CC BY
100
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 11 No. 3 2015, pp. 62-70 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 Zhivetev, Turskaya, Putilina, Markova, Graskova and Voinikov
ORIGINAL ARTICLE
The Role of Endophytic Microorganisms of Medicinal Plants in the Adaptation of Host Plants
Zhivetev M.A., Turskaya A.L., Putilina T.E., Markova Ju. A., Graskova I.A., Voinikov V.K.
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk, Russia *E-Mail: nik.19@mail.ru
Received August 11,2015
Cultures of microorganisms were isolated from endosphere of Lake Baikal littoral zone plants: Veronica chamaedrys L., Alchemilla subscrenata Buser, Achillea asiatica Serg., Taraxacum officinale Wigg., Plantago major L. Morphology and biochemical properties of isolated bacteria were studied. For the majority of the endophytic bacterial cultures cellulolitic and proteolytic activity has been shown, which necessary for the effective colonization of plant tissue. For many cultures revealed ability in varying degrees to form a biofilm to improve survival in a vegetative organism. Their potencial role in adaptation of plant-hosts under conditions of climat Baikal region was shown. In particular, 9 of cultures demonstrated ability to act as nitrogen retainer. The vast majority of bacterial cultures did not have phytotoxicity or demonstrated its low level, reflecting and minimum negative effects of them on plant. Moreover, culture with encryption P3, isolated from Plantago major in August, showed a stimulatory effect in experiments on phytotoxicity. This same culture possessed the highest ability to secrete sugars as at +26°С and at +4°С.
Key words: endophytic microorganisms, endosphere, medicinal plants, Veronica chamaedrys, Alchemilla subscrenata, Achillea asiatica, Taraxacum officinale, Plantago major, sugar
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 3 2015
63
The Role of Endophytic Microorganisms...
Проблема адаптации и устойчивости MATERIALS AND METHODS
лекарственных и сельскохозяйственных растений к Для исследования были выбраны виды
неблагоприятным факторам внешней среды до сих растений, наиболее часто встречающиеся на
пор остается одной из важных задач, территории стационара института «Речка
поставленных перед биологическими науками. Выдриная», расположенном на юго-восточном
Известно, что в процессы адаптации растений к побережье озера Байкал. Это манжетка
условиям произрастания вносят существенный городковатая Alchemilla subcrenata Buser,
вклад ряд ферментов и сигнальных молекул, вероника дубравная Veronica chamaedrys L.,
продукты белкового, липидного и углеводного тысячелистник азиатский Achillea asiatica Serg.,
метаболизма, а также симбиотические и одуванчик лекарственный Taraxacum officinale
ассоциативные эндофитные микроорганизмы. В Wigg., подорожник большой Plantago major L.
частности, разные виды Pseudomonas (Rahme et Растения в той или иной мере используются в
a/., 1997), Enterobacter (Zinnel et al., 2002) и других народной и классической медицине, но
родов (Gyaneshwar et al., 2001; Iniguez et al., 2004) недостаточно изучены. Известно, что все они
обнаружены внутри растительных тканей. Роль содержат аскорбиновую кислоту, флавоноиды,
эндофитных микроорганизмов в жизни растений дубильные вещества и в разной степени обладают
практически не изучена. Известно, что эндофиты противомикробным и противовирусным действием
способствуют адаптации растений к различным (Zorina, 2009; Telyatjev, 1985).
условиям окружающей среды, усиливая Так как эндофитные микроорганизмы могут
фотосинтез и продуктивность, устойчивость к участвовать в адаптации растений к
действию фитопатогенов и др. (Buharin et al., изменяющимся условиям внешней среды, из тканей
2007). Если, например, накопление сахаров исследуемых растений был выделен ряд культур
является важной составляющей защиты тканей и таких микроорганизмов и проведено их
клеток растений от замерзания в условиях низких тестирование.
