CC BY
252
АСТРАХАНСКИЙ ВЕСТНИК ЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ
№ 2 (28) 2014. с.24-36.
УДК 582.232
ТОКСИЧНЫЕ ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНЫЕ «ЦВЕТЕНИЯ» В КРАСНОМ ОЗЕРЕ (ЛЕНИНГРАДСКАЯ ОБЛ., РОССИЯ) Людмила Николаевна Волошко Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН
l.voloshko@inbox.ru
Иржи Копецкий Павел Хроузек Институт Микробиологии АН Чешской республики
Ленинградская область, Красное озеро, «цветение» воды, цианобактерии, биологически активные вещества, токсины.
Анализ экстрактов биомассы «цветение» воды в Красном озере (Ленинградская обл.) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) выявил высокое разнообразие гепатотоксичных циклических пептидов (микроцистинов), ингибиторов ферментов (цитотксинов). Микроцистины вызывают острое отравление животных и людей. Полученные результаты указывают на антропогенную эвтрофикацию озера и опасное снижение качества воды.
TOXICAL WATER BLOOMS PRODUCED BY CYANOBACTERIA IN THE KRASNOE LAM
(LENINGRAD REGION, RUSSIA)
Ludmila N. Voloshko Komarov Botanical Institute RAS
l.voloshko@inbox.ru
Jiri Kopecky Pavel Hrouzek
Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic
Leningrad region, Krasnoe lake, water blooms, cyanobacteria, bioactive compounds, toxins
HPLC of the extracts in selected samples from the lake revealed a high diversity of toxins, including hepatotoxic cyclic peptides (microcystins), inhibitors of enzymes (cytoxins) and numerous unidentified substances. Microcystins cause acute poisoning of animals and humans and act as tumor promoters. The results specify on anthropogenic eutrophication of the lake and dangerous decrease in quality of the water.
Влияние урбанизированных территорий на природные объекты — одна из наиболее глубоких, активных и комплексных форм антропогенного воздействия, в том числе на водные системы. В связи с антропогенным загрязнением водоемов развитие токсигенных цианобактерий приобретает глобальный характер [22, 55, 56]. В последние десятилетия и в водоемах Северо-Запада России наблюдаются резкие изменения качественного и количественного состава водных биоценозов, включающие массовое развитие цианобактерий [4, 11, 27, 34]. Как правило, цианобактериальное «цветение» воды сопровождается выделением и накоплением в водной среде биологически активных веществ и токсинов, представляющих опасность для человека и животных [3, 6, 7, 8, 9, 29, 38, 59, 60].
24
Токсичные цветения могут вызывать тяжелые отравления у животных и могут представлять опасность для здоровья людей [2, 33, 59, 60, 61]. Цианобактерии производят нейротоксины и гепатотоксины. В Европе наиболее широко распространены гепатоксичные «цветения» воды [23]. Гепатотоксины разрушают клетки печени и являются канцерогенами.
В связи с высокой степенью опасности загрязнения водоемов продуктами метаболизма цианобактерий, представляется крайне необходимым изучение «цветений» воды и выявление разнообразия синтезируемых ими биологически активных веществ.
Обзор методов исследования биологически активных веществ
Биотестирование
Принцип биотестирования основан на оценке влияния токсических веществ на жизнедеятельность организмов, используемых в качестве тест-объектов [15, 16]. Тест-объектами могут быть как позвоночные (мыши, крысы, рыбы), так и беспозвоночные организмы, а также различные микроорганизмы [23]. Основными требованиями, предъявляемыми к тест-объектам, являются возможность их культивирования в лабораторных условиях и достаточно высокая чувствительность к различным токсинам.
Преимущества методов биотестирования заключаются в том, что они позволяют провести оценку токсичных соединений по обобщенному показателю — учитывая суммарное влияние различных токсических веществ, находящихся в клетке или воде. Хотя этим же методом можно оценивать биологическую активность очищенной фракции какого -либо соединения [44, 51]. Биологический метод является достаточно дешевым и простым в техническом исполнении, при этом требуются только лабораторные животные, а также в пределах нескольких минут или нескольких часов дается количественная и качественная оценка токсина [23]. Биологические методы позволяют изучать активность токсических веществ, механизм и направленность их действия на живых организмов. Главными недостатками данного подхода являются низкая чувствительность и специфичность в идентификации различных токсинов [26].
По продолжительности действия биологические опыты принято подразделять на острые (кратковременные) и хронические. Цель острых опытов — выявить летальные концентрации и проявляемые при этом симптомы. Летальное действие можно определять по степени повреждения группы организмов за стандартное время в зависимости от концентрации вещества или по срокам проявления повреждения в каждой концентрации вещества. В соответствии с этим, общая схема проведения опытов заключается в составлении серии концентраций вещества и регистрации количества или сроков летальных или иных проявлений. В первом случае подсчитывается ЛК5о (концентрация вещества, убивающая за конкретное время половину организмов, взятых в опыт) и ЛК100 (абсолютно смертельная концентрация, убивающая всех организмов за тот же срок). Если вещество за заданный срок вызывает не гибель, а иную поведенческую или физиологическую реакцию, то используется понятие эффективной концентрации (ЭК). Цель хронических опытов — уточнение летальных и определение границ сублетальных концентраций [13]. В настоящее время острые биологические эксперименты (особенно на мышах) широко применяются исследователями [30].
