CC BY
1200
ТОМ 3
НОМЕР 2
АПРЕЛЬ-ИЮНЬ 2010
КЛИНИЧЕСКАЯ
О Н КОгематология
ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ
СЕМИНАР
Теломеры, теломераза, канцерогенез и мера здоровья
Е.Е. Егоров
____________________РЕФЕРАТ
В обзоре представлен широкий спектр данных о теломерах и тело-меразе. Наряду с описанием изменений теломер и теломеразной активности в процессе развития показаны роль теломер и теломеразы в процессах канцерогенеза, последствия наследуемого снижения теломеразной активности, принципы опосредованного теломеразой лечения рака. Уделено внимание недавно обнаруженным внетеломер-ным функциям теломеразы, истории присуждения Нобелевской премии 2009 г. и связи длины теломер в клетках периферической крови с развитием различных, прежде всего связанных со старением, заболеваний. Дан обзор данных о биологии теломер в стволовых клетках, а также последствия принудительной экспрессии теломеразы (тело-меризации) в клетках человека.
Ключевые слова
теломераза, теломеры, канцерогенез, лейкоз, терапия опухолей, тело-меризация, длина теломер.
Telomeres, telomerase, oncogenesis and measure of health
Y. E. Yegorov SUMMARY
Review includes broad spectrum of data concerning telomeres and telomerase. Along with description of telomere length and telomerase activity alterations in the process of development there are data about telomere and telomerase roles in the oncogenesis, the consequences of hereditary decreasing of telomerase activity, and principles of cancer treatment in the context of telomerase. Some attention paid to recent discoveries of nontelomeric functions of telomerase, the history of Nobel prize awarding in 2009 and to linkage of peripheral blood leucocytes telomere length with the development of various pathologies associated with aging. Some data are presented concerning telomere biology of stem cells and forced expression of telomerase in human cells (telomerization).
Keywords
telomerase, telomeres, oncogenesis, leucosis, cancer therapy, telomerization, telomeres length.
Engelhardt Institute of Molecular Biology, RAS, Moscow Контакты: yegorov58@mail.ru Принято в печать: 13 мая 2010 г.
ТЕЛОМЕРЫ
Теломерами называют концевые участки хромосом, образованные специфической теломерной ДНК и белками. У человека и всех позвоночных теломерная ДНК на всех хромосомах представлена в виде монотонного повтора TTAGGG, общей длиной в сотни и тысячи оснований. Теломерная ДНК большинства соматических клеток укорачивается при пролиферации клеток вследствие неполной репликации концевых участков (концевой недоре-пликации), когда новосинтезированная копия оказывается короче оригинала. Короткие (однако содержащие несколько тысяч оснований ДНК) теломеры вызывают явление репликативного старения, когда пролиферация клеток останавливается и клетка надолго переходит в неделящееся состояние.
Теломерная ДНК замыкается в кольцо и таким образом получает конформацию, отличающую ее от обрыва хромосомы. Это объясняет также, почему репликативное старение клеток начинается при достаточно большой длине теломерного повтора. Учитывая определенную гибкость ДНК, при укорочении теломер свыше некой критической величины образование кольца становится невозможным (рис. 1).
Теломерная ДНК вместе с тело-мерсвязывающими белками может формировать петли. В силу ограничения свободного вращения ДНК и взаимодействия с разнообразными белками ДНК в петле имеет напряженную конформацию. При укорочении теломерной ДНК наступает момент, когда длина теломерного повтора не позволяет образоваться петле. Теломерный конец ДНК приобретает свободную конформацию, которая воспринимается клет-
Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва
184
Теломеры и теломераза
Рис. 1. Гипотеза петлевого строения теломер (по Е. Егорову и др. [1] с изменениями)
кой как сигнал повреждения. В результате запускается механизм репликативного старения клеток.
Если клетка снижает контроль за конформацией ДНК (например, допускает наличие разрывов), то отрицательные сигналы, идущие от «неправильной» (непетлевой) теломеры, не учитываются и клетка может пролиферировать дальше. Репликативное старение отменяется, или даже клетка теряет к нему способность. В этом случае, поскольку недо-репликация продолжается, возможна лишь ограниченная пролиферация, в пределах нескольких десятков делений.
Такой сюжет может развиваться при заражении клетки онкогенными вирусами. Продолжающаяся недорепликация «съедает» остатки теломер, начинаются потери существенного генетического материала, и клетки в основной своей массе гибнут. Наблюдается так называемое состояние кризиса, когда, несмотря на непрекращающуюся митотическую активность, клеточная популяция не растет. Это состояние объясняется тем, что недорепликация укорачивает теломеры лишь в одной из дочерних клеток, а исходная клетка, имеющая полную последовательность, повторно вступает в деление.
Особый интерес в структуре теломер представляет их самая дистальная часть. Двойная спираль ДНК не доходит до самого конца, 5'-цепь обрывается, и остается одноцепочечный G-богатый участок. Длина одноцепочечного З'-конца у человека составляет 100—150 нуклеотидов [2]. Для образования теломерной петли свободный З'-конец ДНК в комплексе с белками вступает во взаимодействие с двойной спиралью теломерной ДНК. Белки, связывающиеся вдоль повторяющегося тракта теломерной ДНК, присоединяют дополнительные белки и формируют нуклеопротеиновый комплекс высокого порядка, который получил название шелте-рин [З].
В регуляции длины теломер участвует множество факторов. Помимо комплекса разнообразных белков, взаимодействующих с теломерами, необходимо упомянуть различные эпигенетические механизмы (метилирование ДНК
и гистонов, ацетилирование гистонов), а также транскрипцию теломерной ДНК. Продукт гена MLL, который часто перестраивается при лейкозах, ассоциирован с теломерами и регулирует транскрипцию теломерной ДНК [4].
В заключение этого раздела можно уверенно сказать, что регуляция длины теломер, по большому счету, до сих пор составляет тайну, несмотря на сотни исследований на эту тему.
ТЕЛОМЕРАЗА
В бессмертных клетках (делящихся предшественниках половых клеток, в ряде стволовых и в раковых клетках) работает фермент, противостоящий концевой недорепликации ДНК. Он удлиняет теломеры, и его называют теломераза. Основу фермента составляют два компонента: РНК-компонент и белковая часть. Известно, что РНК-компонент теломера-зы (hTR, human telomerase RNA) синтезируется в большинстве клеток человека независимо от теломеразной активности. Для гена белковой субъединицы теломеразы с 1998 г. принято обозначение hTERT (human telomerase reverse transcriptase).
Внутри РНК-компонента теломеразы имеется короткий район, который служит матрицей для синтеза теломерной ДНК. Таким образом, с химической точки зрения теломера-за является обратной транскриптазой, а ингибиторы обратной транскриптазы, применяемые для борьбы с вирусными инфекциями, могут подавлять ее функцию [5].
Механизм работы теломеразы — это повторное копирование матрицы, включающее этап связывания фермента с теломерной ДНК, этап элонгации, когда дезокси-рибонуклеотиды последовательно добавляются к З'-концу G-богатой цепи теломеры, и этап транслокации фермента на конец новообразованной цепи (рис. 2). Активно работающий фермент из клеток человека представляет собой димер.
Рис. 2. Этапы работы теломеразы
www.medprint.ru
185
Е. Е. Егоров
НОБЕЛЕВСКОЙ ПРЕМИИ 2009 г.
В прошлом году за исследование теломер и теломеразы трем американским ученым была присуждена Нобелевская премия. В России было много разговоров на эту тему, связанных с недооценкой роли А. М. Оловникова в открытии теломеразы. Автору представляется целесообразным уделить некоторое внимание истории этого вопроса.
Если бросить ретроспективный взгляд на развитие науки о теломерах и теломеразе, то, безусловно, можно выделить двух человек, вклад которых в развитие этой области недооценен. Это Л. Хейфлик и А. М. Оловников. Работа Л. Хейфли-ка 1961 г. [6], одна из самых цитируемых в биологии, помимо всего прочего и прежде всего пробудила творческую энергию многих ученых для попыток объяснить, каким образом клетки подсчитывают свои деления. Л. Хейфлику с трудом удалось опубликовать результаты, показывающие, что клетки человека делятся в культуре лишь ограниченное число раз. В общественном мнении того времени господствовало убеждение, что в руках умелого исследователя клетки бессмертны.
Статья получила большой общественный резонанс. Возникло и вошло в словари понятие «предел Хейфлика». Основную роль в процессе «заинтересовывания» широких масс сыграла не сама статья, а ее бесчисленные комментарии, упростившие результаты до пресловутых 50 делений, свойственных клеткам человека, хотя непосредственно в статье были приведены многочисленные данные о количестве удвоений популяции клеток человека, варьирующие от 30 до 70. Автор данной работы помнит, как в начале 1970-х годов впервые познакомился с работой Л. Хейфлика на последней странице газеты «За рубежом».
Известную работу А. М. Оловникова 1971 г. [7] можно оценивать прежде всего как ответ на работу Л. Хейфлика. А. М. Оловников объяснил, как работает счетчик делений. В этой работе было совершенно гениально предсказано, что при матричном синтезе линейного полинуклеотида (репликации хромосомы) копия должна быть короче и с этим связа-
но ограничение количества клеточных делений. Также было предсказано существование специального фермента, удлиняющего концы хромосом в бессмертных клетках.
