у курильщиков.
Примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 - уровни значительности различия между сравниваемыми параметрами.
электронноплотных темных гранул (5ОТ-органелл). Полученные результаты свидетельствуют, что в группе курящих происходит значительное и достоверное увеличение количества темных гранул и занятой ими площади цитоплазмы (практически в 2 раза), а также достоверно увеличиваются размеры гранул - площадь и периметр (р<0,001). Можно предположить, что рост числа темных гранул связан с повышенной аккумуляцией серотонина ТЦ курильщиков. Число а-гранул не имело различий в контрольной и опытной группах, однако процент занятой ими площади цитоплазмы в тромбоцитах курильщиков достоверно (р<0,05) увеличивается на 40%.
В контроле основная часть ТЦ (70%) содержит не более трех гранул, а в группе курильщиков наблюдается гораздо больший разброс и увеличение процента ТЦ с повышенным содержанием а-гранул (55%). Эти изменения, судя по нашим данным, обусловлены высокодостоверным увеличением размеров а-гранул и их периметра (р<0,001).
Сопоставление полученных данных позволяет сделать заключение о сочетании у курильщиков двух процессов: активации синтеза компонентов а-гранул (увеличение размеров) и усиления выброса их содержимого (неизменность количества). Учитывая, что в а-гра-нулах содержатся факторы свертывающей и каллекре-ин-кининовой системы, данные изменения можно гипотетически рассматривать как предиктор тромбооб-разования на интактных сосудах у молодых здоровых курильщиков. Дополнительную информацию дает изучение процентного распределения ТЦ в общей популяции по изученным параметрам. Показано, что у курильщиков увеличивается содержание как мелких, так и крупных ТЦ, уменьшено число ТЦ средних размеров, в связи с чем среднее значение остается неизменным. Полученные результаты косвенно указывают на ускорение оборота кровяных пластинок у курильщиков, поскольку, по данным литературы, их размеры характеризуют возраст клетки [4]. Во фракциях тромбоцитов курильщиков получено увеличение процентного содержания как юных, крупных форм, так и, что особенно существенно, мелких старых.
Таким образом, визуальный и морфометрический анализ ультраструктуры ТЦ позволил выявить объективные отличия в строении кровяных пластинок курящих и некурящих доноров.
На основе проведенного нами анализа ультраструктуры тромбоцитов можно заключить, что даже у курильщиков со стажем до 2 лет и минимальным количеством выкуриваемых сигарет в день имеются не только пограничные, но и патологические изменения. Эти изменения заключаются не только в повышении агре-гационной способности ТЦ, но и в их дистрофических стигмах (периферические «озера» гликогена, появление ТЦ с повышенной электронной плотностью). Это весьма существенно, поскольку дистрофия является первым звеном в цепи патологических изменений ТЦ: дистрофия - дегенерация - дегрануляция - разрушение клетки, при этом нам не известно, насколько эти этапы удалены друг от друга. Признаков дегрануляции ТЦ нами выявлено не было, хотя для окончательного суждения необходимо определение в цитоплазме ТЦ содержащихся в гранулах факторов свертывания, биологически активных веществ, ферментов. Нами получено свидетельство повышенного депонирования серотонина в ТЦ курильщиков (достоверное увеличение количества темных гранул), а также усиленного синтеза компонентов а-гранул и их выброса, о чем свидетельствует значительное увеличение занимаемой ими площади при неизменности их количества. Данные изменения можно расценить как своеобразную
«гипертрофию» ТЦ, связанную, с одной стороны, с их повышенной функциональной активностью, с другой -с активацией захвата серотонина, каллекреина из крови курильщиков.
Эти пока обратимые сдвиги тонкого строения тромбоцита являются донозологическим базисом формирования сердечно-сосудистых заболеваний, «ценой», которую платит организм курильщика за адаптацию к воздействию такого фактора риска хронических неинфекционных заболеваний, каким является курение.
Поступила 18.10.2006
ЛИТЕРАТУРА
1. Балуда В. П., Балуда М. В., Деянов И. И. и др. Физиология системы гемостаза. М., 1995. 245 с.
2. Балуда В. П., Нестайко Г. В. Ультраструктура тромбоцитов как показатель их функционального состояния // Пробл. гематол. и перелив. крови. 1972. Т. 18. № 9. С. 3-10.
3. Васильева Е. Ю. Морфологические типы тромбоцитов здоровых людей: Сб. науч. тр. М., 1982. С. 37-39.
4. Вашкинель В. К., Петров М. Н. Ультраструктура и функция тромбоцитов человека. Л.: Наука, 1982. 88 с.
5. Кательницкая Л. И., Быков А. Т., Демакова Э. П. Многофакторная профилактика хронических неинфекционных заболеваний // Актуальные проблемы профилактики неинфекционных заболеваний: Тез. научн. конф. М., 1995. С. 79.
6. Константинов В. В. Особенности эпидемиологии ишемической болезни сердца и факторов риска среди мужского населения в городах различных регионов: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1995. 24 с.
7. Оганов P Г, Масленникова Г Я., Шальнова С. А., Деев А. Д. Значение сердечно-сосудистых и других неинфекционных заболеваний для здоровья населения России // Профилактика заболеваний и укрепление здоровья. 2002. № 2. С. 3-7.
8. Тимофеева С. Г. Борьба с курением среди студентов как составная часть комплекса мероприятий ранней профилактики сердечно-сосудистых заболеваний: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1991. 29 с.
9. Bozzola J. J., Russel L. D. Electron Microscopy: principles and techniques for biologists. Boston: Jones and Bastlett Publishers, 1992. 542 р.
10. Idham I., Kalim H., Kusmana D. Coronary risk factor among ethnic Baduy: XIII World Congress of Cardiology. Rio de Janeiro, 1998. P 35-38.
11. Mayhew T. M. Efficient and unbiased sampling of nerve fibers for estimating fiber number and size // Methods in Neurosciences. Vol. 3. Quantitative and Qualitative Microscopy (ed. M. Conn), Academic Press, Inc., 1990. P. 172-187.
12. Nakayama T., Yokoyama T., Youshiike N. Riskfactors for stroke in the middle-aged and the elderly people with special reference to population attributabl risk percent: 4-th International Conference on Preventive Cardiology. Montreal, 1997. Vol. 13. P. 43 (abstr.)
13. Takkunen N. et. all. The impact of cardiovascular risk factor long-term mortalily in eldery: XIII World Congress of Cardiology. Rio de Janeiro, 1998. C. 26-30.
L. I. KATELNITSKAJA, M. K. AHVERDIEVA, A. E. MATSIONIS, P E. POVILAJTITE
TROMBOTSIT - «CELL-TARGET.» AT SMOKING
Ultrastructural changes of trombocytes at young smokers with preliminary excluded cardiovascular pathology have been studied. Signs of increase activation and adhesive abilities of trombocytes have been resealed along with indirect signs oh changing of membrane-receptoric apparatus, increasing of deposition of bioactive substances in trombocytes granules and sings of dystrophy and hypoxic damage of trobocytes. The changes of morphometric parameters are marked despite the minimal leuth of smoking and amound of smoke cigarettes.