Биотестирование с использование позвоночных. Традиционно исследование цианобактериальной гепато- и нейротоксичности производиться путем внутрибрюшинного биологического анализа на мышах. Метод позволяет выявлять токсическое действие тех или иных цианобактерий, вне зависимости от природы токсиканта. Преимущество данного метода заключается в том, что он позволяет по симптомам отравления животных достаточно просто отличить действие гепатотоксинов от нейротоксинов и даже различить различные типы нейротоксинов [23]. Первые из них гепатотоксины называют «факторами быстрой смерти», вызывающими гибель лабораторных животных (мышей) в течение 1-4 ч; нейротоксины — «факторами очень быстрой смерти» (гибель в течение 2-30 мин). Метод биотестирования на мышах наиболее важен в медицинском аспекте, поскольку позволяет
экстраполировать результаты анализа на человека. Недостатки метода: низкая
чувствительность (250 нг г-1 мыши) внутрибрюшинное введение токсинов не всегда соответствует способу попадания токсинов в организм в природных условиях; требуется большое количество крупных тест-объектов (30); возникает этический аспект (36).
Общая схема проведения биологического анализа на мышах заключается в инъекции животным (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно) различных концентраций лиофилизированных клеток, спиртовых экстрактов, токсичных фракций, природной воды и выявлении ЛК50 через 4 ч после инъекции [12, 44, 49, 51, 52]. В некоторых случаях в качестве тест-объекта используются рыбы. Опыты с рыбами могут проводиться параллельно на икре, личинках и сеголетках [13]. Отмечено, что аквариумные виды рыб малочувствительны даже к высокому содержанию токсичных веществ.
Биотестирование с использование беспозвоночных. В острых опытах с беспозвоночными, так же как и при анализе на мышах, используют ряд различных концентраций клеток цианобактерий, лиофилизированной биомассы, токсичных веществ или разбавлений исследуемой воды, в которые помещают тест-объекты [13, 48]. Длительность острого эксперимента составляет 48-96 ч. При необходимости более глубокой оценки степени токсичности воды или культуры цианобактерии на беспозвоночные организмы, проводят хронические испытания на нескольких поколениях. Во многих странах мира стандартными тест-объектами при контроле токсичности водной среды и исследовании цианобактериальных токсинов являются дафнии - мелкие пресноводные планктонные ракообразные. Это обусловлено их высокой чувствительностью к токсикантам, устойчивостью лабораторной культуры и легкостью разведения. Кроме того, дафниевый тест очень доступен.
В качестве тест-объектов также могут использоваться личинки хирономид, личинки Aedes aegyptii, ракообразные Artemia salina и олигохета Tubifex tubifex. Чувствительность видов к микроцистину при проведении кратковременного опыта (24 ч) уменьшается в ряду: D. pulex, A. salina, T. tubifex.
Биотестирование с использование микроорганизмов. В ряде случаев биологическая активность цианотоксинов анализируется в отношении их влияния на микроорганизмы (бактерии, микроводоросли и грибы). Серии разведений цианотоксинов или исследуемой воды добавляются в культуру микроорганизмов, и анализируются изменение плотности культуры, морфологические или физиологические нарушения в клетках [13, 42]. В ряде случаев о степени токсичности судят по величине зон ингибирования роста вокруг участков, где помещены токсичные клетки или токсичное вещество при высеве тест -микроорганизмов на твердую питательную среду в чашках Петри (1, 32, 43).
Цитологические методы (биологические тесты in vitro)
Удобным подходом при анализе биологической активности цианобактериальных соединений является использование клеточных культур млекопитающих.
- Цитотоксичность in vitro. Для выявления цитотоксического воздействия цианобактериальных токсинов на жизнедеятельность клеточных культур, в частности, используется быстрый колориметрический анализ, разработанный Т. Мосманном [47]. При использовании этого метода в культуру клеток млекопитающих добавляется токсическое вещество и желтая тетразолиновая соль, которую клетки переводят в голубой формазановый продукт. Изменение окраски веществ фиксируется на спектрофотометре. Цитотоксичность проявляется в уменьшении активности дегидрогеназ и, следовательно, в способности клеток переводить тетразолиновую соль в формазан. Жизнеспособность клеток также можно учитывать по числу погибших клеток, подсчитанных флоуцитометром. В клеточные культуры добавляется пропидиумийодид, который селективно проникает через поврежденные цитоплазматические мембраны и вызывает свечение мертвых клеток [21].
- Гепатотоксичность in vitro. Анализ производиться на гепатоцитах млекопитающих. Цианобактериальные экстракты или токсины добавляются в клеточную культуру, и, по
активности дегидрогеназ (как и в случае с определением цитотоксичности), оценивается выживаемость клеток [21].
- Нейротоксичность in vitro. Метод выявления нейротоксинов был разработан в 1994 г. и основан на использовании поверхностных клеточных рецепторов. В качестве рецепторов могут быть использованы натриевые каналы из мозга крысы. Поскольку данный подход требует радиоактивного мечения токсинов, он не используется широко в настоящее время [23].
- Иммунотоксичность in vitro. В некоторых случаях анализ действия токсинов производиться на Т - и В-лимфоцитах из селезенки млекопитающих (мышей). После 48 ч выдерживания клеток с токсичным веществом в культуру добавляется 3Н -тимидин и, спустя еще 20 ч, измеряется радиоактивность ДНК лимфоцитов. Иммунотоксичность выявляется, если скорость пролиферации клеток уменьшается, о чем свидетельствует снижение радиоактивности ДНК клеток [21].
Анализ токсинов с использованием специфических реакций
Анализ анатоксина-а с использованием ацетилхолинэстеразы. Для выявления анатоксина-а и его количественной оценки используется способность токсина ингибировать ацетилхолинэстеразу. Концентрация анатоксина-а учитывается по количеству прореагировавшего с токсином фермента, поскольку данная реакция является необратимой [26, 63]. При использовании калориметрического подхода для количественной оценки анатоксина на спектрофотометре измеряют адсорбцию токсина ацетилхолинэстеразой. Концентрацию анатоксина выявляют по стандартной кривой, полученной для очищенного анатоксина-а [37].