Исследования Э. Блэкберн, К. Грейдер и Д. Шостака, которые удостоились Нобелевской премии, поначалу были разнонаправленными и объясняли различные феномены. Э. Блэкберн, изучая последовательности на концах хромосом, предполагала, что странные теломерные последовательности, возможно, имеют какой-то особый механизм репликации, который и был открыт (при участии К. Грейдер) в 1984 г. Д. Шостак в сотрудничестве с Э. Блэкберн фактически нашли молекулярные подтверждения идей Г. Меллера и Б. Макклинток 1938 г. о необходимости теломер для стабилизации хромосом.
Только в 1988 г., когда идея А. М. Оловникова соединилась с находками Блэкберн—Грейдер, начался стремительный рывок в этом направлении науки. Сами нобелевские лауреаты Э. Блэкберн и К. Грейдер так описывают эти события: «Мы не знали об идеях Оловникова до 1988 г., когда Кальвин Харли рассказал о них Грейдер. Заинтригованные, Грейдер, Харли и их коллеги решили посмотреть, а происходит ли со временем укорочение хромосом в клетках человека» [8].
В 1989 г. обнаружено укорочение теломер у человека; в 1990 г., прежде всего для изучения теломеразы, была создана корпорация «Герон» (Geron), объединившая очень многих первоклассных ученых. В 1994 г. в корпорации был разработан чувствительный метод для детекции теломераз-ной активности, в 1998 г. было доказано, что принудительная экспрессия теломеразы ведет к иммортализации клеток.
Таким образом, помимо гениального предвидения 1971 г., якобы оставшегося на страницах никому не интересных журналов, можно утверждать, что идеи А. М. Олов-никова непосредственно участвовали во всемирном научном процессе (рис. 3), давшем прекрасный результат, достойный Нобелевской премии. И эти факты должны оставаться в истории науки.
1961 Хейфлик
\
В пику всем (прежде всего Каррелю) показал, что в его руках клетки растут “плохо".
Доказал существование счетчика делений.
1938 Меллер + Макклинток
1971 Оловников
Под влиянием Хейфлика придумал механизм работы счетчика (маргинотомия)
+ специальный фермент.
1972 Уотсон
Постановка проблемы кедорепликации
1982 Шостак
1984
Блэкберн + асп. Грейдер
\
Под влиянием Уотсона обнаружили странную активность (терминальной (экзо) дезоксинуклеоти дилтрансфераэы) В клетках странного объекта (Тетрахимена),
1988
ХарЛИ “► Соединил идею Оловникова и открытие Блэкберн+Грейдер.
Началась большая гонка за бессмертием.
Кук Открьт изменение длины теломер человека в развитии Морин Открыл теломераэу у человека
Создана корпорация Терон
Под влиянием Блэкберн доказал на молекулярном уровне, идею Меллера и Макклинток о том, что тел ом еры необходимы для стабилизации хромосом
1998 Райт
(асп. Хейфлика)
Один из соавторов работы по иммортализации при помощи введения гена теломеразы
Рис. 3. Взаимосвязь открытий в области теломер и теломеразы 186
Клиническая онкогематология
Теломеры и теломераза
ALT - АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СПОСОБЫ УДЛИНЕНИЯ ТЕЛОМЕР У ЧЕЛОВЕКА
Не все бессмертные клетки обладают теломеразной активностью. Существуют и другие способы поддержания длины теломер. Их обычно называют альтернативными способами удлинения теломер (ALT — alternative lengthening of telomeres). Считается, что примерно в 10 % опухолей теломеры поддерживаются без участия теломеразы. Механизм ALT основан на генетической рекомбинации [9]. Вероятно, существует несколько вариантов ALT.
Опухоли разного происхождения имеют различную вероятность возникновения ALT, и само по себе наличие или отсутствие ALT могут иметь различное прогностическое значение. Чаще всего ALT возникает (активируется) в опухолях нейроэпителиального (астроцитомы) и мезенхимального происхождения (остеосаркомы). В злокачественных гистиоцитомах частоту ALT оценивают в 77 % [10].
Механизмы ALT могут работать не только при канцерогенезе, но и участвовать в удлинении теломер соматических клеток, а также определять удлинение теломер в раннем эмбриогенезе. Недавно было показано, что на ранних стадиях развития (в период от ооцита до бластоцисты) у человека и мыши происходит значительное удлинение теломер (на несколько тысяч нуклеотидов). Только частично это удлинение можно объяснить деятельностью теломеразы. Оно происходит и в партеногенетически развивающихся ооцитах, и у мышей, лишенных теломеразной активности [11].
Удлинение теломер на этапе дробления — необходимое событие, поскольку длина теломер в ооцитах человека иногда составляет около 7 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) [12], что значительно меньше, чем длина теломер в большинстве соматических тканей. Интересно, что длина теломер в ооците является величиной, определяющей возможность наступления беременности при экстракорпоральном оплодотворении. Когда средняя длина теломер уменьшается до менее 6,32 т.п.н., беременность невозможна [12].
Удлинение теломер на этапе дробления совпадает по времени с резким падением уровня метилирования ДНК. Следует отметить, что на стадии бластоцисты устанавливается длина теломер, необходимая для всего дальнейшего развития, в т. ч. в процессе клонирования организма из соматических клеток [13].
ИЗМЕНЕНИЯ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
Соматические клетки в основном лишены теломеразной активности. Их теломеры укорачиваются как в процессе онтогенеза, так и при культивировании клеток in vitro. Тело-меразная активность (если она есть в клетках) обычно не успевает уменьшиться на протяжении клеточного цикла, поскольку время полураспада теломеразы близко к 24 ч. При выходе клеток из клеточного цикла теломеразная активность постепенно падает и через несколько дней не определяется. При дифференцировке клеток может происходить быстрое снижение теломеразной активности. Скорее всего, теломераза в каждом клеточном цикле работает только на части теломер, преимущественно коротких [14].
Теломеразная активность имеется в делящихся клетках половой линии человека и в развивающихся эмбриональных тканях. Однако на стадии от зиготы до морулы теломеразная активность у человека и мыши незначительна. Теломераза экспрессируется на высоком уровне, начиная со стадии бластоцисты, и найдена во всех тканях плода человека в течение I триместра беременности. Далее теломеразная активность сохраняется в ряде тканей эмбриона (печень, кишечник, лег-
кие, кожа, мышцы, надпочечники и почки), но исчезает после 16 нед. беременности в мозге и костях, несмотря на продолжающиеся активные клеточные деления в этих тканях.
В некоторых случаях довольно высокая теломеразная активность может сохраняться в обычных соматических клетках. Недавно было показано, что мезотелиальные клетки человека обладают ею [15]. При этом клетки содержат довольно короткие теломеры (средняя длина около 3,5 т.п.н.) и обладают очень малым пролиферативным потенциалом в культуре. После нескольких удвоений популяции теломе-разная активность в клетках исчезает. Примечательно, что в клетках этих стареющих культур длина теломер несколько больше, чем при начале культивирования. Также особенностью этих клеток служит нарушенная функция митохондрий, проявляющаяся в снижении мембранного потенциала и увеличении продукции активных форм кислорода (АФК), повреждающих ДНК.
Хотя теломераза репрессируется в большинстве тканей в процессе развития, многие стволовые клетки во взрослом организме человека коммитированы к теломеразной активности, т. е. теломеразная активность в них появляется после стимуляции пролиферации. Уровень этой теломеразной активности, видимо, недостаточен для предотвращения укорочения теломер, поскольку теломеры потомков стволовых клеток укорачиваются с возрастом человека.
ВНЕТЕЛОМЕРНЫЕ ФУНКЦИИ ТЕЛОМЕРАЗЫ
В последние несколько лет стало ясно, что теломераза обладает рядом совершенно не связанных с теломерами функций. Многие данные, накапливающиеся ранее, с трудом находили объяснение в традиционных рамках. Теперь очевидно, что теломераза способна влиять (в обе стороны) на процесс запуска апоптоза посредством прямого взаимодействия с митохондриями. Более того, вероятно, что теломера-за во взаимодействии с митохондриями может регулировать продукцию АФК в клетках.
В 2004 г. обнаружили, что белок hTERT имеет на N-конце лидирующую последовательность для транспорта в митохондрии, состоящую из 20 аминокислот и имеющую также сайт разрезания, который срабатывает при импорте белка в митохондрии. Было показано, что эта последовательность присуща белковым компонентам теломераз только высших эукариот [16].
Требуется время, чтобы разрешить вопрос о возможном анти- или проапоптозном действии теломеразы. На данный момент доминируют работы, демонстрирующие защитное (антиапоптозное) действие теломеразы на уровне модификации митохондриальных функций. За последние годы разными авторами показано, что теломераза предотвращает зависимый от митохондрий апоптоз посредством взаимодействия с белками семейства BCL-2 [17—19].
Учитывая митохондриальную локализацию теломера-зы, можно по-новому взглянуть на работу [20], показавшую, что экспрессия TERT способна увеличивать потенциал митохондриальных мембран и кальций-аккумулирующую способность митохондрий, тем самым уменьшая зону ишемического повреждения в мозге.
Видимо, истинная роль теломеразы более сложная, чем это казалось в 90-е годы прошлого века. Несмотря на сильное пролиферативное влияние теломеразы, позволяющее клеткам становиться бессмертными, теломеризованные фибробласты отличаются от исходных ослабленной способностью к колониеобразованию [21], что явно свидетельствует о каких-то изменениях на уровне чувствительности клеток к факторам роста.
www.medprint.ru
187
Е. Е. Егоров
Возможным объяснением полученных результатов может быть вызванное теломеразой изменение редокс-регуляции в клетке. Редокс-регуляция (изменение вероятностей прохождения окислительно-восстановительных реакций) является давно известной, но по большому счету независимо существующей областью биологии. В нашем случае достаточно подчеркнуть, что прохождение в клетке любого сигнала от фактора роста зависит от окислительновосстановительных реакций. Поэтому избыточное окисле -ние или восстановление среды в клетках способны усилить, ослабить или вовсе отменить действие цитокина.