температур (Trunova, 2007), то жизнедеятельность Бактерии выделяли из листовых пластинок
симбиотических организмов может способствовать растений после стерилизации их поверхности 10 %
сохранению редких лекарственных растений на раствором гипохлорита натрия. Для
более широком ареале за счет увеличения их идентификации полученных культур проводили
выживаемости. Поэтому целью данной работы стандартное описание их роста на плотной
было исследовать эндофитные микроорганизмы, питательной среде и на бульоне, окрашивали
выделенные из лекарственных растений, и выявить микроорганизмы по Граму с помощью теста
их вклад в адаптацию растений-хозяев. гидроокисью калия, определяли каталазную
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 3 2015
Zhivetev et al.
64
активность, тестировали на окисление- p<0,05 и для V. chamaedrys r=-1,00, p<0,05 - а в
ферментацию (ОФ) среды, рост на среде Иркутске: у T. оfficinale r=-0,94, p<0,05, у A.
Симмонса и восстановление нитратов до нитритов asiatica r=-0,91, p<0,05, у P. major r =-0,95, p<0,05.
(Voznyakovskaya, 1969). Также определяли Очевидно, накопление растворимых сахаров в
целлюлазную, протеолитическую и листьях лекарственных растений кроме
амилолитическую активность бактерий, рост на трофической осуществляло еще и
среде Эшби, способность образовывать криопротекторную функцию.
биопленки, фитотоксичность культур (Neto et al., В этой работе мы изучили эндофитные
2003). Образование биопленок бактериальными микроорганизмы, выделенные из тканей этих же
культурами определяли с помощью красителя растений, и вероятность их участия в адаптации
кристаллического фиолетового (Shaginyan et.al., растений-хозяев. Учитывая, что на территориях
2007). Сибири наиболее лимитирующим условием
Для определения общего содержания произрастания растений является температура,
водорастворимых сахаров в культуральной особенно низкая, сбор биологического материала
жидкости бактерий использовали антроновый осуществляли в августе и октябре (табл. 1). Всего
метод (Kochetkov et al., 1967). Оптическую было выделено более 40 изолятов бактерий. Из них
плотность раствора промеряли на основной интерес был сосредоточен на 16
спектрофотометре Soekol - 10 («Karl Zeiss», культурах, которые были протестированы наиболее
Германия) при длине волны 620 нм. полно (табл. 1 - 4).
RESULTS AND DISCUSSION Большинство из исследуемых микроорганизмов
Ранее нами было показано, что с наступлением являлись грамотрицательными каталазополо-
осенних холодов происходило накопление жительными палочками (табл. 1,3). По результатам
низкомолекулярных углеводов в тканях всех тестов такие культуры предположительно можно
исследуемых растений, но особенно сильно это отнести к роду Pseudomonas.
происходило в тканях листьев растений, Почти все исследованные культуры обладали
собранных вблизи побережья Байкала (Zhivetev et целлюлолитической и протеолитической
al., 2011). Линейные коэффициенты корреляции активностью, что может говорить об их
показали высокую и достоверную зависимость способности эффективно разрушать оболочки
содержания сахаров в листьях всех изученных клеток растений и колонизировать их (табл. 2).
лекарственных растений от температуры и В тканях листьев вероники были найдены
составили на р. Выдриная: для A. asiatica r=-0,97, эндофитные бактерии, которые способны
p<0,05, для P. major r=-0,98, p<0,05, для T. officinale r=-0,99, p<0,05, для A. subcrenata r=-0,98, восстанавливать нитраты и утилизировать цитрат
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 3 2015
65
The Role of Endophytic Microorganisms...
(табл. 3, 4).