Анализ микроцистина и нодуларина с использованием фосфатазы. Для выявления концентраций микроцистина и нодуларина используется их способность связываться с серин/треониновыми фосфотазами [23]. В фосфотазном ингибиторном анализе применяется такой же калориметрический подход, как и при оценке активности анатоксина. Для подсчета концентрации микроцистина используется стандартная кривая для очищенного микроцистина-LR [42]. Поскольку выяснилось, что цианобактерии могут иметь большое количество ферментов, обладающих способностью ингибировать фосфатазу, данный метод уже не является в достаточной степени достоверным [23].
Иммунологические методы
Рядом авторов были разработаны иммунологические анализы для выявления микроцистинов с использованием моноклональных антител [30]. Моноклональные антитела против микроцистина-LR, разработанные японскими исследовательскими группами, активно использовались для выявления микроцистина-LR в природных образцах. Однако использованные антитела оказались не чувствительными к остальным типам микроцистинов, комплексное выявление всех токсинов в пробе потребовало использования поликлональных антител [23, 30].
ELISA анализ. Первые поликлональные антитела, успешно использованные в методе ELISA для определения микроцистина и нодуларина, были разработаны F.S. Chu [24, 25]. Они имеют хорошую кросс-реактивность с различными, но не всеми микроцистинами и нодуларинами. Этот метод успешно используется для определения концентраций токсинов в питьевой воде и тканях и выявления микроцистина и нодуларина в лабораторных культурах цианобактерий [23]. Тест ELISA основан на узнавании цианобактериальных циклических пептидов (микроцистина, нодуларина и их гомологов) специфическими антителами. Антитела в ELISA узнают аминокислоту Adda, которая является характерной структурной чертой 80 % микроцистинов, нодуларина и их гомологов. ELISA — недорогой, быстрый, простой и очень чувствительный (0.02-0.07 нг/мл) анализ, не требующий специальной подготовительной обработки анализируемого материала. О концентрации токсинов судят по интенсивности окрашивания титровой пластинки (30).
Ф. Ху и Х. Хуангом (25) так же были разработаны поликлональные антитела для неосакситоксина. С их использованием метод ELISA может быть очень эффективным в контроле данного PSP-токсина. Но для анализа нейротоксинов в целом требуются антитела с более широкой кросс-реактивностью [23].
Хроматографические методы
Хроматография и капиллярный электрофорез являются единственными аналитическими методами, позволяющими разделять и идентифицировать токсины [46]. Хроматография также применяется для выявления, выделения (очистки) и количественного учета цианобактериальных токсических веществ и особенно незаменима в тех случаях, когда вещество невозможно выявить в ходе биологических анализов, в силу его низкой концентрации или слабой токсичности. В ходе хроматографического анализа вещества разделяются на капиллярной колонке и на выходе из нее регистрируются датчиками. В жидкостной хроматографии традиционно используются электрохимический, флуоресцентный, фотодиодный ультрафиолетовый детекторы и масс -спектрометр. Они регистрируют время удержания веществ на колонке, силу сигнала и определяют природу химических соединений по специфическим параметрам. Для ультрафиолетового детектора таким специфическим параметром является спектр адсорбции, а масс-спектрометрометр позволяет выявлять масс-заряд (m/z) веществ [17]. Сравнивая полученные данные со стандартами, можно идентифицировать соединения. Аминокислоты, входящие в состав токсинов, выявляются с использованием метода ядерно-магнитного резонанса и газовой хроматографии с масс-спектрометрическим анализом, и их последовательность в белке определяется обработкой токсина О3, NaBH4, HCl [18]. Для количественных оценок вещества площадь хроматографического пика соответствующего соединения соотносится с площадью пика внутреннего стандарта.
Для выявления токсических соединений также используются методы противофазной и анионо-обменной жидкостной хроматографии. Наряду с ними применяется тонкослойная хроматография. В ряде случаев токсины подвергаются специфическому мечению и анализируются флуорометрическими и хемилюменисцентными методами [23, 46].
Молекулярно-биологические методы
В настоящее время для изучения биоразнообразия и особенностей функционирования сообществ разработан новый перспективный подход — метагеномный анализ на основании данных пиросеквенирования. Во многих странах мира активно проводятся широкомасштабные метагеномные исследования микроорганизмов различных биотопов [58], в России это направление только начинает развиваться. Известно, что микроцистины синтезируются микроцистин-синтетазой, которая кодируется кластером генов (mcyA-ген). На основе последовательностей mcy-генов были разработаны праймеры для поиска токсичных представителей. Так, выявление генотипов токсичных цианобактерий в водоемах Байкальского региона проводились с помощью набора праймеров, специфичных AMT -домену mcyE-гена [10, 16]. В суммарной ДНК пико- и фитопланктонной фракций Усть-Илимского водохранилища при помощи молекулярно-биологических методов ген синтеза микроцистина mcyE был обнаружен у вида Microcystis aeruginosa. Поскольку численность цианобактерий высока в течение большей части года, исследования цианобактерий на содержание гена токсичности весьма важны как с научной точки зрения, так и для оценки качества воды.
Материал и методы исследований
Характеристика Красного оз. Красное оз. — один из уникальных объектов многолетних наблюдений на Северо -Западе России. Озеро расположено в центральной части Карельского перешейка (70 км от г. Санкт-Петербурга) и относится к бассейну р. Вуоксы. В озеро впадает 24 постоянных и временных притока, из которых основным является р.
