CC BY
94
УДК 634.11+634.13:581.1
Технология беспересадочного культивирования яблони и груши in vitro
The technology of direct cultivation of apple and pear in vitro
Ст. науч. сотрудник О.В. Матушкина, ст. науч. сотрудник И.Н. Пронина (ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства имени И.В. Мичурина») тел. (47545) 2-07-61 E-mail: invitro82@yandex.ru
Senior Researcher O.V. Matushkina, Senior Researcher I.N. Pronina (Federal State Budget Scientific Institution I.V. Michurin All-Russia Research Institute for Horticulture) tel. (47545) 2-07-61 E-mail: invitro82@yandex.ru
Реферат. Разработка технологии депонирования яблони и груши in vitro является одним из перспективных направлений биотехнологии. Она позволяет создать банк ценных генотипов и при необходимости включать их в систему производства сертифицированного посадочного материала. Успешное хранение плодовых и ягодных культур in vitro определяется многими факторами, из которых влияние условий культивирования и регуляторов роста являются наиболее важными, а также следует учитывать цель депонирования. Цель исследований - совершенствование основных технологических приемов хранения in vitro, поиск общих закономерностей морфогенеза яблони и груши с учетом их генотипических особенностей. Установлено оптимальное соотношение минерального, гормонального состава питательной среды и углеводов, а также условий беспересадочного культивирования, которые позволяют продлить депонирование эксплантов на этапе собственно микроразмножения в зависимости от генотипа до 12-46 мес., а на этапе ризогенеза - до 2-7 мес., сократить количество субкультивирований на 3-5 пассажей за 1 год. Лучшей средой для беспересадочного культивирования является 1/4QL, на которой сохраняется 50-100 % эксплантов. Увеличение содержания сахарозы до 40 г/л продлевает сохранность эксплантов до 24 мес. Совместное введение в состав питательной среды БАП и АБК увеличивает коэффициент размножения у подвоя груши ПГ 12 в 3,8 раз, однако оказывает ингибирующее последействие на формирование дополнительных пазушных почек. Наибольшая длительность хранения микрорастений на этапе ризогенеза наблюдается у подвоя яблони 54-118-7 мес. при 100 % сохранности микрорастений. Использование данной технологии позволяет повысить адаптивность микрорастений ex vitro на 7,7-31,9 %.
Summary. Development of technology for deposition of apple and pear in vitro is one of the promising areas of biotechnology that allows you to create a bank of valuable genotypes, and, if necessary, to integrate them in the production of certified plant matheral. Successful storage of fruit and berry cultures in vitro is determined by many factors, of which the influence of culture conditions and growth regulators are the most important, and you should also consider the purpose of the deposit. The aim of the research is the improvement of the main technological methods of storage in vitro, the search for general regularities of the morphogenesis of apple and pear with regard to their genetic characteristics. The optimum ratio of mineral and hormonal composition of nutrient medium, carbohydrates, as well as the conditions of continuous cultivation, which allow to extend the escrow explants on the stage actually micropropagation, depending on genotype, up to 12-46 months and rhizogenesis up to 2-7 months, to reduce the number of subcultivations for 3-5 passages in a single year. The best medium for continuous cultivation is 1 /4QL, which is retained on a 50-100 % of the explants. The increase in the content of sucrose to 40.0 g/1 prolongs the preservation of explants for up to 24 months. Joint introduction to the composition of the nutrient medium BAP and ABA increases the rate of reproduction of the pear rootstock PG 12 in 3.8 times, but has an inhibitoiy aftereffect on the formation of additional axillary buds. The maximum duration of storage of micro plants on rhizogenesis stade is observed in apple rootstock 54-118 - 7 months at 100 % the safety of the micro plants. The use of this technology allows to increase the adaptability of micro plants ex iritro up to 7.7-31.9 per cent.