В теломеризованных клетках снижено содержание АФК
[22] и уменьшена экспрессия обеих форм супероксиддис-мутаз (ферментов, инактивирующих супероксид-анион — один из видов АФК) [23]. Поскольку основным источником АФК в клетках служат митохондрии, можно предположить, что теломераза уменьшает продукцию АФК в митохондриях и тем самым восстанавливает внутриклеточную среду, что должно уменьшать чувствительность клеток к факторам роста и способствовать сохранности генетического материала. Область редокс-регуляции выходит далеко за рамки данной работы. Заинтересованному читателю можно предложить следующие обзоры [24—26].
ОСОБЕННОСТИ ТЕЛОМЕРНОЙ БИОЛОГИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Большинство стволовых клеток человека характеризуется довольно медленным темпом пролиферации. Математическое моделирование оценило скорость деления гемопоэтических стволовых клеток как одно деление за 1—2 года [27]. В промежутках между делениями клетки пребывают в пролиферативном покое. В этом состоянии теломеразная активность отсутствует, появляясь на короткое время при стимуляции пролиферации. Однако, даже если принять эти оценки интенсивности пролиферации, ясно, что стволовые клетки должны иметь пролиферативный потенциал заведомо больший, чем предел Хейфлика.
Теломеры стволовых клеток человека укорачиваются, несмотря на индуцируемую теломеразу (табл. 1). При определенных допущениях репликативную историю гемопоэтических стволовых клеток можно проследить, измеряя длину теломер в лейкоцитах периферической крови. Известно, что скорость укорочения теломер в гранулоцитах и лимфоцитах взрослого человека составляет примерно 39 и 59 пар оснований в год [28]. При этом в первые 2 года жизни потери существенно выше и достигают 1000—3000 пар оснований в год, что может отражать экспансию стволовых клеток в растущем организме. С возрастом (после 60 лет) потери ДНК снова возрастают [29], что можно объяснить снижением числа стволовых клеток, ухудшением их антиоксидантной защиты или увеличением окислительного стресса в тканях.
Таблица 1. Теломеры и теломераза в стволовых клетках человека [30]
Тип клеток Пролиферация Теломеразная активность Теломеры
Эмбриональные Неограниченная Высокая Поддерживаются
Гемопоэтические Ограничена Низкая Укорачиваются
Мезенхимные Ограничена Низкая или отсутствует Укорачиваются
Эпидермис Ограничена Низкая Укорачиваются
Волосяной фолликул Ограничена Низкая Укорачиваются
Крипта кишечника Ограничена Низкая Укорачиваются
Нервные Ограничена Низкая Укорачиваются
Панкреатические Ограничена Нет Укорачиваются
Печени Ограничена Низкая Укорачиваются
Раковые Неограниченная Высокая Поддерживаются
Наиболее ярко укорочение теломер проявляется при пересадках костного мозга. Наблюдают обратную корреляцию между количеством пересаженных мононуклеарных клеток и степенью укорочения теломер. Пересадка костного мозга приводит к укорочению, эквивалентному периоду 15 лет жизни. Описан ряд неудачных трансплантаций, сопровождающихся очень сильным укорочением теломер [31]. Донорство может удалять из организма количество клеток, эквивалентное нескольким годам нормального гемопоэза. При этом, однако, не наблюдают каких-либо достоверных изменений длины теломер [32].
Лимфоидные клетки способны к очень интенсивному клональному размножению при антигенной стимуляции. Несмотря на индукцию теломеразы, в них происходит более значительное укорочение теломер по сравнению с гранулоцитами. Соответственно клетки памяти имеют значительно более короткие теломеры, чем наивные лимфоциты [33].
Существует много нерешенных вопросов в теломерной биологии стволовых клеток. По-видимому, различные стволовые клетки взрослого организма весьма различаются по роли теломер и теломеразы в поддержании пролиферации. Рассмотрим для примера самые изученные стволовые клетки. Это гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и мезенхимные стволовые клетки из костного мозга человека (МСК).
МСК не обладают определяемой теломеразной активностью. Также в них не найдены признаки альтернативных механизмов поддержания длины теломер [34]. Их теломеры укорачиваются in vivo и in vitro. МСК в культуре сохраняют нормальный кариотип и обычно не подвержены кризису, т. е. по мере укорочения теломер переходят в состояние репликативного старения. Они способны к дифференцировкам на любой стадии культивирования. Особенность этих клеток заключается в очень большой гетерогенности по пролиферативному потенциалу. По этому признаку среди здоровых нестарых лиц существуют десятикратные различия [34].
ГСК обладают теломеразной активностью, которая может быть еще более стимулирована различными цитокинами. Однако теломеры ГСК укорачиваются in vivo и in vitro [35]. Потомки ГСК Т-лимфоциты обладают теломеразной активностью, но их теломеры также укорачиваются. ГСК с более длинными теломерами имеют репликативное преимущество при трансплантациях [36]. По не совсем понятным причинам повышенная теломеразная активность не способна увеличить репликативные возможности этих клеток [35] в отличие от МСК.
ПРИНУДИТЕЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ТЕЛОМЕРАЗЫ (ТЕЛОМЕРИЗАЦИЯ КЛЕТОК)
Наиболее ярко особенности различных клеток относительно зависимости от теломер и теломеразной активности проявляются после принудительной экспрессии гена hTERT, так называемой теломеризации.
Уже давно известно, что РНК-компонент теломеразы экспрессируется в большинстве клеток человека независимо от теломеразной активности, поэтому после трансфекции клеток человека геном hTERT в них появляется теломеразная активность. Клетки получают способность поддерживать длину теломер. Такие клетки стали называть теломеризован-ными. Всевозможные тесты показали, что теломеризован-ные клетки не приобретают свойств злокачественных клеток [37]. Само по себе наличие теломеразной активности не нарушает механизмы регуляции роста клеток. Теломераза при этом способствует стабильности генома, предотвращая хромосомные перестройки.
188
Клиническая онкогематология
Теломеры и теломераза
Теломеризация фибробластов не только иммортализу-ет клетки, но и меняет экспрессию ряда генов, не связанных прямо с клеточным циклом. Было показано, что в теломери-зованных фибробластах независимо от срока их пребывания в культуре может восстанавливаться экспрессия генов, специфичных для молодых клеток. Бывают и другие результаты. Исследователи не знают механизма изменения экспрессии генов при теломеризации. Рассматриваются три основные возможности: влияние длины теломер, непосредственное влияние теломеразы и взаимодействие теломера-зы с митохондриями.
Теломеризация фибробластов ведет к снижению в клетках уровня АФК [22]. Вероятно, это связано с изменениями митохондрий, которые служат основными источниками АФК в клетке. В теломеризованных клетках снижается их число и повышается мембранный потенциал митохондрий. Эти изменения могут быть обусловлены как селекцией в процессе становления бессмертных клеток, так и прямым влиянием теломеразы на митохондрии.
Довольно интересный результат был получен после введения гена hTERT в клетки пациента, страдающего болезнью Ниманна—Пика. Это разновидность наследственного липидоза, при котором нарушается транспорт холестерина и гликосфинголипидов из лизосом. Экспрессия hTERT приводила к нормализации клеточного фенотипа. Эффект ускорения транспорта малых молекул из лизосом при экспрессии hTERT имеет место и в нормальных клетках [38].
В противоположность скелетным миобластам гладкомышечные клетки человека легко поддаются имморта-лизации с помощью введения гена hTERT [39]. Клетки ми-ометрия после иммортализации сохраняют большинство маркеров дифференцировки. C помощью теломеризованных гладкомышечных клеток были созданы аналоги мелких кровеносных сосудов [40], затем и достаточно крупные сосуды (диаметром 3 мм, длиной 5 см) [41]. Клетки сохраняли кари-ологическую стабильность, не вызывали роста опухоли у иммунодефицитных мышей.
ТЕЛОМЕРИЗАЦИЯ РАЗЛИЧНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ
Было показано, что теломеризация усиливает остеогенный потенциал МСК человека [42]. При трансплантации тело-меризованных МСК образование кости шло быстрее, а эксплантат содержал большее количество клеток [43]. Были получены бессмертные теломеризованные МСК человека, которые поддерживали гемопоэз значительно лучше первичных клеток [44], хотя по этому признаку наблюдали большую гетерогенность среди клонов. Свойства теломеризованных МСК сохраняются при длительной пролиферации, вплоть до 290 удвоений популяции [45]. Показано сохранение поверхностных маркеров и способности к дифференцировке в производные мезодермы вплоть до уровня 417 удвоений популяции [46]. При этом в течение 3 лет сохранялась постоянная скорость пролиферации клеток, зависящая от плотности посева: чем ниже плотность посева, тем выше скорость пролиферации.
Стромальные клетки из липоаспирата по своему диф-ференцировочному потенциалу напоминают МСК. Их теломеризация приводит к иммортализации с сохранением или даже усилением, как и в случае МСК, способности к остеогенной дифференцировке [47, 48]. Неудачей закончилась попытка иммортализации с помощью введения hTERT гемопоэтических (CD34 + ) предшественников из пуповинной крови человека. Иммортализации удалось достичь только при совместном введении hTERT, E6 и E7 онкогенов вируса па-
пилломы человека 16-го типа [49]. Мезенхимные стволовые клетки из пуповинной крови были успешно иммортализова-ны введением только hTERT. Клетки при этом сохраняли все свои свойства [50].