Странница (Рис. 1). Сток из озера осуществляется по реке Красной, которая затем впадает в озеро Правдинское. Водная масса озера обменивается в среднем за 1.2 г. (Табл. 1). Около 80% водосборного бассейна Красного озера в 1975 г. было покрыто лесом; пашни составляли 15% площади и располагались в западной части бассейна. На территории водосбора расположены четыре поселка, птицефабрика, два животноводческих комплекса, горнолыжный курорт на юго-восточном берегу. По данным за 1984 г. антропогенное воздействие на озеро за 10 лет существенно возросло. Площадь лесов сократилась до 63%, а площадь окультуренных земель увеличилась до 34%, т.е. в 1.5 раза. Население поселков выросло в 1.5-2 раза, увеличилось число индивидуальных отдыхающих. Внесение азотных удобрений возросло в 4 раза, фосфорных — в 2 раза. Реальная фосфорная нагрузка на озеро составляла 0.35 г м-2 и превосходила критическую почти в два раза. По содержанию общего фосфора и уровню первичной продукции озеро находилось в этот период на стадии перехода от мезотрофного к эвтрофному состоянию [14].
В 90-е гг. антропогенное воздействие на озеро, в связи с резким спадом сельского хозяйства, снизилось. Новое усиление антропогенного влияния на озеро началось с конца 90 -х гг. и связано с массовой индивидуальной застройкой его берегов, что сказывается на состоянии экосистемы озера и, прежде всего, планктонных сообществ. В 2005 г. в пробах воды были зафиксированы значения Р общ. — 0.036 мг л-1, N общ. — 540 мкг л-1, соотношение N : Р =15.
Рис. 1. А — карта Ленинградской обл. ;Б — схема водосборного бассейна Красного оз: 1 — лес, 2 — сельскохозяйственные угодья.
Лимнологическая характеристика Красного озера
Площадь зеркала, км2 9.13
Объем водной массы, млн. м3 60.5
Время полного водообмена, г 1.2
Г лубина, м — средняя 6.6
— максимальная 14.6
Площадь водосбора, км2 168
Прозрачность, м 0.9
рн 6.9-8.2
Р общ., мкг л- 50-67
N общ., мкг л-1 700-800
Урбанизированная территория, % 34
Уровень трофности мезотрофный
Отбор проб. Сбор материала в Красном оз. проводился планктонной сеткой (газ №78) в июле августе 2004-2005 гг. во время «цветения». Для сбора биомассы профильтровывался слой воды с глубины 1 м до поверхности. Концентрированную биомассу лиофильно высушивали при -70°С.
Экстракция токсинов. Лиофилизированная биомасса цветений экстрагировалась 70% водным раствором метанола (6 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Экстракт центрифугировали при 4000 g в течение 1 мин и затем использовали для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и тестирования биологической активности ферментов.
Оценка цитотоксической активности. Цитотоксичность in vitro (МТТ-тест) является эффективным методом для тестирования жизнеспособности клеток (47). Цитотоксическая активность биомассы цветений проверялась на культивируемой клеточной линии SP2 лимфобластомы мышей в иммунологической камере. Этот колориметрический метод основан на вычислении дегидрогеназной активности (желтая тетразолиевая соль окисляется до синего формазана). Лунки без экстракта использовали в качестве контроля. Материал инкубировался в термостате при 37°С в течение 1 ч. Затем исследуемый экстракт биомассы (10 мкл) помещали в лунки иммунологической камеры (3х3 мкл). Суспензии клеток мышей (200 мкл) добавляли в лунки с экстрактом или без него, и иммунологическую камеру помещали в термостат на 5 ч. Оценка цитотоксического эффекта (% живых и мертвых клеток) проводилась путем определения оптической плотности в спектрофотометре Sunrise-Tecan при 590-640 нм или по числу погибших клеток (%), определенному с помощью цитофлуориметра. Количество мертвых клеток <20 % условно принимали за отсутствие цитотоксического эффекта; 20-50 % за слабый эффект; 50-80 % за средний эффект; >80 % за высокий эффект.
Ферментативный анализ. Активность холинэстеразы оценивали колометрическим методом [28, 45]. Этот метод был оптимизирован применительно к использованию иммунологических камер и спектрофотометра Sunrise-Tecan. Для каждого теста 125 мкл фосфатного буфера (рН 8.0), 50 ед. мл1 раствора холинэстеразы, 25 мкл 7,6 hM 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислоты и 20 мкл экстракта вносились в лунку иммунологической камеры. Реакция инициировалась добавлением 30 мкл 6,2 мМ ацетилхолин -йодида (ATCI) и завершалась образованием желтой 5 -тио-2-нитробензойной кислоты (TNB). Экстинкцию определяли спектрофотометрически при 412 нм последовательно 10 раз с интервалом 12 с при 30°С. Для каждого экстракта определение проводили в трех повторностях. Ингибирование фермента рассчитывали на графике экстинкция/время в линейной области по отношению к контролю (100% активность, отсутствие ингибирования). Концентрацию ингибитора, снижающую активность фермента на 50%, определяли путем интерполяции.
