CC BY
167
Тканевая инженерия в экспериментальной сердечно-сосудистой хирургии: технология получения бесклеточных коллагеновых матриксов сосудов животных и человека
Ш.Д. Ахмедов 1, С.А. Афанасьев 1, М.В. Егорова 1, СЛ. Андреев 1, А.В. Иванов 1,
Ю.В. Роговская1, ВЮ. Усов 1, А.Н. Шведов 2, Г. Стейнхофф 3
1 НИИ кардиологии СО РАМН, Новосибирск
2 Сибирский Государственный медицинский университет Росздрава, Новосибирск
3 Университет Ростока, Росток, Германия
Tissue Engineering in Experimental Cardio-Vascular Surgery: Technology of Preparation of Acellular Collagen Matrix of Animal and Human Vessels
Sh.D. Akhmedov1, S.A. Afanasyev1, M.V. Egorova 1, S.L. Andreev1, A.V. Ivanov1, Yu.V. Rogovskaya 1,
V.Yu. Usov1, А.N.Shvedov2, G. Steinhoff 3
1 Scientific-Research Institute of Cardiology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Novosibirsk
2 Siberian State Medical University of the Ministry of Public Health, Novosibirsk
3 Rostock University, Rostock, Germany
В данной работе показана технология получения децел-люлированных коллагеновых матриксов из артериальных сосудов и хирургическая оценка возможности их имплантации в кровеносное русло экспериментальных животных.
Исследование выполнено на артериальных сосудах (n = 60), в качестве которых использовали грудной и брюшной отделы аорты крыс (n = 40) и фрагменты внутренней грудной артерии человека (n = 20). Представлен способ получения соединительнотканного каркаса кровеносного сосуда путем перфузии сосуда в течение 2—3 ч растворами детергентов. Имплантация бесклеточного коллагенового кондуита выполнена на 5 собаках. После операции кровоток был функционален. Отмечалась герметичность анастомозов, децеллюрезированный сосуд выдерживал гемодинамиче-скую нагрузку артериального кровотока.
Ключевые слова: бесклеточный матрикс, децеллюля-ризация сосуда, тканевая инженерия, сердечно-сосудистая хирургия.
The aim of present work was to develop a technology for deriving decellularized collagenous matricies out of arterial vessels and surgical evaluation of their heterogeneous implantation into blood system of experimental animals. The experiments were carried out on arterial vessels (n=60). Mostly of them were thoracic and abdominal aortas of rats (n = 40) and fragments of internal thoracic artery of human (n = 20). A method for obtaining connective tissue frame of the vessel by perfusion of the vessel for 2—3 hours with solutions of detergents. The surgical implantation of cell-free collagen conduit was carried out on 5 dogs. After operation the blood flow was functional. The anastomoses were hermetic, the vessel could stand the hemodynamic pressure of blood flow.
Key words: acellular matrix, vessel decellularisation, tissue engineering, cardio-vascular surgery.
В настоящее время в России ежегодно выполняется более 15 тыс. операций аортокоронарного шунтирования (АКШ) [1]. При выполнении классической операции АКШ в качестве трансплантата используют аутологичные артерии, а также фрагменты аутологичной подкожной вены. Доказанным фактом является то, что артериальные шунты, в отличие от венозных у больных после операции АКШ функционируют намного дольше [2]. Использование же вен является вынужденной мерой, так как при многососудистом коронарном атеросклерозе количество используемых для этих целей аутоартерий бывает недостаточным. В стенках же венозных кондуитов очень часто возникают дегенеративные изменения, которые в итоге могут привести к окклюзии шунтов в течение ближайших 5—7 лет [3], что может привести к увеличению риска повторных инфарктов миокарда. В связи с этим особо актуальным является вопрос поиска нового альтернативного сосудистого кондуита, который бы позволил избежать недостатков имеющихся на сегодняшний день венозных шунтов.
e-mail: anselen@rambler.ru
В последнее время в медицине стало активно развиваться новое направление — тканевая инженерия, основанная на восстановлении тканей и органов за счет использовании стволовых клеток (СК) [4, 5]. Методом выбора служит специальный коллагеновый матрикс, повторяющий форму восстанавливаемой ткани, в который трансплантируются аутологичные СК. Учитывая, что на сегодняшний день создать искусственную объемную конструкцию из коллагена пока технически сложно, некоторые исследователи пошли по пути децеллюляризации готовых органов и тканей [6—8]. Были предложены и методики децеллюлирования с использованием сложных растворов, включающих протеолитические ферменты и биологически активные соединения [9, 10]. Однако на практике их применить оказалось непросто из-за риска повреждения самого матрикса, что делает невозможным его использование под конкретные цели и задачи.
