CC BY
95
biologicheskiy vestnik. 2008-2009;8(14):34-40. Russian.
11. Sidorenko YuS. Autogemokhimioterapiya. Rostov na Donu; 2002. Russian.
12. Tyulyandin SA. Lechenie bol'nykh rasprostranennym rakom yaichnikov. V ezhegodnaya Rossiyskaya onkologi-cheskaya konferentsiya. Moscow; 2001. Russian.
13. Anisimov VN, Popovich IG, Zabezhinski MA, et al. Melatonin as antioxidant, geroprotector and anticarcinogen. Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 2006;1757(5-6):573-89.
14. Arendt J. Melatonin: Characteristics, concerns, and prospects. J. Biol. Rhytms. 2005;20(4):291-303.
15. Karsliogly I, Ertekin MV, Taysi S. Radioprotective effects of melatonin on radiation-induced cata-ract. J. Radiat.Res. 2005;46(2):277-82.
16. Piketty M, et al. Ovarian recurrence after radical tra-chelectomy for adenocarcinoma of the cervix. Department of Gynecology and O bstetrics, Hôpital Tenon, Paris, France. Am J. Obstet Gynecol. 2007;Feb;196(2):e22.
17. Volante R, Ronco G. National survey of the quality of 2nd level in screening for cervical cancer. Azienda Ospedaliera O.I.R.M. Sant'Anna, Torino: Epidemiol Prev. 2006;1:51-7.
УДК: 615.9 DOI: 10.12737/5918
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭНТЕРОСОРБЕНТОВ НА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОТОКСИКОЗА
Н.В. КЕЛУС, В.С. ЧУЧАЛИН, В.В. ИВАНОВ, А.Н. ДЗЮМАН, О.А. КАЙДАШ
ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Московский тракт, 2, г. Томск, Россия, 634050
Аннотация. Проведена сравнительная оценка детоксикационных свойств порошка дерновины сфагнума бурого, угля активированного и полисорба МП на модели хронического эндотоксикоза, моделируемого введением экспериментальным животным тетрахлорметана и липополисахарида S. thyphi. Эффективность исследуемых объектов оценивали по их влиянию на биохимические показатели сыворотке крови и гистологическому исследованию печени и почек крыс. Введение крысам тетрахлорметана и липополисахарида в условиях хронического эксперимента приводило к существенному повышению в сыворотке крови активностей аланинаминотрасферазы и аспартатаминотрансферазы, увеличению уровня малонового диальдегида, а так же снижению содержания белка и мочевины. Введение порошка дерновины сфагнума бурого животным с экспериментальным хроническим эндотоксикозом ограничивало токсические проявления тетрахлорметана и липополисахарида, что проявлялось в снижении активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и уровня малонового диальдегида. При этом в сыворотке крови повышалось содержание белка и мочевины, что свидетельствовало о частичной нормализации функций печени. Таким образом, курсовое назначение исследуемых сорбентов в условиях экспериментального хронического эндотоксикоза сопровождается снижением выраженности эндотоксической реакции, связанной с нарушением структуры и функций клеток печени. Детоксикоционная активность порошка дерновины сфагнума бурого не уступает эффекту полисорба МП и угля активированного.
Ключевые слова: сфагновые мхи, порошок дерновины сфагнума бурого, энтеросорбент.
THERAPEUTIC EFFICACY OF ENTEROSORBENTS ON THE MODEL OF CHRONIC ENDOTOXICOSIS
N.V. KELUS, V.S. CHUCHALIN, V.V. IVANOV, A.N. DZUMAN, O.A. KAIDACH
Siberian State Medical University, Moskow highway, 2, Tomsk, Russia, 634050
Abstract. A comparative evaluation of detoxification properties of a powder of brown peat moss's turf, activated charcoal and po-lisorb has been studied on a model of chronic endotoxicosis, simulated by the administration of tetrachloromethane and lipopolysac-charide S. thyphi to the experimental animals. The effectiveness of the investigated objects has been evaluated by their effect on serum biochemical parameters and histology of liver and kidney. The administration of tetrachloromethane and lipopolysaccharide to the rats in the chronic experiment has shown statistically significant increase of aspartataminotransferase, alaninaminotransferase and malon-dialdehyde, and have been decreased significantly protein and urea in serum. The administration of powder of brown peat moss's turf to the animals with experimental chronic endotoxicosis has limited the toxicity of tetrachloromethane and lipopolysaccharide. This has been resulted in lower activities of aspartataminotransferase and alaninaminotransferase, and level of malondialdehyde. But levels of protein and urea have been increased in serum, that indicating of a partial normalization functions of liver. Thus, the course administration of investigated sorbents in steady of experimental chronic endotoxicosis is accompanied by a significant decrease of endotoxic reaction associated with disruption of the structure and functions of the cells of liver. The detoxification activity of the powder of brown peat moss's turf doesn't yield to the effects of polisorb and activated charcoal.