Высокоэффективная жидкостная хроматография. HPLC-анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1100 Mass Spectrometer MSD SL-Ion Trap [46] (Рис. 2-3). Циклические пептиды разделяли на аналитической колонке Zorbax XDBC8 (4,6150 мм). Мобильную фазу составляли метанол -вода (линейный градиент от 30% до 100%-ного метанола в течение 30 мин) со скоростью протока 0,6 мл мин-1 при 30°С. Объем анализируемого экстракта составлял 20 мкл. Пики на выходе из колонки регистрировали с помощью двух датчиков: масс-спектрометра типа «ion-trap» и
ультрафиолетового полихроматического детектора (PDA). Циклические пептиды выявляли на хроматографе при 230 нм (время удержания 10-25 мин). В ходе тандемной масс-спектрометрии определялись масс-заряды (m/z) ионизированных молекул (MSI). Идентификацию токсинов осуществляли путем сравнения молекулярных масс (масс -зарядов) пиков соединений, по времени соответствующих циклическим пептидам, используя литературные данные. Кроме того, при идентификации циклического пептида учитывалась возможность принадлежности масс-заряда не самой ионизированной молекуле, а ее аддукту
— протонированной молекуле [М + Н]+, молекулярному иону, связанному с металлами [М +
Na] или [М + К] , или иону с утерянными фрагментами [М + Н НгО]
Рис.2. Высокоэффективный жидкостный хроматограф.
Рис. 3. Схема работы высокоэффективного жидкостного хроматографа.
Результаты и обсуждение
Озеро, помимо антропогенного воздействия, испытывает влияние на биоценозы годовых колебаний водности бассейна. В многоводные годы, в условиях повышенной проточности и мутности преобладают диатомовые водоросли. В маловодные годы отмечен рост биомассы фитопланктона, что связано с усилением эвтрофирования озера и снижением скорости водообмена в условиях маловодной фазы. Ведущую роль при этом играют цианобактерии. В конце 90 -х гг. отмечено значительное увеличение численности цианобактерий и прежде всего видов рода Anabaena и Aphanizomenon [2]. Основными структурообразующими видами цианобактерий в Красном оз. являются: Aphanizomenon flos-aquae, Anabaena lemmermannii, A. spiroides, Microcystis aeruginosa, M. wesenbergii, Gomphospheria lacustris, Woronichinia naegeliana и Gloeotrichia echinulata. Все эти виды токсигенны (Табл. 2). В настоящее время известно, что около 50 видов цианобактерий способны синтезировать токсины (54). Однако, токсигенность является свойством отдельных штаммов, а не вида в целом (50). Полевые и лабораторные исследования культур показали, что отдельные виды цианобактерий могут включать как токсигенные штаммы, так и штаммы, не синтезирующие токсины (5, 54, 34, 35).
Табл. 2.
Состав цианобактерий, доминирующих в Красном оз.
Цианобактерии Сведения
о токсигенности
Anabaena. lemmermanii P. Richter 31
A. spiroides Kleb. 19
Aphanizomenon flos-aquae (L.) Ralfs 41
<eotrichia echinulata (J.E. Smith) P. Richter 40
Gomphosphaeria lacustris Chod. 33
Microcystis aeruginosa Kutz. 39
M. wesenbergii Komarek 33
Woronichinia naegeliana (Ung.) Elenk. 20
Исследования цитотоксичности цианобактерий in vitro c использованием клеточной линии лимфобластомы мышей SP2 выявили слабую 20%-ную ингибиторную активность экстрактов проб планктона (Табл. 2). Скрининг ингибиторов холинэстеразы в биомассе цианобактерий [45] позволил выявить 24%-ную ингибиторную активность, что указывает на возможное присутствие нейротоксичного алкалоида анатоксинам^). Анатоксин-а(с) — сильный органофосфатный ингибитор ацетилхолинэстеразы, синтезируемый штаммами Anabaena flos-aque и A. Lemmermannii [22, 23]. Нейротоксины нарушают функцию нервной системы и вызывают смерть подопытных животных в течение нескольких минут из -за паралича дыхательных мышц. Упомянутый структурный вариант анатоксина вызывает избыточное слюноотделение и кровавое слезотечение у позвоночных, ЛД50 = 20 мкг-кг-1 [23].
Для идентификации пептидов наиболее часто используется аналитический метод HPLC. HPLC экстрактов лиофилизированной биомассы планктонных проб выявил (Табл. 3). В составе микроцистинов идентифицированы Microcystin-dMeLW, Microcystin-LA (LD50 =50 мкг кг-1) и 3 варианта Microcystin LR: [d-Asp3,ADMAdda5] mcyst-LR (LD50 =160 мкг кг-1), [DMAAdda5]mcyst-LR (LD50 =90-100 мкг кг-1) и Microcystin-LR (LD50 >1200 мкг кг-1. Микроцистины разрушают клетки печени и в тяжелых случаях приводят к раку печени [23]. Особенно токсичным считается микроцистин LR. Микроцистины синтезируются рядом цианобактерий, из которых в Красном оз. в состав доминирующих входят виды Microcystis и Anabaena. Из цитотоксинов в экстракте биомассы цветений озера зафиксированы: ингибитор эластазы — Scyptolin A; ингибитор химотрипсина — Micropeptin Т-20 и ингибитор неустановленных ферментов — Microginin FR1. Кроме того, обнаружен Calothrixin A обладающий антиканцерогенным эффектом.
Состав токсинов в цветениях этого озера в разные годы имел отличия. Если в 2004 г. были выявлены 4 варианта микроцистинов, то в 2005 г. только 1 вариант. Состав цитотоксинов в эти годы также различался (Табл. З). Судя по величине пика на хроматограмме, в цветениях 2004 г. преобладали микроцистины, а в 2005 г. доминировал неидентифицированый токсин (m/z 846), близкий по молекулярной массе анабенопептинам (Рис. 4). Динамика токсинов в цветениях озера, возможно, связана с изменением экологических условий и сменой доминирующих видов (штаммов), производителей токсинов.