Успехом увенчались попытки иммортализовать эмбриональные предшественники нервных клеток человека из спинного мозга [51] и из субвентрикулярной области [52]. В обоих случаях клетки были способны к разнонаправленной (глиальной и нейрональной) дифференцировке. При этом клетки из спинного мозга были способны созревать до электрофизиологической компетентности и при пересадке в пораженный спинной мозг крыс (в условиях иммуносупрессии) выживать до 6 мес., экспрессируя синаптические белки и медиаторы.
Нами также была получена бессмертная культура нервных стволовых клеток человека [53]. Клетки годами сохраняют скорость роста, способность к дифференцировке, способность образовывать нейросферы, в них синтезируются специфические РНК и белки, сохраняется диплоидный кариотип.
Экспансия ^-клеток островков Лангерганса в культуре ограничена примерно 10—15 удвоениями. За это время клетки приобретают стареющую морфологию, в них возрастает экспрессия ингибитора пролиферации р 16, укорачиваются теломеры и появляется экспрессия ^3-галактозидазы — типичного маркера стареющих клеток. Введение гена hTERT, хотя и вызывает появление теломеразной активности, но не способно увеличить пролиферативный потенциал клеток [54].
Используя специальную самовырезающуюся конструкцию в ^-клетки человека были последовательно введены два гена, кодирующие большой антиген вируса SV40 и hTERT. Как и следовало ожидать, трансфецированные клетки обладали хорошей способностью к росту. Эти клетки были проверены на склонность к злокачественному перерождению и экспрессию специфических генов, связанных с регулированием продукции инсулина. Из 271 клона был выбран один, который удовлетворял всем критериям. В клетки этого клона с помощью вирусной трансфекции был введен ген Cre-рекомбиназы и выполнено вырезание введенных генов. Полученные таким образом клетки оказались способными при введении иммунодефицитным мышам с искусственно индуцированным диабетом поддерживать нормальный уровень глюкозы крови в течение 30 нед. [55].
Подобным же образом были созданы культуры, содержащие большое количество фенотипически молодых и небессмертных клеток печени, способных выполнять свои функции в организме [56], эндотелиальных клеток [57] и клеток печеночного эндотелия [58].
НАСЛЕДСТВЕННОЕ СНИЖЕНИЕ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
Существует ряд заболеваний человека, связанных со снижением теломеразной активности и изначальным укорочением теломер в клетках половой линии в результате мутаций hTR, hTERT или белков, с ними взаимодействующих [59].
При этом сходные (с нашей точки зрения) нарушения теломерного гомеостаза способны вызывать различные патологии в разных органах. Причина этого, видимо, кроется в тканеспецифических различиях экспрессии теломеразы и особенностях поддержания клеточного гомеостаза, разных вредных факторах среды и, возможно, в каких-то нетеломерных функциях теломеразы. В какой-то степени эти нарушения можно считать вариантами сегментарных (частичных) прогерий.
Общим в патогенезе является уменьшение длины теломер (рис. 4) за счет снижения теломеразной активности,
www.medprint.ru
189
Е. Е. Егоров
Рис. 4. Длина теломер лейкоцитов периферической крови человека как функция возраста. Мелкие серые значки — здоровые лица, крупные значки — пациенты и их родственники с мутациями гена hTERT или без мутаций [61]
которое проявляется рядом признаков, связанных прежде всего с повышенным риском развития опухолей, фиброзов и гипоплазий [60]. В ряду поколений наблюдают антиципацию признаков.
Впервые диагноз наследственного дискератоза был поставлен в 1910 г. двум братьям, которые имели триаду признаков: дистрофия концевых фаланг пальцев, ненормальная пигментация кожи шеи и лейкоплакия в ротовой полости (рис. 5). С тех пор описано более 500 случаев [62].
Формально среди признаков наследственного дискера-тоза должны наблюдаться по крайней мере два из триады. В добавление к этому у больных встречаются самые разнообразные нарушения: аплазия костного мозга, миелодиспла-стический синдром, лейкоз, рак кожи, эпифора в результате стеноза носослезного канала, блефарит, преждевременное поседение, алопеция, задержка развития, низкий рост, гипоплазия мозжечка, микроцефалия, стеноз пищевода, стеноз уретры, легочный фиброз, фиброз печени, гипогонадизм и аваскулярный некроз шейки бедренной или плечевой кости. По способу наследования различают три вида этой патологии [63]. Известны мутации шести генов, ведущих к развитию наследственного дискератоза: DKC1, TERC, TERT, T1NF2, NOLA2 и NOLA3 [64].
В 50 % случаев постановки клинического диагноза мутации этих генов не находят. Таким образом, наследственным дискератозом в настоящее время называют большую группу различных заболеваний, объединенную прежде всего впервые описанными клиническими признаками.
При исследовании случаев идиопатического легочного фиброза часто находят мутации генов hTERT и hTR. Этиология этих болезней может состоять в уменьшении теломер, которое ведет к ускоренному старению легочной ткани как
ткани, подвергаемой постоянному вредному воздействию окружающей среды. Болезнь проявляется сравнительно поздно (после 50 лет) и характеризуется фокальными поражениями. Предполагают, что в патогенезе участвует окислительный стресс [65, 66].
Аналогично легочному фиброзу описаны теломерно-теломеразные нарушения, ведущие к фиброзу печени, часто без нарушений в костном мозге [61].
Этиология приобретенной апластической анемии в большинстве случаев неизвестна, однако ясно, что основным звеном патогенеза является нарушение гомеостаза стволовых клеток или клеток-предшественников. Болезнь может быть следствием аутоиммунного поражения стволовых клеток или предшественников. При иммуносупрессии наблюдается гематологическое восстановление, но при сниженном числе стволовых клеток [67].
При апластической анемии общее уменьшение количества клеток сопровождается также укорочением теломер [68]. Описаны случаи апластических анемий с мутациями генов hTR и hTERT [69].
АКТИВАЦИЯ ТЕЛОМЕРАЗЫ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ
Все варианты развития опухоли можно разделить на два больших класса в отношении стадии, на которой происходит активация теломеразы. Первый вариант, особенно свойственный лейкозам, состоит в том, что теломеразная активность может присутствовать в клетках с самого начала. Другой вариант заключается в том, что клетка-предшественник раковой опухоли не обладает теломеразной активностью, а обретает ее в ходе опухолевой прогрессии.
Частота спонтанной реактивации теломеразы в фибробластах человека чрезвычайно низка. Все воспроизводимые случаи иммортализации фибробластов человека в культуре происходят после того, как клетки преодолеют механизм репликативного старения, пройдут дополнительные раунды репликации и связанное с этим чрезмерное укорочение теломер. Возможной причиной увеличения вероятности реактивации теломеразы при чрезмерном укорочении теломер служит резкое увеличение генетической нестабильности хромосом с короткими теломерами [70—72].
На рис. 6 представлена типичная последовательность событий, происходящих при развитии рака кишечника.
Видно, что активация теломеразы не является ранним событием, а возникает на стадии, когда теломеразная активность действительно становится необходима для пролиферации раковых клеток. Увеличение надежности репрессии те-ломеразы в соматических клетках должно резко уменьшать вероятность развития уже появившейся ранней опухоли.
В последние годы появляется все больше информации о раковых стволовых клетках. В отношении теломера-
Рис. 5. Триада признаков наследственного дискератоза [64] 190
Клиническая онкогематология
Теломеры и теломераза
Рис. 6. Типичная последовательность событий при развитии рака кишечника [73]
зы и понимания путей возникновения опухоли необходимо различать два варианта событий. Для ряда случаев (многие лейкозы) строго доказано происхождение опухоли из стволовой клетки. Сценарий развития такой опухоли начинается с нарушения регуляции стволовой клетки, обладающей те-ломеразной активностью. В дальнейшем у таких клеток сохраняется большой запас пролиферативного потенциала, достаточный для приобретения различных злокачественных признаков. Вероятно, похожие пути развития свойственны и другим опухолям, в частности опухолям мозга и некоторым солидным [74].
В последнее десятилетие стало окончательно ясно, что многие клетки организма способны к дедифференцировке и даже к трансдифференцировке. Поэтому обнаруживаемые в опухолях признаки стволовых клеток могут быть вторичными и не являться доказательством происхождения опухоли из стволовых клеток.
Теломеразная активность различных опухолей
Поскольку клетки примерно 90 % опухолей человека обладают теломеразной активностью, можно утверждать, что теломеразная активность — наиболее общий маркер рака и реактивация теломеразы участвует в онкогенезе. Важно осознавать, что теломераза не является причинным фактором в канцерогенезе, а лишь позволяет опухолевым клеткам достигать поздних злокачественных стадий.
Прежде всего стоит отметить, что в большинстве случаев теломеразная активность растет по мере развития опухоли (табл. 2). Корреляция теломеразной активности со злокачественностью показана при раке желудка и толстой кишки, раке печени, опухолях простаты, почек и кожи [75].
Таблица 2. Рост теломеразной активности по мере прогрессирования опухоли [76]
Случаи обнаружения теломеразной
Вид ткани активности В среднем
Нормальная ткань, прилежащая к опухоли 367 из 2350 15,5 % (0-100)
Преинвазивные опухоли 410 из 1391 29,5 % (0-67)
Злокачественные опухоли 3615 из 4304 84 %(9-100)
Доля опухолей, обладающих теломеразной активностью, зависит от типа клеток (табл. 3). Например, теломеразной активностью обладает около 10 % анапластических
астроцитом, 75 % глиобластом и 100 % олигодендроглиом, 93 % случаев рака молочной железы, 80 % рака легких. При мелкоклеточном раке легкого в 100 % случаев обнаруживают высокую теломеразную активность [75].