Key words: sphagnum mosses, powder of brown peat moss, enterosorbent.
Введение. Включение энтеросорбентов в комплексную фармакотерапию различных заболеваний позволяет быстро устранить симптомы интоксикации. Практически все энтеро-сорбенты обладают способностью к дистантному действию, которое заключается в появлении изменений тех или иных биохимических параметров в органах и тканях, удалённых от желудочно-кишечного тракта. Наиболее важными проявле-
ниями такого действия являются гепатопротекторный, анти-холестеринемический и иммуномодулирующий эффекты. Благодаря столь разнообразным особенностям действия энте-росорбенты используются в онкологии, кардиологии, гастроэнтерологии, инфекционных заболеваниях [6,8-10].
Целесообразность широкого применения энтеросор-бентов определяют потребность в препаратах этой группы
с аффинитетом к веществам различной природы и обладающими оптимальными фармакоэкономическими характеристиками. Особого внимания заслуживают энтеросор-бенты растительного происхождения, характеризуемые доступностью сырья, низким уровнем побочных реакцией и выраженным сорбционным потенциалом.
Ранее нами в экспериментах in vitro и in vivo было показано, что сфагновые мхи обладают адсорбционными и детоксикационными свойствами [1,5].
Цель работы - исследование терапевтической эффективности порошка дерновины сфагнового мха в опытах in vivo на модели хронического эндотоксикоза.
Материалы и методы исследования. Исследования проводили на 50 белых крысах самцах массой 160-280 г, полученных из вивария ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г. Томск). Животные находились в стандартных условиях содержания на естественном световом режиме при свободном доступе к воде и пище (температура воздуха в виварии 20±2°С, влажность - не более 80 %). Кормление животных осуществляли специальными гранулами с минеральными и витаминными добавками «ПроКорм» для лабораторных крыс фирмы ЗАО «БиоПро» (г. Новосибирск).
Содержание и все манипуляции, которым подвергались животные во время карантина и исследования, соответствовали правилам лабораторной практики, утвержденным приказом министра здравоохранения и социального развития от 23 августа 2010 г. N 708н «Об утверждении правил лабораторной практики», а также с соблюдением конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, принятой Европейским союзом в 1986 году, и директивы 86/609 ЕЭС, основанной на тексте соглашения "Dr. RobertHubrecht, Current EU Legislation Controlling Animal Experiments".
После карантина формировали 5 экспериментальных групп по 10 крыс в каждой методом случайной выборки из особей, имеющих близкую массу.
Хронический эндотоксикоз (ХЭТ) вызывали внутрижелу-дочным введением тетрахлорметана (ТХМ) в масляном растворе (1:1) в дозе 1 мл/кг веса животного в течение 20 дней через день. На 6, 13, 20 день крысам внутрибрюшинно вводили липополисахарид S. thyphi (ЛПС) в дозе 20 мг/кг, через 24 часа после последней инъекции животных выводили из эксперимента декапитацией под эфирным наркозом [3,7].
Животным 3-5 групп, получавших токсические агенты по схеме ХЭТ, с третьего дня ежедневно вводили водные суспензии порошка угля активированного (УА) в дозе 500 мг/кг, порошка дерновины сфагнума бурого (ПДСБ) в дозе 500 мг/кг и Поли-сорб МП в дозе 450 мг/кг соответственно в течение 21 дня. На 7, 14, 21-ый день ЛПС внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг. Контрольные животные получали эквиобъемное количество растворителей.