Рис. 4. ИРЬС-хроматограммы экстрактов лиофилизированной биомассы из цветения воды в Красном оз. в 2004 г. (А) и в 2005 г. (Б). Цифрами отмечены молекулярные массы токсинов (т^): Н — неидентифицированный токсин, 909 — МюгосубИп-ЬА, 980 — 8сур1оИп А, 981 — Microcystin-dMeLR, 1007 — |^-Asp3ADMAdda51mcyst-LR, 1011 — Micropeptin Т-20., 314 — Са1оШпхш А, 714 — Microgmin FR1, 969 — Microcystiп-dMeLW.
Цианобактериальные токсины принадлежат к числу самых опасных природных токсинов. Длительное употребление воды с микроцистинами способствует бесконтрольному росту клеток печени, приводящему к первичному раку. Даже купание в водоеме и случайное заглатывание воды в таких водоемах может вызвать гастроэнтерит, раздражение кожи и глаз. В водоемах Северо-запада России наиболее часто встречается Microcystiп-LR и МсгосуБЙп-ЯЛ. Цветение эвтрофированных водоемов происходит и в южных областях стран Балтийского моря: Финляндии, Швеции и Норвегии [53, 57, 62]. Более 50% отмеченных случаев цветений в этих странах — токсичные. В этих странах давно ведется мониторинг токсинов, и в первую очередь биотоксинов-микроцистинов. В меньшей степени там изучен состав цитотоксинов, хотя они тоже вызывают воспалительные явления. В тоже время, цитотоксины могут быть источником ценных лекарственных средств, в том числе и против рака [23]. Для того, чтобы минимизировать последствия цветения воды необходим эффективный экологический мониторинг водоемов региона, в том числе контроль факторов среды, вызывающих эвтрофикацию.
1. Андреюк Е.И., Коптева Ж.П., Занина В.В. Цианобактерии. К.: Наук. Думка, 1990. — 200 с.
2. Белякова Р.Н., Волошко Л.Н., Гаврилова О.В., Гогорев Р.М., Макарова И.В., Околодков Ю.Б., Рундина Л.А. Водоросли, вызывающие «цветение» водоемов Северо-Запада России / Под ред. К.Л. Виноградовой — М.: ТНИ КМК, 2006. — 367 с.
3. Волошко Л.Н. Токсины и другие биологически активные вещества цианобактерий / Экологическая
школа в г. Петергофе-Наукограде Российской Федерации: Проблемы национального сектора Балтийского
региона и пути их решения // Матер. регион. молод. научн. конф. СПб, Старый Петергоф, СпбГУ: Золотое сечение. 2007. — С. 19-30.
4. Волошко Л.Н., Драбкова В.Г., Гришкун О.М. Токсические цветения воды в Ладожском озере и сопредельных водоемах // Тез. докл. восьмой ежег. научн. конф. XXI век: молодежь, экология, ноосфера и устойчивое развитие. СПб.: СпбГУ, 2000. — С. 12-13.
5. Волошко Л.Н., Титова Н.Н., Гаврилова О.В., Бедягина О.М., Громов Б.В. Исследование Oscillatoria agardhii Gom. (Cyanophyta) в культуре // Альгология. — 2002. — Т. 12, №1. С. 24-33.
6. Волошко Л.Н., Копецкий И., Титова Н.Н., Плющ А.В., Драбкова В.Г., Капустина Л.Л.,. Пиневич А.В. Разнообразие токсинов, синтезируемых цианобактериями Ладожского озера // Автотрофные организмы. Матер. III Межд. конф. М.: МГУ, 2005. — С. 23.
7. Волошко Л.Н., Морозова А.А., Сафронова Т.В., Дзись-Войнаровская А.А.. Разнообразие токсинов,
синтезируемых цианобактериями (синезелеными водорослями) в водоемах Ленинградской области // Всерос. научно-практ. конф. "Альгологические исследования: современное состояние и перспективы на будущее". УФА: БГУ. (16-18 ноября 2006 г.), 2006. — С. 24-26.
8. Волошко Л.Н., Плющ А.В.,. Титова Н.Н Токсины цианобактерий (Cyanophyta, Cyanobacteria) // Альгология. — 2008. — Т. 18, № 1. С. 3-20.
9. Волошко Л.Н., Пиневич А.В., Копецкий И., Титова Н.Н., Хроузек П., Зелик П. Продуцируемые
цианобактериями токсины в период «цветения» воды в Нижнем Суздальском озере (Санкт-Петербург, Россия) // Альгология. — 2010. — Т. 20, №2. — С. 210-233.
10. Гладких А.С. Сообщества цианобактерий в биопленках и планктоне литоральной зоны озера Байкал / Автореф. дисс. канд. биол. наук. Иркутск: Иркутск. Гос. Университет. — 2012. — 20 с.
11. Громов Б.В., Мамкаева К.А., Волошко Л.Н. К изучению токсичных «цветений» в озерах Северо-запада России / Эколого-физиологические исследования водорослей и их значение для оценки состояния природных вод. Ярославль: ИБВВ АН СССР, 1996. — С. 22.
12. Кириенко Ю.А., Кириенко Н.И. Биологическая активность альшотоксина сине-зеленных водорослей - возбудителей «цветения» воды // Гидробиол. ж. — 1980. — Т. 16, 6. — С. 53.
13. Лесников Л.А. Разработка нормативов допустимого содержания вредных веществ в воде рыбохозяйственных водоемов // Вопросы методик в водной токсикологии. Л.: ГосНИОРХ, 1979.— Вып. 144. —
С. 3-42.
14. Методические аспекты лимнологического мониторинга / Под ред. И.С. Трифоновой. Л.: Наука, 1988. — 178 с.
15. Методическое руководство по биотестированию воды / Под ред. Крайнюковой А.Н. М.: Гос. Комитет по охране природы. РД 118-02-90, 1991. — С. 50-63.