Таблица 3. Теломеразная активность опухолей различного происхождения [76]
Локализация опухоли Ежегодная смертность Случаи обнаружения теломеразной активности
Респираторный тракт 165 600 431 из 541 (80 %)
Желудочно-кишечный тракт 130 000 1136 из 1330 (85 %)
Репродуктивная система 66 900 709 из 801 (89 %)
Кроветворная система 59 200 117 из 157 (75 %)
Молочная железа 43 900 777 из 896 (87 %)
Выделительная система 24 700 392 из 443 (89 %)
ТЕЛОМЕРАЗА И ТЕЛОМЕРЫ В ОНКОГЕМАТОЛОГИИ
Многие нормальные клетки крови и костного мозга обладают теломеразной активностью, что затрудняет интерпретацию результатов ее измерения при онкогематологических заболеваниях. Уровень теломеразной активности зависит от возраста пациента — с возрастом она уменьшается. Стоит подчеркнуть, что современный способ измерения теломе-разной активности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) не вполне количественный. Он не позволяет зафиксировать различия в 2 раза (а только в несколько раз). При этом нельзя узнать, обусловлена ли эта активность малым количеством клеток с большой активностью или большим количеством клеток — с малой. Поскольку в измерении участвует ПЦР, осуществляемая с одинаковой последовательностью ДНК, возможны ложноположительные результаты. Кроме того, теломеразная активность клеток зависит от их пролиферативного состояния, при переходе в состояние покоя или при индукции дифференцировки теломеразная активность может значительно снижаться [77].
В силу перечисленных выше трудностей теломеразную активность определяют вместе с измерением длины теломер. Комбинация двух тестов (теломеразная активность и длина теломер) значительно более информативна. Длину теломер измеряют с помощью Саузерн-анализа как длину концевых рестрикционных фрагментов либо проводят количественную флюоресцентную гибридизацию in situ. В последнее время для оценки средней длины теломер стали применять мето-
www.medprint.ru
191
Е. Е. Егоров
А
с
Рис. 7. (А) Теломеразная активность и длина теломер у здоровых лиц и пациентов в разных фазах острого лейкоза. (Б) Кривые выживания пациентов с острым лейкозом в зависимости от теломеразной активности [87]
дики количественной ПЦР в реальном времени либо анализ гибридизации клеток в потоке.
Гематологические неоплазии на начальной стадии можно рассматривать как случай усиленной пролиферации клеток. Длина теломер уменьшается при пролиферации клеток in vivo, что находит свое отражение в уменьшении длины теломер с возрастом. Существуют формулы для расчета длины теломер с поправкой на возраст пациента [78]. Длина теломер мононуклеарных клеток крови очень мало отличается от таковой в костном мозге [79].
Уменьшение длины теломер ниже критической ведет к дестабилизации теломер, появляются теломерные слияния, образуются дицентрики, начинает работать механизм слияние—мост—разрыв, который генерирует клетки с новым кариотипом. Генетическая изменчивость многократно возрастает, повышается вероятность образования более злокачественных и устойчивых к терапии клеток. Поскольку в клинической практике мы имеем дело с результатом клональной селекции неопластических клеток, а дицентрики плохо выживают, их количество кажется заниженным [80].
Острые лейкозы
В большинстве случаев при острых лейкозах происходит уменьшение длины теломер как результат усиленной пролиферации. Теломеразная активность и длина теломер обратно пропорциональны друг другу. При рецидиве теломеразная активность достигает высших значений при минимальной длине теломер. Во время ремиссии теломеразная активность снижается и наблюдают нормализацию длины теломер [81].
В некоторых случаях острых лейкозов не происходит укорочения теломер из-за сильной индукции теломеразы. 70—86 % пациентов с острым лейкозом имеют повышенную теломеразную активность в момент постановки диагноза [82]. Высокая теломеразная активность обычно наблюдается у пациентов с потерей 7/7q и с изменениями 11q23. Вместе с высокой теломеразной активностью это очень плохой прогностический признак [83]. Высокая теломеразная активность вместе с короткими теломерами является очень плохим прогностическим признаком при острых Т-клеточных лейкозах у взрослых (время выживания 0,47 года против
4,21 года у пациентов с низкой теломеразной активностью и нормальной длиной теломер) [84].
Повышенная теломеразная активность может быть плохим прогностическим признаком при остром миелоид-ном лейкозе у детей и относительно хорошим — у взрослых (в зависимости от других критериев) [85]. У пациентов с острым лейкозом повышена частота мутаций гена белко-
вого компонента теломеразы [86]. На рис. 7 приведены данные, наглядно показывающие соотношение длины теломер и теломеразной активности, а также прогностическое значение высокой теломеразной активности при острых лейкозах.
Хронические лейкозы
При хроническом миелолейкозе динамика теломераз-ной активности и длины теломер напоминает острый лейкоз. Как показано на рис. 8, средняя длина теломер в лейкоцитах периферической крови, несущих филадельфийскую хромосому, в среднем на 1000 нуклеотидов меньше контрольных.
Во время бластного кризиса теломеры резко укорачиваются (примерно на 1000 нуклеотидов), а теломеразная активность растет. В ответ на успешную терапию ингибитором тирозинкиназы (иматиниб) длина теломер в клетках периферической крови возрастает примерно на 500 оснований [88].
Для хронического лимфолейкоза длина теломер может служить независимым показателем прогноза и тяжести течения заболевания (вероятность развития синдрома Рихтера). В работе [89], проведенной на сотнях пациентов и охватывающей срок до 10 лет, в качестве показателя была выбрана средняя длина теломер в лимфоцитах крови 5000 нуклеотидов. Разделив всех пациентов на группы, имеющие теломеры больше или меньше этой величины, авторы показали чрезвычайно значимые прогностические отличия. В аналогичной работе показано, что резистентные к терапии формы хронического лимфолейкоза имеют чрезвычайно короткие теломеры — около 3000—4000 нуклеотидов (рис. 9).
Рис. 8. Средняя длина теломер в лейкоцитах периферической крови при хроническом миелолейкозе [88]
192
Клиническая онкогематология
Теломеры и теломераза
обычные резистентные
длина формы ХЛЛ формы ХЛЛ теломер, ------------- ------------
Рис. 9. Длина теломер лейкоцитов периферической крови больных хроническим лимфолейкозом, измеренная по Саузерну [90]
Миелодиспластические синдромы
Миелодиспластические синдромы (МДС), несмотря на различия в этиологии, обычно сопровождаются укорочением теломер [91]. Укорочение теломер коррелирует с цитогенетическими изменениями и изменениями микросателлитной ДНК. При МДС, как и в случае лейкозов вообще и апластических состояний, часто находят мутации в генах теломера-зы [92].
МДС, по современным представлениям, начинаются с нарушений гемопоэза, которые преодолеваются опухолевыми клетками путем увеличения устойчивости к апоптозу и последующим выходом из-под контроля иммунной системы (рис. 10).
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ОПОСРЕДОВАННЫЕ ТЕЛОМЕРАЗОЙ
Иммунотерапия
Поскольку теломераза присутствует в большинстве опухолевых клеток, она является хорошим кандидатом на роль антигена, связанного с опухолями. При функционировании теломеразы в клетке фрагменты теломеразной обратной
транскриптазы экспонируются на клеточной поверхности и могут служить мишенью для иммунного ответа. Возможно усиление иммунного ответа, если фрагменты белка hTERT будут появляться на поверхности антигенпредставляющих клеток пациента, прежде всего на дендритических клетках и макрофагах. Выделен ряд пептидов (кусков белка hTERT), которые связываются с антигенами главного комплекса гистосовместимости I класса (HLA-A2.1), представленными на поверхности значительной доли лимфоцитов [94]. Происходит специфическое усиление иммунитета против антигенного пептида. Потенциальное достоинство такой процедуры заключается в отсутствии длительного периода ожидания, как при различных методиках подавления теломеразы. Клинические испытания по специфическому усилению иммунного ответа против белка hTERT были проведены для опухолей простаты [95], рака поджелудочной железы [96] и гепато-целлюлярной карциномы [97].
Все эти вакцины показывают усиление иммунного ответа против опухоли. Неясно, насколько могут пострадать здоровые стволовые клетки, которые также обладают теломе-разной активностью.
Использование промоторов теломеразы (hTERTи hTR)
Пока не найдены препараты, способные эффективно подавлять экспрессию генов теломеразы, зато разработаны подходы, использующие сам факт активной работы промоторов теломеразы в опухолевых клетках.
До клинических испытаний дошли конструкции в составе онколитического аденовируса, который инъецируется непосредственно в опухоль [97, 98]. В составе вируса имеются гены, повышающие чувствительность клеток к предложенной терапии. Поскольку эти гены регулируются промоторами генов теломеразы, то их действие распространяется только на клетки с работающей теломеразой.
Методы подавления теломеразы
Все методы подавления теломеразы страдают одним серьезным недостатком: эффект наступает с большой задержкой, поскольку должно пройти достаточно времени для того, чтобы в отсутствие теломеразы теломеры укоротились за счет недорепликации. Это время может составлять десятки клеточных циклов.
Антисмысловые стратегии основаны на взаимном узнавании (гибридизации) нуклеиновых кислот внутри клетки.
Рис. 10. Возможные молекулярные события при прогрессии миелодиспластиче-ского синдрома [93]
Изменение
механизмов
репарации
ДНК
Высокий риск развития лейкоза
www.medprint.ru
193
Е. Е. Егоров
Вводимые антисмысловые последовательности соединяются со смысловыми (необходимыми для функционирования те-ломеразы) и блокируют их.