Степень развития интоксикации оценивали по активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатами-нотрансферазы (АСТ), содержанию мочевины, общего белка и уровню малонового диальдегида (МДА) в сыворотке, которую получали центрифугированием крови при 1500 g в течение 15 мин на центрифуге СМ-6М (Россия). Активность ферментов, содержание мочевины определяли кинетическим методом с помощью наборов фирмы «ChronolabAG» (Швейцария) согласно прилагаемым к наборам протоколам. Концентрацию белка измеряли биуретовым методом с использованием набора «Ольвекс диагностикум» (г. Санкт-Петербург), уровень МДА по методу К. Jagi [11].
Печень, почки, легкие и сердце животных подвергали
гистологическому исследованию. Для этого кусочки органов фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (Biovitrum, Россия), обезвоживали в изопропиловом спирте -раствор IsoPrep (Biovitrum, Россия), заливали в парафин (Histomix, Россия) по методике Ю.А. Криволапова [2]. На микротоме изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм, которые затем монтировали на предметные стекла и окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления коллагеновых волокон и оценки их зрелости дополнительно окрашивали по методу Ван Гизона [3,4]. Микропрепараты просматривали в проходящем свете на микроскопе Axioskop 40 (Carl Zeiss, Germany). Для количественной оценки изменений вычисляли объемные доли (мкм3/мкм3) основных гистологических компонентов исследуемых органов.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программ STATISTICA 6.0 для Windows. Статистическую значимость различий в сравниваемых группах определяли по непараметрическому U-критерию Манна-Уитни. Различия между группами полагали статистическими значимыми на уровне статистической значимости р< 0,05. Средние величины представлены в виде (M±m), где М - среднее арифметическое, а m - стандартная ошибка среднего значения [12].
Результаты и их обсуждение. Введение крысам ТХМ и ЛПС в условиях хронического эксперимента приводило к достоверному повышению в сыворотке крови активностей АЛТ и АСТ в 2,1 и 1,7 раза соответственно, увеличению уровня МДА в 2,5 раза, а так же снижению содержания белка на 36% и мочевины на 40% по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы животных (табл. 1).
У животных с ХЭТ введение сорбентов ограничивало выход в кровяное русло АЛТ: под влиянием УА - на 12%, Полисорба МП - на 19%, ПДСБ - на 28% в сравнении с аналогичными показателями крыс, получавших ТХМ и бактериальный ЛПС (р<0,05). Активность АСТ в сыворотке крови животных, которым вводили УА и Полисорба МП, уменьшалась на 15%, ПДСБ - на 20% (р<0,05) Уменьшение активности ферментов под действием сорбентов может быть связано с ингибированием интенсивности ПОЛ, о чем свидетельствовало снижение в сыворотке крови уровня МДА: у животных, получавших УА и Полисорба МП, - на 40%, ПДСБ - на 30% в сравнении с соответствующим показателем крыс с ХЭТ, не подвергавшихся лечению энтеросорбентами (р<0,05).
Введение исследуемых препаратов препятствовало снижению содержания мочевины в сыворотке крови, ее уровень под влиянием Полисорба МП был на 12,5%, УА -на 23% и ПДСБ - 17% выше, чем аналогичный показатель у животных с ХЭТ. Концентрация белка повышалась на 20, 31 и 26% соответственно (р<0,05).
Развитие выраженной эндотоксической реакции под влиянием ТХМ и ЛПС подтверждалось выраженными нарушениями структуры клеток печени и почек.
На срезах печени границы долек определялись слабо, центральные вены и синусоиды незначительно и неравномерно расширены. В портальных трактах наблюдали увеличение просвета и переполнение эритроцитами части междольковых вен, клеточный детрит сдавливал центральную вену, затрудняя её визуализацию. По ходу портальных трактов присутствовала лимфоцитарная инфильтрация. Часть гепатоцитов имели признаки жировой дистрофии или была некротизирована. Гибель гепатоцитов регистрировали преимущественно в центральной части дольки. Обнаруживались клетки с признаками гипертрофии, размер которых превышал обычные в 2-3 раза (рис. 1а).