16. Тихонова И.В. Морфологические и генетические особенности пикопланктонных цианобактерий озера Байкал. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Иркутск. Иркутск. Гос. Университет. — 2006. — 20 с.
17. Agilent technologies. Manual for equipment. USA: HPST, 2001. — 34 p.
18. Bateman K.P., Thibault P., Douglas D.J., White R.L. Mass spectral analyses of microcystins from toxic cyanobacteria using on-line chromatographic and electrophoretic separations // J. of Chromatography —. 1995. — V. 712. — P. 253-268.
19. Beasley V.R., Coppock R.W., Simon J., Buck W.B., Ely R., Corley R.A., Carlson D.M., Gorham P.R. Apparent blue-green algae poisoning in swine subsequent to ingestion of a bloom dominated by Anabaena spiroides // J. Am Vet. Med. Assoc. — V. 182. — P. 413.
20. Berg K., Skulberg O.M., Skulberg R., Underdal B., Willen T. Observation of toxic blue-green algae (Cyanobacteria) in some Scandinavian lakes // Acta. Vet. Scand. — 1986.— V. 27. — P. 440-452.
21. Blaha L., Marsalek B. Microcystin production and toxicity of picocyanobacteria as a risk factor for drinking water treatment plants // Algol. Stud. — 1999. — V. 92. — P. 95—108.
22. Carmichael W.W. The toxins of cyanobacteria // Sci. Amer. — 1994. — 270, No 1. — P. 78-86.
23. Carmichael W.W. The Cyanotoxins // Advan. Bot. Res. — 1997. — V. 27. — P. 211-256.
24. Chu F.S., Huang X., Wei R.D. Enzyme-linked immunosorbent assay for microcystins in blue-green algal blooms // J. Ass. off. Analyt. Chem Int. 1990. — V. 73. — P. 451-456.
25. Chu F.S., Huang X. Production and characterization of antibodies against neosaxitoxins // J. Ass. off. Analyt.. Chem. — 1995. — V. 75. — P. 341-345.
26. Devic E., Li D., Dauta A.E., Henriksen P., Codd G.A., Marty J., Fournier D. Detection of anatoxin-a(s) in environmental samples of cyanobacteria by using a biosensor with engineered acetylcholinesterases // Appl. Environ Microbiol. — 2002. — V. 68. — P. 4102-4106.
27. Drabkova V., Rumyantsev V., Sergeeva L.V., Slepukhina T.D. Ecological problems of Lake Ladoga, causes and solutions // Hydrobiologia. 1996. V. 322. P. 17.
28. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V. Featherstone: A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharm. — 1961. — V. 7. — P. 88-95.
29. Fastner J., Erhard M., von Dohren H. Determination of oligopeptide diversity within a natural population of Microcystis sp. (Cyanobacteria) by typing single colonies by matrix — assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry // Appl. And Environ. Microbiol. — 2001. — V. 67, No 11. — P. 5069-5076.
30. Fischer W.J., Garthwaite I., Miles C.O., Ross K.M., Aggen J.B., Chamberlin A.R., Tower N.R., Dietrich D.R. Congener-independent imunoassay for microcystins and nodularins // Environ. Sci. Technol. — 2001. — V. 35.
— P. 4849-4856.
31. Fitch C.P., Bishop L.M., Boyd W.L. Waterblooms as a cause of poisoning in domestic animals // Cornell Vet. — 1934. — V. 24, No 1. — P. 30-39.
32. Flore E., Wolk C.P. Production by filamentous, nitrogen-fixin cyanobacteria, of a bacteriocin and of other antibiotics that kill related strains // Arch. Microbiol. — 1986. — V. 145. — P. 215-219.
33. Gorham P.R., Carmichael W.W. Hazards of freshwater blue-green algae (cyanobacteria). Cambridge
University Press, 1988. — P. 403-431.
34. Gromov B.V., Vepritskij A.A., Titova N.N., Mamkaeva K.A., Voloshko L.N. A survey of toxicity of
cyanobacterial blooms in Lake Ladoga and adjacent water bodies // Hydrobiologia. — 1996. —V. 322.— P. 129-136.
35. Gromov B.V., Voloshko L.N., Mamkaeva K.A. Several cyanobacterial blooms in Lake Ladoga and
adjacent water bodies // Abstr. of the Second Intern.l Lake Ladoga Symp. Finland: Joensuu, 1997. — P. 120-122.
36. Haugen J.E., Skulberg O.M., Andersen R.A., Alexander J., Lilleheil G., Gallacher T., Brough P.A. Rapid analysis of cyanophyte neurotoxins: an improved method for quantitative analysis of anatoxin-a and homoanatoxin-a in the sub-ppb to ppb range // Algol. Studies. — 1994. — V.75. — P. 111-121.
37. Henriksen P., Carmichael W.W., An J., Moestrup O. Detection of anatoxin(s)-like anticholinesterase an natural blooms and cultures of cyanobacteria / blue-green algae from Danish lakes and in stomach contents of poisoned birds // Toxicon. — 1997. — V. 35. — P. 901-903.
38. Hrouzek P., Tomek P., Lukesova A., Urban J., Voloshko L., Pushparaj. B., Stefano V., Lukavsky J., Stys
D., Kopecky J. Cytotoxicity and secondary metabolites production in terrestrial Nostoc strains, originating from different climatic/geographic regions and habitats: Is their cytotoxicity environmentally dependent? // Environmental Toxicology. — 2011. — P. 345-358.
39. Hughes E.O., Gorham P.R., Zehnder A. Toxicity of unialgal culture of Microcystis aeruginosa // Can. J. Microbiol. — 1958. — V. 4. — P. 225-236.