С Матушкина О.В., Пронина И.Н., 2016
Ключевые слова: яблоня, груша, собственно микроразмножение, ризогенез, адаптация, длительное хранение, сохранность, in vitro, ex vitro.
Keywords: apple, pear, micropropagation, rhizogenesis, adaptation, long-term storage, preservation, in vitro, ex vitro.
Разработка технологии длительного беспересадочного депонирования растений in vitro является одним из перспективных направлений биотехнологии. Она позволяет создать банк ценных генотипов и при необходимости включать их в систему производства сертифицированного посадочного материала плодовых и ягодных культур.
Успешное хранение плодовых и ягодных культур in vitro определяется многими факторами, из которых влияние условий культивирования и регуляторов роста являются наиболее важными, а также следует учитывать цель депонирования. В связи с этим необходимо создать такие условия, при которых микрорастения погружались бы в состояние покоя и могли находиться в нем длительное время, имея пониженный уровень обменных процессов, фотосинтеза, дыхания и потребляя минимум питательных веществ, подобрать оптимальное соотношение минерального и гормонального состава питательной среды, а также условий культивирования, чтобы не только обеспечить максимальную сохранность микрорастений при депонировании, но последующую их регенерационную способность на этапах собственно микроразмножения и ризогенеза, а также высокий процент приживаемости ex vitro [1, 2].
Цель исследований - совершенствование основных технологических приемов хранения in vitro, поиск общих закономерностей морфогенеза яблони и груши с учетом их биологических особенностей.
Для увеличения интервала между пассажами используют различные приемы, основанные на замедлении роста пробирочных растений, наиболее важным среди которых является не только температура, но и минеральный состав питательной среды, содержание углеводов и биологически активные вещества. Успешное хранение микрорастений плодовых и ягодных культур in vitro определяется многими факторами, из которых влияние температуры является наиболее изученным. Температура в интервале от +4 до +8 °С способствует замедлению роста яблони и груши и увеличению длительности беспересадочного культивирования in vitro.
На этапе введения в культуру in vitro возможно беспересадочное культивирование меристематических тканей подвоев яблони при температуре +4 °С и отсутствии освещенности в течение 3-5 мес., которое не оказывает последующего влияния на коэффициент размножения на этапе пролиферации [3].
Для замедления процесса морфогенеза растительных тканей на этапе собственно микроразмножения целесообразно модифицировать минеральный состав питательных сред. По нашему мнению, максимально возможное беспересадочное культивирование эксплантов в обычных условиях - 4 мес., т.к. в дальнейшем процесс пролиферации прекращается и происходит некроз и гибель эксплантов.
Оптимальной питательной средой для культивирования in vitro яблони и груши является Кворина-Лепуавра (QL). Снижение концентрации макроэлементов в данной среде в 2 и 4 раза позволяет продлить длительность беспересадочного культивирования до 9 мес. у подвоев яблони 76-6-6, 76-8-13, ПБ 9 с сохранением всех эксплантов в отличие от подвоя 76-6-13, у которого 100 % сохранность наблюдается при разбавлении питательной среды только в 4 раза, в то время как на полной среде происходит их гибель (рис. 1). Увеличение длительности депонирования до 15 мес. приводит к гибели всех эксплантов на среде с полным содержанием макросолей.
4Ш
у.
о и
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 о
1 АП
76-6-6
76-8-13
ПБ 9
76-6-13
□ □ 1 : у:. □ 1 •• д:
Рис. 1. Влияние минерального состава питательной среды на сохранность подвоев яблони при депонировании в течение 9 мес.
Значительное воздействие на процесс морфогенеза оказывает наличие углеводов в питательной среде, которые, являясь источником энергии, способствуют закладке пазушных почек п росту мпкропобегов. Использование таких углеводов, как сахароза и сорбит, показывает, что оптимальным является сахароза, однако при этом следует учитывать реакцию генотппа. Так, у сортов сохранность экс-плантов на 6,3-41,7 % ниже, чем у подвоя, вне зависимости от типа углевода (табл. 1).