- ■ й ¿V X* у*' * / ~ bSsISj «9 . л* • • г Ш X i ' vi i ^ vy r
■Л(уПИг'' л с 1 / 3> Я еЗ 7 Ol KS ■ '■ ■ т
Рис. 2. Структура почек крыс, с ХЭТ - а; Структура почек крыс, получавших Полисорб МП - в; Структура почек крыс, получавших УА - г; Структура почек крыс, получавших ПДСБ - д (окраска - гематоксилин и эозин, увеличение *250)
В микропрепаратах животных с ХЭТ, получавших ПДСБ, Полисорб МП и УА, гистологическая картина печени в целом была сходна с таковой в группе животных с эндоток-сикозом, однако присутствующие признаки жировой дистрофии и некроза гепатоцитов выражены значительно слабее (рис. 1 в, г, д).
Количественными характеристиками этого процесса стало увеличение объемных долей гепатоцитов с жировой дистрофией, некрозов, центральных вен, соединительной ткани (табл. 2). На фоне лечения ПДСБ количество клеток
печени с жировой дистрофией снижалось в 2 раза, некрозов - в 3 раза по сравнению с аналогичными показателями у крыс, получавших УА и Полисорб МП.
Сравнение результатов измерений показало, что эффективность протекторного действия энтеросорбентов в отношении паренхимы печени на модели ХЭТ убывала в ряду: ПДСБ>Полисорб МП>АУ.
Рис. 1. Структура печени крыс, с ХЭТ - а; Структура печени крыс, получавших ПДСБ - в; Структура печени крыс, получавших Полисорб МП - г; Структура печени крыс, получавших УА - д (окраска - гематоксилин и эозин, увеличение *250)
Таблица 1
Влияние сорбентов на биохимические показатели сыворотки крови с хроническим эндотоксикозом (М±т, средние из 10 наблюдений)
Исследуемые группы животных
Показатели Контрольная ТХМ ТХМ+ ЛПС+ УА ТХМ+ ТХМ+ ЛПС+ Полисорб МП
группа +ЛПС ЛПС+ПДСМ
АЛТ, U/L 48,04+0,4 102,7+3,32 90,6+1,81 73,8+5,31 83,0+7,61
АСТ, U/L 65,6±0,8 111,4+3,7: 94,1+3,0' 89,2+4,51 87,9+4,21
Мочевина, ммоль/л 9,0+0,4 6,4+0,62 7,9+0,31 7,5+0,11 7,2+0,11
Белок, г/л 93,8+2,9 69,0+6,02 90,6+7,91 86,7+3,11 82,9+2,31
МДА, кмоль/л 1,5+0,1 3,7+0,62 2,2+0,31 2,6+0,41 2,1+0,31
Примечание : 1 - р<0,05 по сравнению с эндотоксикозом, вызванным ТХМ + ЛПС; 2 - р<0,05 по сравнению с контрольной группы
Таблица 2
Влияние сорбентов на объемные доли (мкм3/мкм3) основных гистологических компонентов органов при хроническом эндотоксикозе (М±т, средние из 10 наблюдений)
Гистологические компоненты органов Контрольная группа ХЭТ, вызванный, ТХМ и ЛПС УА Полисорб МП ПДСБ
Объемные доли структур печени (мкм3/мкм3)
Гепатоцитов без патологии 83,50+1,1 43,10+2,01 51,00+2,04 46,70+1,351 60,60+1,484
Гепатоцитов с жировой дистрофией 0,50+0,3 8,40+0,81 8,50+0,71 8,30+0,601 11,80+1,014
Некрозов 0,00+0,0 23,90+0,61 18,90+0,84 19,50+0,74 9,00+1,14
Центральных вен 1,00+0,0 2,80+0,41 2,50+0,3i.2 2,30+0,4« 2,00+0,44
Триад 1,20+0,2 1,70+0,31 1,20+0,2 2,00+0,4« 1,70+0,31
Соединительной ткани 0,50+0,1 1,80+0,21 1,20+0,2« 1,30+0,24 1,80+0,31
Синусоидов 13,30+1,1 18,30+1,21 16,70+1,34 19,90+0,91 13,10+1,12
Объемные доли структур почек (мкм3/мкм3)
Капилляры клубочков 10,40+2,4 9,90+1,2 5,90+0,4« 9,90+1,2 13,20+1, 71'2
Пространство капсулы Боумена 2,00+0,5 1,60+0,31 4,10+0,44 1,60+0,31 2,70+0,41
Просвет канальцев 11,10+0,9 13,10+1,11 15,00+0,74 13,00+1,1 9,10+0,52