Table 1. Основные свойства выделенных культур микроорганизмов
Вид растения Условный № культуры/ месяц выделения Окраска по Граму Форма клеток Рост на среде Эшби
Alchemilla subcrenata 15/08 + Палочки + +
18/08 - Палочки -
41/10 - Палочки +
Veronica chamaedrys 20/ 08 - Палочки -
22/ 08 - Изогнутые палочки -
24 / 08 - Палочки -
37/ 10 - Палочки -
38/ 10 - Палочки +
Taraxacum officinale 27 / 08 + Кокки + +
35/10 + Палочки +
36/ 10 + Коккобациллы +
Achillea asiatica 26 / 08 - Палочки -
Т1 / 08 - Палочки +
Т2-1/ 08 - Палочки -
Т2-2/ 08 + Палочки + +
Plantago major П3 / 08 - Палочки +
Table 2. Целлюлолитическая, протеолитическая и амилолитическая активности выделенных
культур микроорганизмов
Вид растения № культуры/ месяц выделения Целлюлолитическая активность Протеолитическая активность Амилолитическая активность
Alchemilla subcrenata 15/08 + + -
18/08 + + -
41/10 + + -
Veronica chamaedrys 20/ 8 + + -
22/ 8 + + -
24.08.15 + + -
37/ 10 + + -
38/ 10 + + -
Taraxacum officinale 27 / 8 Не исследовали + -
35/10 + + -
36/ 10 + + -
Achillea asiatica 26 / 8 + + -
Т1 / 8 - + -
Т2-1/ 8 - + -
Т2-2/ 8 + + -
Plantago major П3/ 8 + Не исследовали Не исследовали
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 3 2015
Zhivetev et al.
66
Table 3. Каталазная активность и способность восстанавливать нитраты у выделенных бактериальных культур
Вид растения № культуры/ месяц выделения Каталазная активность Способность восстанавливать нитраты
Alchemilla subcrenata 15/08 + Не исследовали
18/08 + -
41/10 + -
Veronica chamaedrys 20/ 8 + +
37/ 10 + -
Taraxacum officinale 27 / 8 + +
35/10 Не исследовали -
36/ 10 Не исследовали -
Achillea asiatica 26 / 8 + -
Table 4. Окисление-ферментация и способность к утилизации цитрата у выделенных культур
микроорганизмов
Вид растения № культуры/ месяц выделения Тест окисления-ферментации (ОФ-тест) Способность утилизировать цитраты
без масла с маслом
Alchemilla subcrenata 15/08 + - +
18/08 + + +
41/10 + + +
Veronica chamaedrys 20/ 8 + + +
22/ 8 + + +
24 / 8 + + +
37/ 10 + + +
38/ 10 + + +
Taraxacum officinale 27 / 8 + + -
35/10 + + -
36/ 10 - - -
Achillea asiatica 26 / 8 + + +
Т1 / 8 + - Не исследовали
Т2-1/ 8 + - Не исследовали
Plantago major П3 / 8 + - +
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 3 2015
67
The Role of Endophytic Microorganisms...
Table 5. Способность образовывать биопленки и фитотоксичность бактериальных культур
Вид растения № культуры Образование биопленки Фитотоксичность, в баллах, на луке
Alchemilla subcrenata 15 0,243±0,041 0
18 0,264±0,099 3
41 0,096±0,019 0
Veronica chamaedrys 20 0,102±0,013 0
22 0,165±0,041 0
24 0,171±0,103 0
37 0,213±0,190 0
38 0,122±0,011 0
Taraxacum officinale 27 0,122±0,021 1
35 0,120±0,012 0
36 0,257±0,108 1
Achillea asiatica 26 0,144±0,047 0-1
Т1 0,115±0,003 0
Т2-1 0,096±0,010 2
Т2-2 0,093±0,014 2
Plantago major П3 0,104±0,037 0
Контроль 0,085 0
Примечание: 0 - ткань остается неповрежденной и необесцвеченной; 1 - незначительно обесцвеченные ткани на
расстоянии 1 см вокруг точки инокуляции, ткани не повреждены; 2 - внутренние чешуйки обесцвечены или вялые; 3 - внутренние чешуйки вялые или обесцвеченные от верхушки к основанию
Table 6. Всхожесть семян в присутствии бактериальных культур
Вид растения № культуры Влияние на всхожесть семян
Пшеницы Редиса
Alchemilla subcrenata 15 Ингибировало Ингибировало
18 Ингибировало Ингибировало
41 Слабо подавляло Ингибировало
Veronica chamaedrys 22 Сильно подавляло Ингибировало
37 Ингибировало Ингибировало
38 Ингибировало Ингибировало
Taraxacum officinale 36 Ингибировало Ингибировало
Achillea asiatica 26 Ингибировало Ингибировало
Table 7. Содержание сахаров в культуральной жидкости при разных температурных условиях культивирования, 10-3мг/мл
Условное обозначение Вид растения, из которого Температура культивирования
культуры микроорганизмов выделена культура +26 °С +4 °С
Т1 Achillea asiatica 3,04±0,13 3,44±0,45
Т2-2 Achillea asiatica 2,99±0,19 1,52±0,17
П3 Plantago major 5,13±0,40 16,22±1,53
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 3 2015
Zhivetev et al.