Таблица 1
Влияние различных углеводов на сохранность эксплантов яблони
Подвой, сорт Углевод Через 12 мес. Через 21 мес.
Сохранность, % Коэффициент размножения шт/экспл. Сохранность, % Коэффициент размножения, шт/экспл.
62-396 Сахароза 100 3,3 50,0 2,5
Сорбит 100 3,1 50,0 2,0
НСР05 Рфакт < Ртеор Рфакт < Ртеор
Добо Сахароза 93,7 2Д 93,7 4,7
Сорбит 87,5 2,6 33,3 4,7
НСРоз 0,5 Кфакт < Ктеор
Жигулевское Сахароза 80,0 1,3 0,0 -
Сорбит 58,3 2,7 0,0 -
НСР05 0,5
Культивирование сортов яблони в течение как 12, так п 21 мес. на среде с сорбитом уменьшает количество сохранившихся эксплантов на 12,5-41,7 %, причем у Жигулевского при этом отмечается гибель микропобегов в конгломератах как на среде с сахарозой, так п с сорбитом, но с сорбитом на 21,7 % больше. У подвоя 62-396 различий при культивировании на средах с сахарозой и сорбитом не отмечается.
Концентрация сахарозы, используемая при депонировании, зависит от генотппа. Так, например, у подвоя груши ПГ 12 сохраняются все экспланты вне зависимости от концентрации сахарозы и позволяют продлить длительность хранения до 46 мес. В то время как у подвоя яблони 62-396 снижение концентрации сахарозы отрицательно влияет на сохранность эксплантов. Увеличение содержания сахарозы до 40,0 г/л продлевает сохранность эксплантов до 24 мес., при дальнейшем культивировании (до 46 мес.) наблюдается гибель всех эксплантов.
Важное значение имеет сохранение регенерадионной способности эксплан-тов после длительного хранения in vitro. У подвоя груши ПГ 12 после депонирования в течение 46 мес. на средах с различной концентрацией сахарозы максимальной способностью (100 %) к пролиферации обладают экспланты, культивируемые на среде с сахарозой 40,0 г/л, у которых способность к регенерации на 58,4 %выше, чем с сахарозой 20,0 г/л.
Обязательными компонентами питательной среды являются биологически активные вещества, среди которых наиболее известны цитокинины, ауксины, абсцизовая кислота (АБК), фенолкарбоновые кислоты и др. Обычно при размножении яблони и груши in vitro из цитокитнинов используют б-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1,0-2,0 мг/л, которая также является оптимальной и при депонировании для большинства генотипов. Увеличение концентрации БАП до 3,0 мг/л снижает количество сохранившихся эксплантов на 12,5 % (Лобо) - 16,7 % (62-396), а у Жигулевского, наоборот, повышает на 13,4 % (рис. 2).
Абсцизовая кислота, являясь ингибитором, не только тормозит процессы роста растений, но и обладает антистрессорными свойствами, усиливающими их адаптацию к различным неблагоприятным воздействиям. Эти свойства АБК дают возможность сократить количество субкультивирований при клональном микроразмножении растений и длительно хранить экспланты in vitro без пересадки. Совместное введение в состав питательной среды БАП и АБК увеличивает коэффициент размножения у подвоя груши ПГ 12 в 3,8 раз (рис. 3).
100 90 80 70 i 60 о 50 = 40 30 20 10 0
ж,
х и
1 1
_217
66,6
62-396 Жигулевское Лобо
□ БАП 1 мг 1 ШБАП 3 мг л
Рис. 2. Влияние концентрации БАП на длительность хранения яблони in vitro
и
£ -§ в.