Эпителий канальцев 68,80+2,7 52,70+3,01 17,90+1,44 60,20+2,31,2 45,10+1,94
Соединительная ткань 3,00+0,5 7,30+1,11 11,50+0,94 3,00+0,52 5,30+0,84
Некроз канальцев 0,00+0,0 5,80+1,01 6,90+0,91 7,90+1,11,2 15,30+1,14
Сосуды 3,90+0,6 8,70+1,01 7,70+0,91 3,90+0,6 7,40+0,72
Отек 0,80+0,2 0,90+0,2 1,00+0,11 0,50+0,11 1,90+0,64
Примечание:1-р<0,01 по сравнению с контрольной группой;
2-р<0,05 по сравнению с группой ХЭТ
При ХЭТ в паренхиме почек крыс развивалась выраженная дисметаболическая нефропатия, признаками которой являлись сосудистые нарушения, отек и инфильтрация ткани, дистрофия и некроз эпителия канальцев, развитие очагового нефросклероза (рис. 2 а). Количественными критериями развития ЭТ стал прирост объемной доли соединительной ткани и пространства клубочков и пространства капсул Боумена. В паренхиме почек животных, получавших УА, наблюдали снижение количества капилляров клубочек в 2 раза, эпителия канальцев - 1,7 раз и увеличение пространства капсул Баумена и сосудов в 2 раза. У всех животных, леченых энтеросорбентами, отмечали выраженный некроз ткани по-
чек. У крыс, получавших ПДСБ, проявлялись более выраженные повреждения канальцев почек (рис. 2 в, г, д).
Эффективность протекторного действия энтеросор-бентов в отношении почечной паренхимы на модели ХЭТ убывала в ряду: Полисорб МП>АУ>ПДСБ.
Заключение. Полученные данные свидетельствуют о том, что курсовая фармакотерапия энтеросорбентами в значительной мере уменьшает тяжесть течения эндотокси-коза, снижает выраженность тканевого повреждения и частично стабилизирует биохимические показатели крови. Эффективность предлагаемого средства на основе дерновины сфагнума бурого сопоставима, а по ряду показателей превышает активность референтных препаратов.
Литература
1. Адсорбционная активность сырья водно-болотных растений Западной Сибири / Келус Н.В., Бабешина Л.Г., Дмитрук С.Е. [и др.] // Бюллетень сибирской медицины. 2009. № 4. С. 37-41.
2. Криволапов Ю.А., Леенман Е.Е. Морфологическая диагностика лимфом. СПб.: «Издательско-полиграфическая компания «КОСТА», 2006. 208 с.
3. Новочадов В.В., Писарев В.Б. Эндотоксикоз: Моделирование и органопатология: монография. Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2005. 240 с.
4. Саркисов Д.С. Перов Д.С. Микроскопическая техника. М.: Медицина, 1996. 544 с.
5. Келус В.С., Чучалин В.С., Иванов В.В., Дзюман А.Н., Кайдаш О.А., Ярцев К.С. Терапевтическая эффективность энтеросорбентов на модели острого эндотоксикоза // Вестник новых медицинских технологий. 2013. Т. 20. № 3. С. 133-139.
6. Турищев С.П Оздоровление и фитотерапия // Врач: Ежемесячный научно-практический и публицистический журнал Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова. 2004. № 10. С. 62-64.
7. Чучалин В.С. Фармакологические и технологические аспекты разработки новых гепатопротективных препаратов природного происхождения: дис. ... д-ра фарм. наук. Томск, 2003. 317 с.
8. Учайкин В.Ф., Новокшонов А.А., Соколова Н.В., Бережков Т.В. Энтеросорбция - роль энтеросорбентов в комплексной терапии острой и хронической гастроэнтерологической патологии: пособие для врачей. Москва, 2008. 24 с.