Целью нашей работы являлась разработка технологии получения децеллюлированных коллагеновых
матриксов из артериальных сосудов и хирургическая оценка возможности их имплантации в эксперименте.
Материал и методы
Исследование выполнено на артериальных сосудах (п = 60), в качестве которых использовали грудной и брюшной отделы аорты крыс (п = 40) и фрагменты внутренней грудной артерии человека (п = 20). Для получения препарата грудной и брюшной аорты использовали крыс линии Вистар весом 350—400 г, которым под рауш-наркозом вскрывали грудную клетку и выделяли единым анатомическим блоком сердце с аортой, которые помещали в дистиллированную воду, препарировали и отсекали аорту диной до 5—6 см. Очищенную от окружающих тканей аорту помещали в перфузионную камеру и фиксировали на канюле.
Для получения образцов внутренней грудной артерии человека использовали дистальные ее фрагменты длиной до 2—3 см, остающиеся после выполнения стандартной плановой операции АКШ.
Метод на способ получения соединительнотканного каркаса магистрального сосуда млекопитающих животных и человека получил положительное решение на выдачу патента в организации «Роспатент» за № 2009128865/14(040138) от 27.07.2009 г.
Операционный материал с момента получения и до обработки (в течение 2—12 ч) хранили в растворе антибиотика при температуре +4-8°С. Подготовку сосуда и удаление окружающих тканей выполняли в емкости с дистиллированной водой при комнатной температуре, после чего сосуд переносили в перфу-зионную камеру и фиксировали на канюле.
Во всех случаях сосуды отмывали от крови, прокачивая через них перистальтическим насосом дистиллированную воду в течение 10—15 мин со скоростью 20 мл/мин.
Децеллюляризацию кровеносных сосудов с целью получения коллагенового матрикса осуществляли с помощью растворов детергентов. Качество проводимой процедуры оценивали с помощью постоянного морфологического контроля. Для этой цели с кровеносного сосуда после каждого часа обработки отрезали по сегменту, которые фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. В дальнейшем выпол-
няли стандартную проводку в спиртах и ксилолах, заливку в парафиновые блоки. Для гистологического исследования готовили серийные парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином, орсеиномпо Масону, толуидиновым синим, азаном по Гейденгайну. При составлении рабочих растворов мы руководствовались существующими прописями и использовали реагенты фирмы Sigma.
В эксперименте на 5 беспородных собаках отрабатывалась хирургическая техника по имплантации бесклеточного коллагенового кондуита, выполненного из внутренней грудной артерии человека, в поверхностную бедренную артерию животного. Операции производились путем протезирования иссеченного участка бедренной артерии и наложения дистального и проксимального анастомоза между кондуитом и артерией по типу «конец в конец» нитью «пролен-7/0» («Этикон»). Все экспериментальные исследования на лабораторных животных прошли согласование в этическом комитете НИИ кардиологии СО РАМН.
С целью контроля проходимости сосудистого кондуита в протезированной бедренной артерии собак выполняли компьютерное томографическое исследование с контрастированием артериального русла. Исследование проводилось на спиральном мультисрезо-вом компьютерном томографе SOMATOM Sensation 4 (SIEMENS AG, Германия). Использовался контраст 0мнипак-350 в объеме 40—50 мл, который вводился внутривенно со скоростью введения 4 мл в с. Начало сканирования — момент попадания контраста в брюшную аорту при проведении премониторинга. Сканирование спиральное по протоколу Abdomen angio. Толщина среза составляла 1 мм.
Результаты
В нашем исследовании использование уже известных по литературе схем (1 ч трипсин + ЭДТА и 1 ч SDS + трис в PBS) получения децеллюлированных матриксов биологических тканей с длительной (от 16 до 48 ч) их обработкой многокомпонентными растворами [11] дало негативный результат. А именно, при гистологическом контроле во всех случаях были выявлены различные повреждения стенки сосуда, наиболее типичные из них представлены на рис. 1—3.