40. Ingram W., Prescott E. Toxin freshwater algae // Am Mid. Nat. — 1954. — V. 52. — P. 75-87.
41. Jackim E., Gentile J. Toxins of a blue-green algae: similarity to saxitoxin // Science. — 1968. — V. 162.
— P. 915-916.
42. Kearns K.D., Hunter M.D. Green algal extracellular products regulate antialgal toxin production in a cyanobacterium // Environ. Microbiol. — 2000. — V. 2, No 3. — P. 291-297.
43. Klochenko P.D., Elanskaya I.A., Snevchenko T.F., Sokolova E.V. Antifungal activity of freshwater cyanobacteria // Algol. Studies. — 2001. — V. 103. — P. 143-149.
44. Luukkainen R., Sivonen K., Namikoshi M., Fardig M., Rinehart K.L., Niemela S.I., Isolation and identification of eight microcystins from thirteen Oscillatoria agardhii strains and structure of a new microcystin // Appl. Environ. Microbiol. — 1993. — V. 59. — P. 2204-2209.
45. Mahmood N.A., Carmichael W.W., Paralytic shellfish poison produced by the freshwater cyanobacterium Aphanizomenon_ flos-aquae NH-5 // Toxicon. — 1987. V. 24. — P. 175-186.
46. Meriluoto J.A.O., Eriksson J.E. Rapid analysis of peptide toxins in cyanobacteria // J. Chromatogr. — 1988. — P. 226-230.
47. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. — 1983. — 65 — P. 55-63.
48. Reinikainen M., Wall M., Ketola M. Acute toxiticy of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa ^strain PCC 7820) to Daphnia pulex (Cladocera) // Algol. Studies. — 1994. — V. 75. — P. 229-237.
49. Shirai M.A., Ohtake T., Sano T., Matsumoto S., Sakamoto T., Sato A., Aida T., Harada K., Shimada T., Suzuki M., Nakano M. Toxicity and toxins of natural blooms and isolated strains of Microcystis spp. (Cyanobacteria) // Appl. Environ. Microbiol. — 1991. — V. 57. — P. 1241-1245.
50. Sivonen K. Cyanobacterial toxins and toxin production // Phycologia. — 1996. — 35. — P. 12-24.
51. Sivonen K., Niemala S.I., Niemi R.M., Lepisto L., Luoma T.H., Rasanen L.A., Toxic cyanobacteria (blue-green algae) in Finnish fresh and coastal waters // Hydrobiologia. — 1990. — V. 190. —P. 267-275.
52. Sivonen K., Namikoshi M., Evans W.R., Gromov B.V., Carmichael W.W., Rinehart K.L., Isolation and structure of five microcystins from a Russian Microcystis aeruginosa strain CALU 972 // Toxicon. — 1992. — V. 30, No 11. — P. 1481-1485.
53. Sivonen, K., Namikoshi, M., Luukkainen, R., Fardig, M., Rouhiainen, L., Evans, W.R., Carmichael, W.W., Rinehart, K.L. and Niemela, S.I. Variation of cyanobacterial hepatotoxins in Finland / In: M. Munawar and M. Luotola [Eds]. The Contaminants in the Nordic Ecosystem, Dynamics, Processes and Fate. Ecovision World Monograph Series, SPB Academic Publishing, Amsterdam, 1995. — P. 163-169.
54. Skulberg O.M. Taxonomy of toxic Cyanophyceae (Cyanobacteria) // Algal toxins in seafood and drinking water. — London: Acad. Press, 1993. — P. 145-164.
55. Skulberg O.M., Codd G.A., Carmichael W.W. Toxic blue-green algal bloom in Europe: a growing problem // Ambio. — 1984. — V. 13. P. 224-247.
56. Skulberg O.M., Carmichael W.W., Codd G.A., Skulberg R. Taxonomy of toxic cyanophyceae (Cyanobacteria) / Algal toxins in Seafood and Drinking water. Cambridge: Acad. Press, 1994. — P. 177-187.
57. Skulberg O.M. Toxins produced by cyanophytes in Norwegian inland waters - health and environment // Chemical data as a basis of geomedical investigations. - Oslo: Norw. Inst. Water Res., 1996. - P. 179-216.
58. Venter C.J., Remington K1, John F. Heidelberg A.L. et al. Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea // Science 2. — 2004. — Vol. 304, No. 5667 — P. 66-74.
59. Voloshko L.N., Pljusch A.V., Safronova T.V., Titova N.N., Hrouzek P., Drabkova V.G. Toxins and other bioactive compounds produced by Cyanobacteria in Lake Ladoga // Estonian J. Ecology. - 2008a. - 57, No 2. - P. 100-110.
60. Voloshko L.N., Plushch A.A., Titova N.N. Toxins of cyanobacteria (Cyanophyta,) // Intern. J. on Algae.
— 2008b. — V. 10, No 1. — P. 14-33.
61. Voloshko L.N., Pinevich A.V., Kopecky J., Titova., N.N., Hrouzek P., Zelik P. Water blooms and toxins produced by Cyanobacteria in the Lower Suzdalskoeskoe Lake (Saint-Petersburg, Russia) // Intern. J. on Algae. — 2010. — V. 12, No 2. — P. 129-141.
62. Willen N., Mattsson R. Water-blooming and toxin-producing cyanobacteria in Swedish fresh and brakish waters, 1981-1995 // Hydrobiologia. — 1997. — V. 353. — P. 181-192.
63. Zelik P., Lukesova A., Voloshko L.N., Stys D., Kopecky J. Screening for acetylcholinesterase inhibitory activity in cyanobacteria of the genus Nostoc // J. of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. — 2009. — Issue 2.
— P. 531-536.