Практически эффективным может быть введение в клетки олигонуклеотидов, комплементарных РНК-компоненту теломеразы. Обычно применяют олигонуклеотиды, направленные против матричного района теломеразной РНК. Используют олигонуклеотиды с фосфоротиоатными связями (для увеличения устойчивости к нуклеазам), пептидные нуклеиновые кислоты (для увеличения стабильности гибрида), 2'-О-метил-РНК и 2'-метоксиэтокси-РНК [75]. Эти соединения характеризуются повышенной устойчивостью к нуклеазам и повышенной специфичностью. Самым успешным соединением этого типа является GRN163L (рис. 11). К устойчивому к деградации олигонуклеотиду добавлен жирнокислотный хвост, способствующий проникновению в клетку. С этим соединением был проведен ряд клинических испытаний по терапии хронического лимфолейкоза, некоторых солидных опухолей и немелкоклеточного рака легкого [97, 99].
Опосредованное теломеразой лечение рака — охота за раковыми стволовыми клетками
Часть опухолевых клеток способна переходить в длительно неделящееся состояние и тем самым избегать действия большинства химиотерапевтических агентов. С другой стороны, если полностью подавить действие теломеразы, то 90 % опухолей не смогут развиваться. Однако, как говорилось выше, подавляя лишь теломеразу, нельзя получить быстрого эффекта, необходимого для лечения. Ингибиторы теломеразы могут быть эффективны только при малом количестве клеток. Значит, если лечение будет сочетать в себе традиционные методы, действующие немедленно и уничто-
жающие основную массу опухоли, и антителомеразную терапию, не позволяющую длительно размножаться отдельным способным к этому клеткам (например, раковым, стволовым), то результат, особенно в длительной перспективе, будет неизмеримо лучше [98] (рис. 12).
КОРРЕЛЯЦИЯ СТАРЕНИЯ КЛЕТОК И РАЗВИТИЯ РАЗЛИЧНЫХ ПАТОЛОГИЙ
На сегодняшний день ясно, что старение клеток — процесс более сложный, чем репликативное старение клеток, а укорочение теломер определяется не только недорепликацией, но и недорепарацией, а возможно, и другими процессами. Старение клеток включает в себя любые процессы, ведущие к нарушению клеточных функций. Для длительно неделящихся клеток (мышечных, нервных) это преимущественно нарушения в работе митохондрий, повреждения внутренних районов ДНК, для делящихся клеток — укорочение теломер. Известно, что окислительный стресс способен существенно (на порядок) увеличивать размер потерь концевой ДНК, связанных с клеточным размножением. В неделящихся клетках активные формы кислорода и азота также вызывают повреждения ДНК, которые накапливаются со временем. Практически все патологии, так или иначе, приводят к увеличению окислительного стресса. Окислительный стресс может иметь локальное воздействие, но способен распространяться практически по всему организму. Результатом этих процессов служит чрезмерное укорочение теломер, которое на каком-то этапе становится не только следствием патологии, но и ее движущей силой, препятствующей клеточному размножению, а значит, регенерации. Клетки с короткими теломерами теряют генетическую стабильность и могут становиться родоначальниками опухолей.
Рис. 12. Схема сочетания традиционной терапии с ингибиторами теломеразы
194
Клиническая онкогематология
Теломеры и теломераза
При циррозе печени, независимо от этиологии болезни (вирусный гепатит, аутоиммунный гепатит, алкоголизм, склерозирующий холангит, первичный билиарный цирроз) и возраста пациента, наблюдают укорочение теломер в ге-патоцитах, но не в клетках крови и не в звездчатых клетках. Таким образом, усиленное повреждение и пролиферация ге-патоцитов вызывают их преждевременное старение и замещение соединительной тканью [100].
В зонах атеросклеротических повреждений клетки эндотелия аорты имеют укороченные теломеры [101]. Также при болезнях коронарных сосудов теломеры эндотелиальных клеток становятся существенно короче [102]. Ряд случаев диабета типа 2 объясняют старением и недостаточностью пролиферации ^-клеток [103]. Снижение плотности костей и остеопороз связаны с укорочением теломер [104] и репликативным старением остеобластов [105]. Причиной поседения волос может быть старение меланобластов [106]. Ухудшение с возрастом работы иммунной системы объясняют старением ГСК и т.д. В список патологий при желании можно включить практически все болезни, связанные с возрастом [107].
В 2007 г. появились первые прямые доказательства того, что стволовые клетки меняются с возрастом, стареют. Было показано, что ГСК мыши с возрастом накапливают повреждения ДНК, что определили по уровню фосфорилирования гистона Н2АХ (у-Н2АХ), который накапливается при разрывах ДНК. У старых животных до 70 % стволовых клеток имеют множественные районы, содержащие этот гистон, у молодых он практически отсутствует [108]. Одновременно с этими данными появилась работа, показавшая, что старение стромальных клеток костного мозга, но не ГСК определяет возрастные нарушения функций ГСК [109]. При этом старение стромальных клеток прямо коррелирует с укорочением их теломер. Таким образом, снижение функциональности стволовых клеток может определяться как накоплением повреждения в самих стволовых клетках, так и репликативным старением окружения этих клеток.
К такому же выводу ранее пришли ученые, изучавшие мышечные стволовые клетки. С возрастом резко снижается их способность к регенерации, опосредованной окружением. Иными словами, стареющие ниши стволовых клеток снижают функциональные способности самих стволовых клеток. При этом действие ниши, как и в случае ГСК, включает в себя гуморальные факторы [110].
Гуморальные факторы способны объединить весь организм в одну большую супернишу для всех стволовых клеток и не только. Такая ниша способна одновременно влиять на самые разнообразные клетки. Имеет смысл рассмотреть два примера того, как взаимосвязаны отдельные клетки с состоянием всего организма. Известно, что теломеры клеток периферической крови укорачиваются с возрастом. Но также известно, что они преждевременно укорачиваются у пациентов с инфарктом миокарда, развитым атеросклерозом, болезнью Альцгеймера, васкулярной деменцией, при развитии солидных опухолей, действии эмоционального стресса [111].
Другой пример. V J. Cristofalo в своей замечательной работе 1998 г. [112] установил, что хотя с возрастом сокращается пролиферативный потенциал фибробластов кожи человека, однако если из выборки исключить лиц, страдающих атеросклерозом, гипертензией и диабетом, то зависимость пролиферативного потенциала фибробластов кожи от возраста исчезает!
Если в случае клеток периферической крови мы можем предположить, что эти клетки, перемещаясь по организму, подвергаются самым разнообразным стрессовым воздействиям и таким образом как бы накапливают сумму повреждений, прежде всего опосредованных различными воспа-
лительными процессами (окислительный стресс), а также в связи с избыточной пролиферацией, то в случае фибробластов кожи мы должны принять, что только гуморальные воздействия способны передать действие различных патологий (атеросклероза, гипертензии и диабета) на эти клетки.
Длина теломер в клетках периферической крови имеет четкую корреляцию с прогнозом восстановления после инсульта [113]. В определенном смысле можно утверждать, что длина теломер может служить мерой здоровья человека. Соответственно изменения длины теломер могут отражать эффективность предложенной терапии. Поскольку длина теломер крайне гетерогенна, требуются дополнительные исследования, чтобы установить, какие из параметров длины наиболее значимы: средняя длина, длина минимальных теломер, распределение теломер по длине и т. п.
Работа автора получила поддержку Федерального агентства по образованию (госконтракт № П1293) и Российского фонда фундаментальных исследований (грант 09-04-01071а).
ЛИТЕРАТУРА
1. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С. и др. Подавление функции те-ломеразы аналогами нуклеозидов. Биохимия 1997; 62: 1516-27.
2. Makarov V.L., Hirose Y., Langmore J.P. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell 1997; 88: 657-66.
3. de Lange T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 2005; 19: 2100-10.
4. Caslini C., Connelly J.A., Serna A. et al. MLL associates with telomeres and regulates telomeric repeat-containing RNA transcription. Mol. Cell. Biol. 2009; 29: 4519-26.
5. Yegorov Y.E., Akimov S.S., Akhmalisheva A.K. et al. Blockade of telomer-ase function in various cells. Anti-Cancer Drug Design. 1999; 14: 305-16.
6. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 1961; 25: 585-621.
7. Оловников А.М. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Докл. Акад. наук 1971; 201: 1496-9.
8. Greider C.W., Blackburn E.H. Telomeres, telomerase and cancer. Sci. Am. 1996; 274: 92-7.
9. Muntoni A, Reddel R.R. The first molecular details of ALT in human tumor cells. Hum. Mol. Genet. 2005; 14: R191-R196.
10. Henson J.D., Hannay J.A., McCarthy S.W. et al. A robust assay for alternative lengthening of telomeres in tumors shows the significance of alternative lengthening of telomeres in sarcomas and astrocytomas. Clin. Cancer Res. 2005; 11: 217-25.
11. Liu L., Bailey S.M., Okuka M. et al. Telomere lengthening early in development. Nat. Cell. Biol. 2007; 9: 1436-41.
12. Keefe D.L., Liu L., Marquard K. Telomeres and aging-related meiotic dysfunction in women. Cell. Mol. Life Sci. 2007; 64: 139-43.
13. Schaetzlein S., Lucas-Hahn A, Lemme E. et al. Telomere length is reset during early mammalian embryogenesis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2004; 101: 8034-8.