Рис. 1. Стенка артериального сосуда. Децеллюризация по методу, взятому из литературных источников. Неравномерное разрыхление соединительнотканного каркаса и разрушение коллагеновых волокон (показано стрелкой): А - интактный сосуд; Б - сосуд после обработки. Окраска по Ван-Гизону
Рис. 3. Аорта крысы. Уменьшение количества и прерывистость эластических мембран стенки сосуда при использовании метода децеллюляризации, взятого из литературных источников:
А - интактный сосуд; Б - сосуда после обработки.
Окраска азаном по Гейденгайну
Анализ полученных результатов показал, что наиболее эффективным для удаления клеточных элементов и малотравматичным для структуры матрикса является использование растворов детергентов БйБ и тритона Х100. Дальнейшая наша работа была уже направлена на поиск наиболее удачного их сочетания, а также оптимального времени обработки сосуда.
Оптимальной оказалась следующая последовательность обработки сосуда. Сосуд, зафиксированный на канюле, 10—15 мин отмывали от крови дистиллированной водой. Затем в течение 1 ч сосуд обрабатывали 1% водным раствором ЭйБ, прокачивая раствор перистальтическим насосом со скоростью 20 мл/мин. Затем сосуд еще 1 ч перфу-зировали 1% водным раствором Тг^опХ100. Далее в течение 10—15 мин сосуд отмывали от детергентов дистиллированной водой, а затем еще 10—15 мин физиологическим раствором. Все описанные процедуры проводили при комнатной температуре.
В зависимости от поставленных задач, а именно возможности снижения реакции иммунологического отторжения после имплантации ксенотрансплантата в отдаленном послеоперационном периоде, получение бесклеточного матрикса можно дополнить обработкой сосуда физиологическим раствором (рН 7,4), содержащим по 20 мкг/мл ДНКазы и РНКазы. В нашем исследовании такую обработку проводили в течение 1 часа при температуре 37°С. Для остановки действия ферментов сосуд промывали в течение 10—15 мин охлажденным ( + 4—8°С) физиологическим раствором.
Такая технология децеллюляризации сосуда апробирована на 20 интраоперационных биоптатах сосудов человека и 40 лабораторных животных. Эффект данной процедуры децеллюляризации виден при сравнении гистологических препаратов одного и того же сосуда до и после обработки. На гистологических препаратах интактной внутренней грудной артерии (рис. 4А) видно, что ее стенка состоит из соединительнотканного каркаса и клеточных элементов, формирующих три основных слоя: эндотелий, медию и адвентицию. После полного цикла обработки сосуда (рис. 4Б) ни в эндотелиальном слое, ни в медии и адвентиции нет клеточных элементов, а соединительнотканный каркас имеет вид «сеточки». При этом толщина сосудистой стенки относительно равномерная. На отдельных препаратах можно видеть набухание соединительнотканных волокон медии.
На гистологических препаратах брюшной аорты крыс также видно, что ее стенка (рис. 5А) в исходном состоянии имеет характерное для артерий слоистое строение, включая клеточные элементы и соединительнотканные составляющие. После децеллюляризации (рис. 5Б) слоистая структура стенки сосуда сохранена, но при этом полностью отсутствуют клеточные элементы. Места, занимаемые раньше клеточными элементами, определяются в виде лакун. В ряде случаев, места разрушенных клеточных элементов отмечены глыбками хроматина. Элементы соединительнотканного каркаса хорошо сохранены и имеют рыхлую структуру. При просмотре серийных срезов можно найти единичные мелкие участки гомогенизации соединительнотканных волокон.
Рис. 4. Препарат сосуда человека до (А) и после (Б) обработки:
А - на гистологическом срезе сосуда определяются клетки эндотелия (1), внутренняя эластическая мембрана (2), гладкомышечные клетки и фибробласты в медии (3), клеточные элементы в адвентиции (4);
Б - «обнаженная» внутренняя эластическая мембрана (2), отсутствие клеток медии (3) и адвениции (4), набухание соединительнотканных волокон (5).
Окраска гематоксилином и эозином
Рис. 5. Препарат кровеносного сосуда крысы до (А) и после (Б) обработки: 1 - клеточные элементы; 2 - соединительная ткань;
3 - лакуны; 4 - участок гомогенизации соединительнотканных волокон;
5 - глыбки хроматина.
Окраска гематоксилином и эозином
Таким образом, мы можем предварительно говорить о технологии, позволяющей удалять клеточные составляющие из стенки любого артериального сосуда практически без повреждения его соединительнотканного каркаса. При этом, суммарное время обработки сосуда составляет не более 4ч, а разработанный протокол пригоден для обработки как сосудов животных, так и человека.
