CC BY
62
ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ТРЕХ СОРТОВ МАСЛИЧНОГО ЛЬНА
© Тезекбаева Б.К.*, Ахметжанова А.Б.Ф, Малахова Н.П.*
РГП «Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина» КН МОН РК, Республика Казахстан, г. Алматы
Лён обыкновенный (Linum usitatissimum) многофункциональное масличное растение, масло и волокна которого широко используют в различных областях легкой, пищевой и строительной промышленности. Для создания новых линий льна с повышенной адаптивной способностью к условиям засухи, с целью расширения зоны их возделывания, использованы методы клеточной селекции и биотехнологии. Подобраны условия стерилизации семян и получения эксплантов из проростков семян 3 сортов льна масличного - Северный, ЛМ-98 и ВНИИМК-620. Подобраны и оптимизированы условия введения в культуру и культивирования каллусных культур льна всех исследуемых сортов. Проведена оценка каллусообразования и максимального прироста биомассы каллусов льна. Получены каллусные культуры льна трех сортов Северный, ЛМ-98 и ВНИИМК-620.
Ключевые слова лен, культура клеток, каллус, фитогормон.
Введение
Лён (лат. Linum) - растения семейства Льновые (Linaceae). К роду Linaceae относится более ста видов растений, из которых самым восстребо-ванным в производстве считается лён обыкновенный, или прядильный (Linum usitatissimum). Из семян льна, содержащих до 48 % масла, получают высококачественное техническое масло, применяемое в лакокрасочной и кожевенно-обувной промышленности для изготовления красок, лаков, замазки, мыла, клеенок, непромокаемых тканей, линолеума и суррогатов каучука. Волокна из стеблей растений льна используют для изготовления одежды, строительного утеплителя, уплотнительного материала. По скороспелости лен масличный превосходит все масличные культуры, а экономическая эффективность его не имеет себе равных среди полевых культур Урала, Западной Сибири и Северного Казахстана. По данным ФАО в настоящее время на всех континентах льном масличным занято около 3,0 млн. га. Из них 70 % мирового производства масло семян сосредоточено в 4 странах, таких как Канада, КНР, Аргентина и Индия [1, 2].
В Республике Казахстан промышленное возделывание льна производится преимущественно в северных регионах страны, что связано с особен-
* Младший научный сотрудник лаборатории биоинженерии растений.
* Лаборант лаборатории биоинженерии растений.
" Заведующий лабораторией биоинженерии растений, кандидат биологических наук.
ностями условий его культивирования [3]. Учитывая возрастающую вос-стребованность производства этой культуры и для расширения зон ее промышленного возделывания, во многих развитых странах активно применяют современные биотехнологические методы, позволяющие получать новые сорта льна пригодные для возделывания в различных климатических зонах. Наиболее перспективным подходом для создания новых линий льна с повышенной адаптивной способностью к стрессовым абиотическим факторам является использование различных методов клеточной селекции, применение которых обеспечивает целенаправленный отбор клеток с повышенной устойчивостью к селективному фактору.
Цель работы заключалась в подборе и оптимизации биотехнологических методов для введения растений льна в клеточную культуру в условиях in vitro.
Материал и методы
Объекты исследований. Объектами для введения в культуру in vitro служили 3 сорта льна масличного сорт Северный, сорт ЛМ-98, сорт ВНИИМК-620.
Сорт Северный. Сорт раннеспелый. Вегетационный период - 7087 дней. Благодаря раннеспелости и высокой пластичности он может возде-лываться от степной зоны до зоны подтайги. Урожайность семян от 1,2 до 2,5 т/га. Масличность семян - 47,0-50,0 %, йодное число масла - 180-186 ед. Обладает высокой устойчивостью к фузариозу (90-95 %), осыпанию и полеганию. Сорт пригоден для механизированного возделывания.
ВНИИМК 620. Среднеспелый высокопродуктивный, высокомасличный сорт. Способен формировать урожайность семян до 2,5 т/га. Масличность семян до 50 %, йодное число масла до 195 ед. Высокоустойчив к фузариозу, устойчив к полеганию.
ЛМ 98. Сорт пищевого назначения. Содержание жира в семенах 42,8 %. Содержание линолевой кислоты в масле 68,9 %, линоленовой - 4,0 %. Устойчивость к полеганию 5, осыпанию - 4,6 балла.
Стерилизацию семян проводили различными способами с применением 70 % этанола, 20 % раствора Domestos, 10 % раствора гипохлорида натрия, 30 % раствора перекиси водорода и их комбинаций. Культивирование семян проводили на модифицированных агаризованных питательные среды Мура-сиге-Скуга (МС) и Гамборга (В5) с различным содержанием фитогормонов 2,4-Д (дихлорфеноксиуксусная кислота), БАП (6-бензиламинопурин), НУК (нафтилуксусная кислота). В качестве источника углерода была использована сахароза в концентрации 30-60 г/л. Для получения полутвердой питательной среды применяли агар-агар марки «Bacto agar» в концентрации 6-8 г/л. Контролем служили семена всех трех сортов, высаженные на питательную среду МС без гормона. Культивирование клеток проводили при температуре
воздуха +24 °С +26 °С, освещенности 5 тысячи люкс на стеллажах с лампами дневного света в климокамере «Binder» (Германия) [4, 5].