9. Энтеросорбция эффективный метод этиопатогенетической терапии острых кишечных инфекций / Учайкин В.Ф., Новокшонов А.А., Соколова Н.В. [и др.] // Детские инфекции. 2005. № 3. С. 39-43.
10. Chronic treatment with the antidepressant tianeptine attenuates lipopolysaccharide-induced Fos expression in the rat paraventricular nucleus and HPA axis activation / Castanon N., Konsman J.P. [et al.] // Psychoneuroendocrinology. 2003. Vol. 28. № l. P. 19-34.
11. Yagi K. A simple fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma // Biochem. Med. 1976. Vol. 12. № 2. P. 212-
216.
12. Хадарцев А.А., Яшин А.А., Еськов В.М., Агарков Н.М., Кобринский Б.А., Фролов М.В., Чухраев А.М., Гонда-рев С.Н., Хромушин В.А., Каменев Л.И., Валентинов Б.Г., Агаркова Д.И. Информационные технологии в медицине. Монография. Тула: ТулГУ, 2006. 272 с.
References
1. Kelus NV, Babeshina LG, Dmitruk SE, et al. Adsorbtsionnaya aktivnost' syr'ya vodno-bolotnykh rasteniy Zapadnoy Sibiri. Byulleten' sibirskoy meditsiny. 2009;4:37-41. Russian.
2. Krivolapov YuA, Leenman EE. Morfologicheskaya diagnostika limfom. SPb.: «Izdatel'sko-poligraficheskaya kompaniya «KOSTA»; 2006. Russian.
3. Novochadov VV, Pisarev VB. Endotoksikoz: Modelirovanie i organopatologiya: monografiya. Volgograd: Izd-vo VolGMU; 2005. Russian.
4. Sarkisov DS, Perov DS. Mikroskopicheskaya tekhnika. Moscow: Meditsina; 1996. Russian.
5. Kelus VS, Chuchalin VS, Ivanov VV, Dzyuman AN, Kaydash OA, Yartsev KS. Terapevticheskaya effektivnost' enterosorbentov na modeli ostrogo endotoksikoza [Therapeutic efficiency of enterosorbents on model of acute endotoxicosis]. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2013;20(3):133-9. Russian.
6. Turishchev SP. Ozdorovlenie i fitoterapiya. Vrach: Ezhemesyachnyy nauchno-prakticheskiy i publitsisticheskiy zhurnal Moskovskaya meditsinskaya akademiya im. I.M. Sechenova. 2004;10:62-4. Russian.
7. Chuchalin VS. Farmakologicheskie i tekhnologicheskie aspekty razrabotki novykh gepatoprotektivnykh preparatov prirodnogo proiskhozhdeniya [dissertation]. Tomsk (Tomsk region); 2003. Russian.
8. Uchaykin VF, Novokshonov AA, Sokolova NV, Berezhkov TV. Enterosorbtsiya - rol' enterosorbentov v kompleksnoy terapii ostroy i khronicheskoy gastroenterologicheskoy patologii: posobie dlya vrachey. Moskva; 2008. Russian.
9. Uchaykin VF, Novokshonov AA, Sokolova NV, et al. Enterosorbtsiya effektivnyy metod etiopatogeneticheskoy terapii ostrykh kishechnykh infektsiy. Detskie infektsii. 2005;3:39-43. Russian.
10. Castanon N, Konsman JP, et al. Chronic treatment with the antidepressant tianeptine attenuates lipopolysaccharide-induced Fos expression in the rat paraventricular nucleus and HPA axis activation. Psychoneuroendocrinology. 2003;28(l):19-34.
11. Yagi K. A simple fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma. Biochem. Med. 1976;12(2):212-6.
12. Khadartsev AA, Yashin AA, Es'kov VM, Agarkov NM, Kobrinskiy BA, Frolov MV, Chukhraev AM, Gondarev SN, Khromushin VA, Kamenev LI, Valentinov BG, Agarkova DI. Informatsionnye tekhnologii v meditsine. Monografiya. Tula: TulGU; 2006. Russian.