Следующим этапом работы служила оценка физических свойств сосудистых кондуитов во время имплантации децеллюляризированного сосудистого каркаса из внутригрудной артерии человека в артериальное русло соответствующего диаметра конечностей беспородных собак (п = 5) (рис. 6). Операция показала, что сама стенка кондуита позволяет без проблем накладывать сосудистый шов, используя шовную нить «Пролен» с толщиной 7/0 или 8/0. После снятия зажимов и восстановления кровотока
по бедренной артерии во всех случаях отмечалась герметичность анастомозов, а сам децеллюлярези-рованный сосуд был способен выдерживать гемо-динамическую нагрузку артериального кровотока. Послеоперационные раны заживали первичным натяжением, что свидетельствовало об отсутствии реакции острого отторжения в раннем послеоперационном периоде.
У всех экспериментальных животных в сроки 2, 3, 6 нед. после операции гетерологической трансплантации бесклеточного коллагенового сосудистого матрикса выполнялись томографические исследования артериальной системы кровоснабжения нижних конечностей с контрастированием. За весь период наблюдения иммунологические антидепрессанты не применялись. Отмечена полная проходимость сосуда в месте имплантации сосудистого кондуита (рис. 7).
Рис. 6. Вновь созданный сосудистый кондуит на основе бесклеточного коллагенового матрикса из артерии человека имплантирован в бедренную артерию экспериментального животного
Рис. 7. Имплантат. Реконструкция с помощью спиральной компьютерной томографии с контрастированием. Определяется удовлетворительный магистральный кровоток в сосудистом кондуите, изготовленном из внутренней грудной артерии человека и имплантированном в поверхностную бедренную артерию экспериментального животного спустя 6 нед. после операции
Выводы:
1) Отработанная перфузионная методика децел-люляризации позволяет достаточно эффективно получать коллагеновый матрикс цельного кровеносного сосуда;
2) Физические свойства вновь созданного бес-клеточного кондуита из внутренней грудной артерии
человека позволяют его использовать в качестве сосудистого трансплантата в эксперименте.
3) Отсутствие реакции острого отторжения в течение 6 нед. после гетерогенной трансплантации свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения технологии изготовления бесклеточных коллагеновых матриксов для сердечно-сосудистой хирургии.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г. Сердечно-сосудистая хирургия. М.: Изд-во НЦССХ им. А. Н. Бакулева РАМН; 2007. с. 13.
2. Collins P., Webb C.M., Chong C.F. et al. Radial artery versus saphenous vein patency randomized trial. 5 year angiographic follow up. Circulation 2008; 117: 2859—64.
3. Campeau L., Enjalbert M., Lesperance J. et al. Atherosclerosis and late closure of aortocoronary saphenous vein grafts: seqential angiografic studies at 2 week, 1 year, 5 to 7 years and 10 to 12 years after surgery. Circulation 1983; 68 Suppl II: 1—7.
4. Ахмедов Ш.Д., Афанасьев С.А., Дьякова М.Л. и др. Использование бесклеточного матрикса для формирования новых кровеносных сосудов и сердца методом тканевой инженерии. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; 4(2): 32-9.
5. Ахмедов Ш.Д., Бабокин В.Б., Дьякова М.Л. и др. Клеточные технологии при гибридных операциях лечения хронической сердеч-
ной недостаточности. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; 4(1): 74-7
6. Зорин В.Л., Зорина А.И., Черкасов В.Р. Анализ зарубежного рынка регенеративной медицины. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; 4(3): 68-78.
7. Смолянинов А.Б. Клеточная медицина: концепция ее развития. Клинич. патофиз. 2004; 1: 10-18.
8. Gerecht-Nir Sh., Radisic M., Park H., Biophysical regulation during cardiac development and application to tissue engineering. Int. J. Dev. Biol. 2006; 50: 233-43.
9. Пальцев М.А. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. М.: Медицина; 2009.
10. Erschenhagen T., Zimmerman W.H. C Engineering Myocardial Tissue. Circulation Research 2005; 97: 1220-31.
11. Schenke-Layland K., Vasilevski O., Opitz F. et al. Impact of decellularization of xenogeneic tissue on extracellular matrix integrity for tissue engineering of heart valves. J. Struct. Biol. 2003; 143: 201-8.
Поступила 25.08.2010