14. Tomlinson R.L., Ziegler T.D., Supakorndej T. et al. Cell cycle-regulated trafficking of human telomerase to telomeres. Molec. Biol. Cell. 2006; 17: 95565.
15. Ksiazek K., Passos J.F., Olijslagers S. et al. Premature senescence of mesothelial cells is associated with non-telomeric DNA damage. Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 2007; 362: 707-11.
16. Santos J.H., Meyer J.N., Skorvaga M. et al. Mitochondrial hTERT exacerbates free-radical-mediated mtDNA damage. Aging Cell 2004; 3: 399-411.
17. Bermudez Y., Erasso D., Johnson N.C. et al. Telomerase confers resistance to caspase-mediated apoptosis. Clin. Interv. Aging 2006; 1: 155-67.
18. Del Bufalo D., Rizzo A, Trisciuoglio D. et al. Involvement of hTERT in apoptosis induced by interference with Bcl-2 expression and function. Cell Death Different. 2005; 12: 1429-38.
19. Massard C., Zermati Y., Pauleau A.-L. et al. hTERT: a novel endogenous inhibitor of the mitochondrial cell death pathway. Oncogene 2006; 25: 4505-14.
20. Kang H.J., Choi Y.S., Hong S.-B. et al. Ectopic expression of the catalytic subunit of telomerase protects against brain injury resulting from ischemia and NMDA-induced neurotoxicity. J. Neurosci. 2004; 24: 1280-7.
21. Егоров Е.Е., Молдавер М.В., Терехов С.М. и др. Теломеризация не увеличивает способность фибробластов человека к колониеобразованию. Биол. мембраны 2004; 21: 298-305.
22. Saretzki G., Walter T., Atkinson S. et al. Downregulation of multiple stress defense mechanisms during differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cells 2008; 26: 455-64.
www.medprint.ru
195
Е. Е. Егоров
23. Егоров Е.Е., Молдавер М.В., ВишняковаХ.С. и др. Усиление контроля пролиферации в теломеризованных клетках. Онтогенез 2007; 38: 105-19.
24. Go Y.-M., Jones D.P. Redox compartmentalization in eukaryotic cells. Biochim. Biophys. Acta 2008; 1780: 1273-90.
25. Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 2002; 82: 47-95.
26. Valko M., Leibfritz D., Moncol J. et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Intern. J. Biochem. Cell Biol. 2007; 39: 44-84.
27. Vickers M., Brown G.C., Cologne J.B. et al. Modelling haemopoietic stem cell division by analysis of mutant red cells. Br. J. Haematol. 2000; 110: 54-62.
28. Rufer N., Brummendorf T.H., Kolvraa S. et al. Telomere fluorescence measurements in granulocytes and T lymphocyte subsets point to a high turnover of hematopoietic stem cells and memory T cells in early childhood. J. Exp. Med. 1999; 190: 157-67.
29. Verfaillie C.M., Pera M.F., Lansdorp P.M. Stem cells: hype and reality. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2002: 369-91.
30. Hiyama E., Hiyama K. Telomere and telomerase in stem cells. Br. J. Cancer 2007; 96: 1020-4.
31. Wynn R.F., Cross M.A., Hatton C. et al. Accelerated telomere shortening in young recipients of allogeneic bone-marrow transplants. Lancet 1998; 351: 178-81.
32. Scheding S., Ersoz I., Hartmann U. et al. Periferal blood cell telomere length measurements indicate that hematopoietic stem cell turnover is not significantly increased in whole blood and apheresis PLT donors. Transfusion 2003; 43: 1089-95.
33. Weng N.P., Levine B.L., June C.H. et al. Human naive and memory T lymphocytes differ in telomeric length and replicative potential. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1995; 92: 11091-4.
34. Bernardo M.E., Zaffaroni N., Novara F. et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells do not undergo transformation after long-term in vitro culture and do not exhibit telomere maintenance mechanisms. Cancer Res. 2007; 67: 9142-9.
35. Zimmermann S., Martens U.M. Telomeres, senescence, and hematopoietic stem cells. Cell Tissue Res. 2008; 331: 79-90.
36. Pipes B.L., Tsang T., Peng S.X. et al. Telomere length changes after un-bilical cord blood transplant. Transfussion 2006; 46: 1038-43.
37. Егоров Е.Е. Теломеры, теломераза и стволовые клетки в механизмах патологии человека. В кн.: Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Под ред. М.А. Пальцева. М.: Медицина, 2009: 233-72.
38. Walter M., Davies J.P., Ioannou Y.A. Telomerase immortalization upregu-lates Rab9 expression and restores LDL cholesterol egress from Niemann-Pick C1 late endosomes. J. Lipid Res. 2003; 44: 243-53.
39. Condon J., Yin S., Mayhew B. et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol. Reprod. 2002; 67: 506-14.
40. McKee J.A., Banik S.S., Boyer M.J. et al. Human arteries engineered in vitro. EMBO Rep. 2003; 4: 633-8.
41. Klinger R.Y., Blum J.L., Hearn B. et al. Relevance and safety of telomerase for human tissue engineering. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2006; 103: 2500-5.
42. Shi S., Grontos S., Chen S. et al. Bone formation by human postnatal bone marrow stromal cells is enhanced by telomerase expression. Nat. Biotech-nol. 2002; 20: 587-91.
43. Gronthos S., Chen S., Wang C.Y. et al. Telomerase accelerates osteogenesis of bone marrow stromal stem cells by upregulation of CBFA1, osterix, and osteocalcin. J. Bone Miner. Res. 2003; 18: 716-22.
44. Mihara K., Imai C., Coustan-Smith E. et al. Development and functional characterization of human bone marrow mesenchymal cells immortalized by enforced expression of telomerase. Br. J. Haematol. 2003; 120: 846-9.
45. Huang G., Zheng Q., Sun J. et al. Stabilization of cellular properties and differentiation multipotential of human mesenchymal stem cells transduced with hTERT gene in a long-term culture. J. Cell. Biochem. 2008; 103: 1256-69.
46. Abdallah B.M., Haack-Sorensen M., Burns J.S. et al. Maintenance of differentiation potential of human bone marrow mesenchimal stem cells immortalized by human telomerase reverse transcriptase gene in despite of extensive proliferation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 326: 527-38.
47. Jun E.S., Lee T.H., Cho H.H. et al. Expression of telomerase extends longevity and enhances differentiation in human adipose tissue-derived stromal cells. Cell. Physiol. Biochem. 2004; 14: 261-8.
48. Kang S.K., Putnam, Dufour J. et al. Expression of telomerase extends the lifespan and enhances osteogenic differentiation of adipose tissue-derived stromal cells. Stem Cells 2004; 22: 1356-72.
49. Akimov S.S., Ramezani A, Hawley T.S. et al. Bypass of senescence, immortalization, and transformation of human hematopoietic progenitor cells. Stem Cells 2005; 23: 1423-33.
50. Terai M., Uyama T., Sugiki T. et al. Immortalization of human fetal cells: the life span of umbilical cord blood-derived cells can be prolonged without manipulating p16ink4a/RB braking pathway. Molec. Biol. Cell. 2005; 16: 1491-9.
51. Roy N.S., Nakano T., Keyoung H.M. et al. Telomerase immortalization of neuronally restricted progenitor cells derived from the human fetal spinal cord. Nat. Biotechnol. 2004; 3: 297-305.
52. Bai Y., Hu Q., LiX. et al. Telomerase immortalization of human neural progenitor cells. Molec. Neurosci. 2004; 15: 245-9.
53. Dashinimaev E.B., Vishnyakova K.S., Popov K.V. et al. Stable culture of hTERT-transduced human embryonic neural stem cells holds all the features of primary culture. Electronic J. Biol. 2008; 4: 93-7.
54. Halvorsen T.L., Beattie G.M., Lopez A.D. et al. Accelerated telomere shortening and senescence in human pancreatic islet cells stimulated to divide in vitro. J. Endocrinol. 2000; 166: 103-9.
55. Narushima M., Kobayashi N., Okitsu T. et al. A human beta-cell line for transplantation therapy to control type 1 diabetes. Nat. Biotechnol. 2005; 23: 1274-82.
56. Kobayashi N., Fujiwara T., Westerman K.A. et al. Prevention of acute liver failure in rats with reversibly immortalized human hepatocytes. Science 2000; 287: 1258-62.
57. Noguchi H., Kobayashi N., Westerman K.A. et al. Controlled expansion of human endothelial cell populations by Cre/loxP-based reversible immortalization. Hum. Gene Ther. 2002; 13: 321-34.
58. Matsumura T., Takesue M., Westerman K.A. et al. Establishment of an immortalized human liver endothelial cell line with SV40T and hTERT. Transplantation 2004; 77: 1357-65.
59. Garcia C.K., Wright W.E., Shay J.W. Human diseases of telomerase dysfunction: insights into tissue aging. Nucl. Acids Res. 2007; 35: 7406-16.
60. Hills M., Lansdorp P.M. Short telomeres resulting from heritable mutations in the telomerase reverse transcriptase gene predispose for a variety of malignancies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2009; 1176: 178-90.
61. Calado R.T., Regal J.A., Kleiner D.E. et al. A spectrum of severe familial liver disorders associate with telomerase mutations. PLoS ONE 2009; 4: e7926.
62. Alter B.P., Giri N., Savage S.A. et al. Cancer in dyskeratosis congenita. Blood 2009; 113: 6549-57.
63. Dokal I. Dyskeratosis congenital in all its forms. Br. J. Haematol. 2000; 110: 768-79.
64. Savage SA., Alter B.P. Dyskeratosis congenita. Hematol. Oncol. Clin. N. Am. 2009; 23: 215-31.
65. Tsakiri K.D., Cronkhite J.T., Kuan P.J. et al. Adult-onset pulmonary fibrosis caused by mutations in telomerase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2007; 104: 7552-7.