68
Важным фактором для взаимодействия Была изучена фитотоксичность изолятов (табл.
эндофитных бактерий с растением служит 5). Наиболее высокую фитотоксичность на
способность фиксировать атмосферный азот. растениях лука проявила культура №18,
Оказалось, что 9 культур из 16 обладали выделенная из A. subcrenata. Средней
способностью расти на среде Эшби, что позволяет фитотоксичностью обладала культура №Т2-2,
предположить азотфиксирующую активность этих выделенная из A. asiatica. Низкой
микроорганизмов (табл. 1). фитотоксичностью обладали культуры: №27 и №36,
Существенным фактором, способствующим выделенные из T officinale и №26, выделенная из
адаптации бактерий к любым неблагоприятным A. asiatica. Остальные культуры не оказали
условиям, является образование биопленок, в фитотоксичного влияния на растения лука. Более
составе которых микроорганизмы лучше сохраняют того, культура П3, выделенная из Р. major,
жизнеспособность и эффективнее колонизируют наоборот, стимулировала рост побега растения.
растение. В результате проведенных исследований При этом на всхожесть семян исследуемые
было установлено, что способность к культуры в той или иной степени оказывали
формированию биопленкок у исследованных ингибирующее действие (табл. 6).
изолятов оказалась различной (табл. 5.). В растительном организме бактериальные
Культуры, выделенные из A. subcrenata в клетки, выделяющие низкомолекулярные углеводы,
августе (№15 и №18), характеризовались могут вносить свой вклад в пул этих молекул
достаточной степенью образования биопленки, в растительной цитоплазмы и не только
то время как культура, выделенная из A. «подкармливать» растения ди- и моносахаридами,
subcrenata в октябре (№41), показала практически но и способствовать адаптации к гипотермии,
контрольный уровень образования биопленки снабжая их дополнительными осмо- и
(табл. 5). Культуры, выделенные из V. chamaedrys, криопротекторными молекулами. Вначале нами
характеризовались слабым уровнем образования была показана способность секретировать сахара
биопленок. Культуры, выделенные из A. asiatica, у ряда бактериальных культур, в том числе
также не обладали выраженной способностью выделенных из P. major (культура П3), A. asiatica
формировать биопленки. Бактериальная культура (Т2-1), V. chamaedrys (культура 37), A. subcrenata
№36, выделенная из T. officinale, показала (культура 41). Культуры выращивались на бедной
наиболее высокую способность формировать безуглеводной среде, но после инкубирования
биопленки, что свидетельствует о ее способности низкомолекулярные углеводы в культуральной
выживать в неблагоприятных условиях, в том числе жидкости обнаруживались.
сосудах, проводящих пучках растений, в Далее мы изучили, меняется ли секреция
межклетниках. сахаров бактериальными клетками в окружающую
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 3 2015
69
The Role of Endophytic Microorganisms...
среду в зависимости от внешних температурных условий (табл. 7).
Из трех представленных культур в двух наблюдали изменения в накоплении сахаров в
культуральной жидкости в зависимости от
температурного режима культивирования. В
культуре Т2-2, при температуре культивирования близкой к нулю (4°С), наблюдали сильное понижение секреции низкомолекулярных углеводов микроорганизмами (в два раза). Культура П3, выделенная из P. major, наоборот, продемонстрировала троекратное увеличение накопления сахаров в среде культивирования. Интересно, что именно эта культура (П3) стимулировала рост побегов растения в опытах на фитотоксичность. Возможно, эти два свойства культуры П3 тесно взаимосвязаны. Не исключено, что относительно высокая (5,13 - 16,33 10-3мг/мл) способность этой культуры секретировать сахара полезна для растения и этот эндофит выступает в роли симбионта.