Результаты и обсуждение
В качестве эксплантов для введения в культуру использовали проростки из семян растений льна, условия стерилизации которых подбирали экспериментально.
Стерилизацию семян проводили двумя способами. Первый способ: 20 % раствор «Domestos» 10 минут, 30 % раствор перекиси водорода 7 минут, 10 % раствор гипохлорида натрия 10 минут, 70 % этанол 5 минут. Второй способ стерилизации: 20 % раствор «Domestos» 20 минут, 10 % раствор гипохлори-да натрия 10 минут, 70 % этанол 5 минут. По результатам исследований первый способ определен как наиболее эффективный. Выход стерильных эксплантов после обработки этим способом составил 97 %, тогда как при использовании второго способа, количество стерильных эксплантов не превышало 60 %. Таким образом, для стерелизации семенного материала льна в исследовании использовали первый способ с 30 % раствором перекиси водорода.
Семена льна выращивали на универсальной агаризованной питательной среде Мурасиге - Скуга (МС) и Гамборга В5 с добавлением сахарозы и различным содержанием фитогормонов (табл. 1). Для оптимизации и подбора условий культивирования каллусных культур льна были использованы 4 варианта питательных сред МС, ГВ5. Оценку сред делали по приросту биомассы и частоте образования каллусов.
Таблица 1
Варианты питательной среды
Компоненты I вариант II вариант III вариант IV вариант Контроль
МС 4,4 4,4 - - 4,4
Г 5В - - 3,2 3,2 -
В1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
В5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Вб 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
2,4Д 2,0 - - 1,0 -
БАП 1,0 - - - -
НУК - 0,1 0,1 - -
Сахароза 30 60 60 30 30
Агар 7 7 7 7 7
рН 5,7 5,7 5,7 5,7 5,7
Наиболее ранние сроки начала каллусообразования были отмечены на 13-14 сутки у сортов ВНИИМК-620 и Северный, тогда как у сорта ЛМ-98 первичное каллусообразования был отмечен только на 20-21 сутки, на питательной среде МС с добавлением 0,1 НУК. Из всех трех сортов, взятых в исследование наибольший прирост каллусной массы, был определен для
сортов Северный и ВНИИМК-620 на среде МС с содержанием 0,1НУК и сахарозы. При использовании высоких концентрации сахарозы на II среде у этих сортов образовывались плотные, желтовато-зеленые каллусные массы. Тогда как у сорта ЛМ-98 на этом же варианте среды каллусные клетки были рыхлые и обводненные.
Проведенный анализ полученных в исследований результатов показал, что начало каллусообразования, прирост массы каллусной ткани, цвет и консистенция каллусов свидетельствуют о разной чувствительности сортов к гормону НУК и содержанию сахарозы в среде (рис. 1).
А Б В
ГДЕ
Рисунок 1. Каллусные культуры льна А - каллусы сорта Северный на II среде; Б - каллусы сорта ВНИИМК-620 на II среде; В - каллусы сорта ЛМ-98 на II среде; Г - каллусы сорта Северный в контроле; Д - каллусы сорта ВНИИМК-620 в контроле;
Е - каллусы сорта ЛМ-98 в контроле
Анализ данных, полученных в экспериментах с каллусными культурами показал, что максимальный прирост биомассы и образование каллусов отмечался на II варианте среды для всех 3 сортов льна (табл. 2).
Как видно из табл. 2, наибольший прирост каллусной массы был характерен для сортов Северный и ВНИИМК-620 на среде II, тогда как у сорта ЛМ-98 на этой среде прирост каллусов был относительно ниже, чем у пер-
вых двух сортов. При этом процент каллусообразования и дальнейший прирост биомассы каллусов льна культивируемых на других вариантах сред оказался значительно ниже. Для всех 3 сортов льна на контрольной МС среде без добавления фитогормонов процент каллусообразования и прирост биомассы каллуса оказался минимальным.
Таблица 2
Прирост каллусной биомассы трех сортов льна на 14 день культивирования
Наименование сортов Прирост массы каллусов,мг
I вариант II вариант III вариант IV вариант контроль
Северный 0,43 0,60 0,38 0,35 0,28
ВНИИМК-620 0,32 0,58 0,29 0,27 0,19
ЛМ-98 0,20 0,44 0,17 0,14 0,11
В ходе исследования был подобран метод стерилизации и оптимизирован метод введения в культуру in vitro 3 перспективных сортов масличного льна.
Список литературы:
1. Бредеман Г. Селекция льна // В кн. «Лен как прядильное и масличное растение». - М.; Л. Сельхозгиз, 1931. - С. 44-67.
2. Особенности селекции льна масличного // «Масложировая промышленность». - 2000. - № 3. - С. 13-15.
3. Искаков К.А. Масличные культуры на севере Казахстана (лен, яровой рапс). - Костанай, 2000. - 178 с.
5. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucane-ses in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 1968. - V 46. - Р. 417-421.
6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaccotissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V 15. - Р. 473-497.