66. Armanios M.Y., Chen J.J.L., Cogan J.D. et al. Telomerase mutations in families with idiopathic pulmonary fibrosis. N. Eng. J. Med. 2007; 356: 1317-26.
67. Podesta M., Piaggio G., Frassoni F. et al. The assessment of the hematopoietic reservoir after immunosuppressive therapy or bone marrow transplantation in severe aplastic anemia. Blood 1998; 91: 1959-65.
68. Brummendorf T.H., Maciejewski J.P., Mak J. et al. Telomere length in leukocyte subpopulations of patients with aplastic anemia. Blood 2001; 97: 895900.
69. Yamaguchi H., Calado R.T., Ly H. et al. Mutations in TERT, the gene for telomerase reverse transcriptase, in aplastic anemia. N. Engl. J. Med. 2005; 352: 1413-24.
70. Finley J.C., Reid B.J., Odze R.D. et al. Chromosomal instability in Barrett’s esophagus is related to telomere shortening. Canc. Epidemiol. Biomarkers Prev. 2006; 15: 1451-7.
71. Meeker A.K., Hicks J.L., Platz E.A. et al. Telomere shortening is an early somatic DNA alteration in human prostate tumorigenesis. Canc. Res. 2002; 62: 6405-9.
72. O’Sullivan J.N., Bronner M.P., Brentnall T.A. et al. Chromosomal instability in ulcerative colitis is related to telomere shortening. Nat. Genet. 2002; 32: 280-4.
73. Roig A.I., Wright W.E., Shay J.W. Is telomerase a novel target for metastatic colon cancer? Curr. Colorect. Canc. Reports 2009; 5: 203-8.
74. Rahman R., Heath R., Grundy R. Cellular immortality in brain tumours: an integration of the cancer stem cell paradigm. Biochim. Biophys. Acta 2009; 1792: 280-8.
75. Егоров Е.Е. Теломераза и канцерогенез. В кн.: Клиническая онкогематология. Под ред. М.А. Волковой. М.: Медицина, 2007: 126-40.
76. Shay J.W., Wright W.E. Hallmarks of telomeres in ageing research. J. Pathol. 2007; 211: 114-23.
77. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С. и др. Теломеразная активность клеток при изменениях их пролиферативного состояния. Биол. мембраны 1998; 15: 630-8.
78. Ohyashiki J.H., Ohyashiki K., Fujimura T. et al. Telomere shortening associated with disease evolution patterns in myelodysplastic syndromes. Cancer Res. 1994; 54: 3557-60.
79. Yamada O., Oshimi K., Motoji T., Mizoguchi H. Telomeric DNA in normal and leukemic blood cells. J. Clin. Invest. 1995; 95: 1117-23.
80. Counter C.M., Avilion A.A., Lefeuvre C.E. et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. EMBO J. 1992; 11: 1921-9.
81. Ohyashiki J.H., Ohyashiki K., Iwama H. et al. Clinical implications of telomerase activity levels in acute leukemia. Clin. Cancer Res. 1997; 4: 619-25.
82. Xu D., Gruber A, Peterson C., Pisa P. Telomerase activity and the expression of telomerase components in acute myelogenous leukaemia. Br. J. Haematol. 1998; 102: 1367-75.
83. Zhang W., Piatyszek M.A., Kobayashi T. et al. Telomerase activity in human acute myelogenous leukemia: inhibition of telomerase activity by differentiation-inducing agents. Clin. Cancer Res. 1996; 2: 799-803.
84. Kubuki Y., Suzuki M., Sasaki H., Toyama T. et al. Telomerase activity and telomere length as prognostic factors of adult T-cell leukemia. Leuk. Lymphoma 2005; 46: 393-9.
85. Verstovsek S., Manshouri T., Smith F.O. et al. Telomerase activity is prognostic in pediatric patients with acute myeloid leukemia: comparison with adult acute myeloid leukemia. Cancer 2003; 97: 2212-7.
196
Клиническая онкогематология
Теломеры и теломераза
86. Calado R.T., Regal J.A., Hills M. et al. Constitutional hypomorphic telom-erase mutations in patients with acute myeloid leukemia. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2009; 106: 1187-92.
87. Wang Y., Fang M., Sun X. et al. Telomerase activity and telomere length in acute leukemia: correlations with disease progression, subtypes and overall survival. Inter. J. Lab. Hematol. 2010; 32: 230-8.
88. Keller G., Brassat U., Braig M. et al. Telomeres and telomerase in chronic myeloid leukaemia: impact for pathogenesis, disease progression and targeted therapy. Hematol. Oncol. 2009; 27: 123-9.
89. Rossi D., Bodoni C.L., Genuard E. et al. Telomere length is an independent predictor of survival, treatment requirement and Richter’s syndrome transformation in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2009; 23: 1062-72.
90. Brugat T., Gault N., Baccelli I. et al. Aberrant telomere structure is characteristic of resistant chronic lymphocytic leukaemia Cells. Leukemia 2010; 24: 246-51.
91. Lange K., Holm L., Nielsen K.V. et al. Telomere shortening and chromosomal instability in myelodysplastic syndromes. Genes, Chromosomes & Cancer 2010; 49: 260-9.
92. Kirwan M., Vulliamy T., Marrone A. et al. Defining the pathogenic role of telomerase mutations in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia. Hum. Mutation 2009; 30: 1567-73.
93. Epling-Burnette P.K., List A.F. Advancements in the molecular pathogenesis of myelodysplastic syndrome. Curr. Opin. Hematol. 2009; 16: 70-6.
94. Arai J., Yasukawa M., Ohminami H. et al. Identification of human telomerase reverse transcriptase-derived peptides that induce HLA-A24-restricted antileukemia cytotoxic T lymphocytes. Blood 2001; 97: 2903-7.
95. Su Z., Dannull J., Yang B.K. et al. Telomerase mRNA-transfected dendritic cells stimulate antigen-specific CD8+ and CD4+ cell responses in patients with metastatic prostate cancer. J. Immunol. 2005; 174: 3798-807.
96. Bernhardt S.L., Gjertsen M.K., Trachsel S. et al. Telomerase peptide vaccination of patients with non-resectable pancreatic cancer: a dose escalating phase I/II study. Br. J. Cancer 2006; 95: 1474-82.
97. Shay J.W., Keith W.N. Targeting telomerase for cancer therapeutics. Br.
J. Cancer 2008; 98: 677-83.
98. Keith W.N., Thomson C.M., Howcroft J. et al. Seeding drug discovery: integrating telomerase cancer biology and cellular senescence to uncover new therapeutic opportunities in targeting cancer stem cells. Drug Discov. Today 2007; 12: 611-21.
99. Gellert G.C., Dikmen Z.G., Wright W.E. et al. Effects of a novel telomerase inhibitor, GRN163L, in human breast cancer. Breast Canc. Res. Treat. 2006; 96: 73-81.
100. Wiemann S.U., Satyanarayana A, Tsahuridi M. et al. Hepatocyte telomere shortening and senescence are general markers of human liver cirrhosis. FASEB J. 2002; 16: 935-42.
101. Okuda K., Khan M.Y., Skurnick J. et al. Telomere attrition of the human abdominal aorta: relationships with age and atherosclerosis. Atherosclerosis 2000; 152: 391-8.
102. Ogami M., Ikura Y., Ohsawa M. et al. Telomere shortening in human coronary artery diseases. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004; 3: 546-50.
103. Yoon K.H., Ko S.H., Cho J.H. et al. Selective beta-cell loss and alphacell expansion in patients with type 2 diabetes mellitus in Korea. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003; 5: 2300-8.
104. Valdes A.M., Richards J.B., Gardner J.P. et al. Telomere length in leukocytes correlates with bone mineral density and is shorter in women with osteoporosis. Osteoporos. Int. 2007; 9: 1203-10.
105. Pignolo R.J., Suda R.K., McMillan EA. et al. Defects in telomere maintenance molecules impair osteoblast differentiation and promote osteoporosis. Aging Cell 2007; 7: 23-31.
106. Nishimura E.K., Granter S.R., Fisher D.E. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science 2005; 307: 720-4.
107. Babizhayev M.A., Savel’yeva E.L., Moskvina S.N. et al. Telomere length is a biomarker of cumulative oxidative stress, biological age and an independent predictor of survival and therapeutic treatment requirement associated with smoking behavior. Am. J. Ther. 2010 Mar 29. [Epub ahead of print.]
108. Rossi D.J., Bryder D., Seita J. et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature 2007; 447: 725-9.
109. Ju Z., Jiang H., Jaworski M. et al. Telomere dysfunction induces environmental alterations limiting hematopoietic stem cell function and engraftment. Nat. Med. 2007; 13: 742-7.
110. Carlson M.E., Conboy I.M. Loss of stem cell regenerative capacity within aged niches. Aging Cell 2007; 6: 371-82.
111. von Zglinicki T., Martin-Ruiz C.M. Telomeres as biomarkers for ageing and age-related diseases. Curr. Molec. Med. 2005; 5: 197-203.
112. Cristofalo V.J., Allen R.G., Pignolo R.J. et al. Relationship between donor age and the replicative lifespan of human cells in culture: a reevaluation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1998; 95: 10614-9.
113. Martin-Ruiz C., Dickinson H.O., Keys B. et al. Telomere length predicts post-stroke mortality, dementia, and cognitive decline. Ann. Neurol. 2006; 60: 174-80.
www.medprint.ru
197