- 3
S * ji £
? 4 -
0
HCP05-0.S
НСР05-0.1
ПГ12 62-396
□ б^ гормонов ЕЗБАП 1.0 мг/д
ШБАП 1.0 мг я - АБК 0.5 мг/л ШБАП 3.0 мг/л —» без гормонов
Рис. 3. Влияние биологически активных веществ на коэффициент размножения яблони и груши при длительном хранении
У подвоя яблони высокая пролпферпрующая способность отмечена как на среде с БАП в сочетании с АБК, так и прп последовательном субкультивпрованпи с БАП 3,0 мг/л на питательную среду без гормонов, коэффициент размножения при этом превосходит контроль в 2,0-2,4 раза. Однако использование АБК в сочетании с БАП оказывает пнгпбирующее последействие на формирование дополнительных пазушных почек. Это проявляется не только в снижении коэффициента размножения в 1,7-3,0 раза, но и интенсивности роста микропобегов, количество которых длиной более 1,5 см на 17,8-23,5 % меньше, чем на среде, содержащей только БАП (47,8-50,0 %).
К фенолкарбоновым кислотам относится салициловая кислота (СК), которая также обладает антистрессорнымп свойствами, способствует повышению устойчивости растений к биотическим (вирусы, бактерии, грибы) и абиотическим (засуха, холод, УФ-излучение) факторам. Депонирование подвоя яблони 76-6-13 п сортов Лигол п Жигулевское как на среде с СК, так п без нее, показывает, что через 12 мес. сохранились все экспланты за исключением сорта Лигол, у которого в контроле отмечается гибель 8,4 % эксплантов.
Присутствие салициловой кислоты в среде для длительного хранения оказывает положительное влияние на последующую регенерацпонную способность эксплантов подвоя яблони 76-6-13 и сорта Лигол, у которых количество регенерировавших эксплантов увеличивается на 8,4 п 16,7 %, а у Жигулевского, наоборот, это количество уменьшается на 8,3 %. Кроме того, салициловая кислота улучшает качество микропобегов, увеличивает их количество длиной более 1,5 см на 4,1-26,3 %и ускоряет процесс корнеобразования на 1 неделю.
Основная цель депонирования на этапе рпзогенеза - получение мпкрорасте-ний к определенному сроку п накопление их достаточного количества для высадки в нестерильные условия. Не менее важным фактором при депонировании на данном этапе является свет. Установлено положительное влияние темноты на процессы корнеобразования у подвоя яблони 62-396 и сорта Лигол, прп которой укореняемость через 12 недель культивирования увеличивается на 25-75 % соответственно. В то время как у сорта Жигулевское, наоборот, отмечается ингибпру-ющее действие темноты. Культивирование в клпмокамере прп освещенности 1,5 тыс. лк уже через 3 мес. приводило к 100 % гибели мпкрорастений не зависимо от генотппа. Отсутствие освещенности позволяет сохранить все мпкрорасте-ния у подвоя яблони 62-396 и сорта Лигол даже через 6 мес. культивирования.
Установлено, что для корнеобразования яблони п груши наиболее предпочтительно использовать кратковременное воздействие (5-7 дней) ауксина на микрочеренок, что позволяет на 1-2 недели ускорить ризогенез и увеличить укореняемость. Данный способ оказывает положительное влияние п на сохранность мик-рорастенпй при депонировании.
Совместное использование БАП п АБК прп депонировании эксплантов на этапе пролиферации оказывает ингибирующее воздействие на последующие процессы корнеобразования. Последействие длительного хранения (7 мес.), абсцизо-вой кислоты п концентрации 6-бензпламинопурина на ризогенную способность показывает, что наивысшая укореняемость отмечается у подвоя груши ПГ 12 (100 %), мпкропобеги которого получены при культивировании в период хранения на среде без гормонов.