CONCLUSION
Из тканей лекарственных растений выделены эндофитные микроорганизмы.
Показана их способность эффективно колонизировать растение и выживать в нем за счет наличия целлюлолитических и протеолитических ферментов и способности к биопленкообразованию. При этом большинство культур микроорганизмов сохраняли низкую фитотоксичность или ее полное отсутствие.
Показана возможность участия изученных
изолятов эндофитных бактерий в адаптации растений-хозяев. В частности, ряд культур могут быть азотфиксаторами и секретировать сахара, что должно благоприятно сказываться на росте, развитии и жизнеспособности растений.
REFERENCES
Buharin E.S., Lobakova N.V. and Nemtseva O.V. (2007) Assotsiativnyj simbioz. Ekaterinburg: UrO RAN, 264 s. (in Russian).
Gyaneshwar P., James E.K. and Mathan N. (2001) Endophytic Colonization of Rice by a Diazotrophic Strain of Serratia marcescens. Journal of Bacteriology, 8, 2634-2645.
Iniguez A.L., Dong Y.M., Triplett E.W. (2004) Nitrogen fixation in wheat provided by Klebsiella pneumoniae 342. Mol. Plant-Microbe Interact, 17, 1078-1085.
Kochetkov N.K., Bochkov A.F., Dmitriev B.A., Usov A.I., Chizhov O.S. and Shibaev V.N. (1967) Himiya uglevodov. M.: Himiya, 672 s. (in Russian).
Neto J. R., Yano T., Beriam L.O.S., Destefano S.A.L., Oliveira V.M. and Rosato Y.B. (2003) Comparative Rflp-Its Analysis Between Enterobacter Cloacae Strains Isolated From Plants And Clinical Origin. Arq. Inst. Biol. Sao Paulo, 70. P. 367-372.
Rahme L.G., Tan M.W. and Le L. (1997) Use of model plant hosts to identify Pseudomonas aeruginosa virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 24, 13245-13250.
Shaginyan I.A., Danilina G.A., Chernuha M.Yu.,
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 3 2015
Zhivetev et al.
70
Alekseeva G.V. and Batov A.B. (2007) Formirovanie bioplenok klinicheskimi shtammami bakterij kompleksa Burkholderia cepacia v zavisimosti ot ih fenotipicheskih I genotipicheskich harakteristik. ZhMEI, 1, 3-9. (in Russian).
Telyatjev V.V. (1985) Poleznye rasteniya Tsentralnoj Sibiri. Irkutsk: Vostochno-Sibirskoe knishnoe izdatelstvo, 384 s. (in Russian)
Trunova T.I. (2007) Rastenie i nizkotemperaturnyj stress. M.: Nauka, 54 s. (in Russian).
Voznyakovskaya Yu. M. (1969) Mikroflora rastenij i urozhaj. L.: Kolos, 238 s. (in Russian).
Zinnel D.K., Lambrecht P., Harris N.B. and Feng Z. (2002) Isolation and Characterization of Endophytic Colonizing Bacteria from Agronomic Crops and Prairie Plants. Appl. Environ. Microbiol, 68, 2168-2208.
Zhivetev M.A., Graskova I.A., Pomortsev A.V. and Voinikov V.K. (2011) Water and carbohydrate content at leafs of plants used in medicine during vegetation. Journal of Stress Physiology & Biochemistry, 4, 69-79.
Zorina E.V. (2009) Farmagnosticheskoe izuchenie vidov roda Alchemilla L. Permskogo kraya. Avtoref. diss. na soisk. uch. st. kand. farmats. Nauk, Perm, 21 s. (in Russian).
JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 11 No. 3 2015