Прп введении в состав питательной среды салициловой кислоты не выявлено существенного её влияния как на укореняемость подвоев и сортов яблони за исключением подвоя 54-118 и сорта Лобо, так п на сохранность укорененных мпкрорастений при депонировании. Наибольшая длительность хранения вне зависимости от присутствия СК отмечается у подвоя яблони 54-118 - 7 мес. при 100 % сохранности микрорастенпй (рис. 4).
inn_цш_ша_inn
100 -
90 -# 80 ■ С 70-§ 60 -= 50 -| 40 -о 30 -3 20 -10 -о -
1,5 месяца 2 месяца 2,5 месяца 7 месяцев
□ Мартовское □ Лобо □ Лигол О 54-118
Рис. 4. Сохранность микрорастений яблони на этапе ризогенеза in intm
Способ хранения укорененных микрорастений при пониженной температуре как в темноте, так и на свету, оказывает последующее влияние и на их адаптацию ex vitro. Для некоторых генотипов данный элемент технологии способствует лучшей приживаемости и более интенсивному росту (табл. 2). Так, например, у подвоев яблони 76-6-13 и груши ПГ 12, сортов яблони Аобо, Лигол и груши Январская при хранении в течение 3 мес. наблюдается увеличение приживаемости растений-регенерантов на 7,7-31,9 %, у остальных исследуемых генотипов - незначительное снижение данного показателя.
Таблица 2
Влияние хранения укорененных микрорастенй in vitro (3 мес.) на приживаемость ex. vitro
Подвой, сорт Приживаемость, %
без хранения после хранения
62-396 64,7 52,9
76-6-13 76,5 92,3
Лобо 22,6 54,5
Лигол 61,5 69,2
Жигулевское 41,9 23,5
ПГ 12 70,0 88,9
ПГ 2 60,0 46,7
ПГ 17-16 87,5 82,3
Январская 25,0 50,0
Таким образом, оптимальное соотношение минерального, гормонального состава питательной среды и углеводов, а также условий беспересадочного культивирования позволяет:
- продлить депонирование эксплантов in vitro на этапе собственно микроразмножения в зависимости от генотипа до 12-46 мес., а на этапе ризогенеза до 2-7 мес.;
- сократить количество субкультивирований на 3-5 пассажей за один год;
- повысить адаптивность микрорастений ex vitro на 7,7-31,9 %.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ центра № 15-44-03094.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ташматова, Л.В. Возможность клонального микроразмножения и депонирования сортов и форм груши [Текст]/ Л.В. Ташматова, В.А. Высоцкий // Плодоводство и ягодоводство России,- 2008. - С. 385-389.
2. Матушкина, О.В. Беспересадочное культивирование яблони и груши in vitro [Текст] / О.В. Матушкина, И.Н. Пронина // Матер. Междунар. науч. конф. «Традиционные п инновационные подходы в исследованиях культурных растений п их дикорастущих сородичей». - Т. XXXVII. - Ч. 1, 2013. - С. 222-228.
3. Пронина, И.Н. Депонирование яблони и груши in vitro [Текст] /И.Н. Пронина, О.В. Матушкина // Аграрная наука. - 2014. - № 1. - С. 20-21.
REFERENCES
1. Tashmatova L.V. Vozmozhnost' klonal'nogo mikrorazmnozhenija i deponirovani-ja sortov i form grushi [The possibility of clonal micropropagation and storage of varieties and forms pear] Plodovodstvo i jagodovodstvo Rossii, 2008, pp. 385-389 (Russian).
2. Matushkina O.V. Besperesadochnoe kul'tivirovanie jabloni i grushi in vitro [Through the cultivation of apple trees and pears in vitro] Mater. Mezhdunar. nauch. konf. «Tradicionnye i innovacionnye podhody v issledovanijah kul'turnyh rastenij i ih dikorastushhih sorodichej'», 2013, Т. XXXVII, ch. 1, pp. 222-228 (Russian).
3. Pronina I.N. Deponirovanie jabloni i grushi in vitro [Deposition of apple and pear in vitro] Agrarnaja nauka, 2014, No 1, pp. 20-21 (Russian).
