CC BY
121
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 574.24; 579.66
А. В. Бакеева, Н. Н. Титова, В. В. Исакова, А. О. Тюкова, К. В. Квитко
свойства цианобактерий и микроводорослей из загрязненных радионуклидами водоемов вурса
Введение
Изменение генотипов в популяции (т. е. адаптация ее к новым условиям), направленное на снижение отрицательного воздействия экстремального фактора среды на жизнеспособность и продуктивность популяции, осуществляется под влиянием этого фактора, если он по своей интенсивности становится значимым для воспроизведения природных популяций различных видов. По данным В. А. Шевченко [1-4], изучавшего популяции Chlorella vulgaris в местах Восточно-Уральского радиационного следа (ВУРС) Челябинской области, возникшего в результате Кыштымской аварии 1957 г. (взрыв емкости для хранения жидких высокоактивных отходов ПО «Маяк»), рост в течение длительного времени в среде с повышенной радиацией приводит к появлению у них устойчивости к радиационным воздействиям или радиоадаптации, связанной с микроэволю-ционными перестройками генотипа в хронически облучаемых популяциях.
Повышение концентрации радионуклидов в среде ведет к подъему уровня мутационного процесса в популяции. Это может привести к кризисным явлениям в облучаемых популяциях. Выход из подобного состояния осуществляется путем эволюционных преобразований популяций, направленных на адаптацию к радиации. Возрастание радиорезистентности осуществляется за счет отбора форм, характеризующихся более эффективной работой репарационных систем. В результате этого преобразования популяции восстанавливают уровень стабильности до его оптимального значения. Происходит генетическая адаптация к повышенному фону ионизирующего излучения.
Биопленки в виде «матов», собранные в водах, загрязненных радионуклидами технологических водоемов ФГУП ПО «Маяк» и озер, расположенных на ВУРСе (в окрестности г. Озерска, Челябинская область), были переданы на кафедру микробиологии СПбГУ сотрудником ФГУП ПО «Маяк» Т. Б. Меньших. Нами были выделены, очищены и идентифицированы штаммы цианобактерий и микроводорослей [5].
© А. В. Бакеева, Н. Н. Титова, В. В. Исакова, А. О. Тюкова, К. В. Квитко, 2011
Из данных литературы [6, 7, 8] известно, что микробиальные маты, состоящие из цианобактерий, несут в себе высокий потенциал биодеградации. Водоросли также довольно широко используются в доочистке бытовых и агропромышленных сточных вод, а также в очистке вод от ксенобиотиков, таких как нефть и полициклические углеводороды.
Ниже приводятся работы, в которых было показано, что цианобактерии и водоросли играют важную роль в процессах очищения технологических водоемов ПО «Маяк» от радионуклидов. В работе Т. Б. Меньших [9, 10] дана предварительная оценка интенсивности самоочищения водоема-охладителя В-2 ПО «Маяк», а также питьевого оз. Иртяш В-1 (как контрольном водоеме) сине-зелеными водорослями от четырех радиационнозначимых радионуклидов — долгоживущих бета- (90Sr и 137Cs) и альфа-излучателей (241Am и 239Pu). В период исследований, июль 2004 г., в водоемах преобладали сине-зеленые водоросли: в В-2 — Microcystis wesenbergii Kom. in Kondrat., в В-1 — Anabaena sp. и aphanizomenon flos-aqua (L.) Ralfs. Основной вывод заключается в том, что в многолетнем аспекте процессы продукции и деструкции фитопланктона вносили заметный вклад в самоочищение водоема от радионуклидов, в результате которого происходило перемещение отмершей биомассы в донные отложения и консервация ее на длительный срок. Оценки индексов самоочищения водоема от радионуклидов, обусловленного продукцией органического вещества, показали, что более интенсивно происходило перемещение альфа-излучателей 239+240Pu и 241Am.
В работе М. Я. Чеботиной [11] также отмечалось, что в пресных водоемах, использовавшихся как водоемы-охладители ПО «Маяк», параллельно с физико-химическими процессами сорбции радионуклидов взвешенными и донными осадками, протекает извлечение радионуклидов растительными организмами. В работе «Экология водоемов зоны техногенной радиационной аномалии на Южном Урале», выполненной А. И. Сма-гиным [12], собраны, систематизированы и проанализированы данные о динамике гидрохимического и радиационного режимов промышленных водоемов за период эксплуатации (40-60 лет), а также показано, что водная растительность гидроценозов играет значительную роль в процессах самоочищения воды ряда водоемов. На основе вышеизложенных фактов можно предположить, что изучаемые нами культуры цианобактерий и микроводорослей будут обладать повышенной радиоустойчивостью, как потомки клонов, которые существовали в течение длительного времени в среде с повышенным радиационным фоном ВУРСа. При определенном наборе биоремедиационных свойств такие культуры могут быть использованы для снижения токсичности загрязненных радионуклидами вод. В ранее опубликованных статьях [13, 14] было оценено влияние некоторых экологически значимых факторов на рост изучаемых культур: токсичность выделенных штаммов цианобактерий по отношению к тест-объекту Daphnia magna, устойчивость к повышенным концентрациям соли, устойчивость культур к токсичной жидкости и иммобилизация клеток на субстрате.
Целью настоящей работы было изучение чувствительности культур цианобактерий и микроводорослей к экстремальным факторам: температура, рН, УФ-облучение коротковолновой области (253,7 нм), высушивание и сохранение жизнеспособности после данного воздействия, а также определение цитотоксичности.
материалы исследования
Культуры цианобактерий и микроводорослей. В опытах использованы штаммы цианобактерий и микроводорослей, собранные Т. Б. Меньших в различных по степени загрязнения водах. Штаммы были переданы на кафедру микробиологии СПбГУ для дальнейшего их включения в коллекцию «CALU» культур кафедры микробиологии СПбГУ (сокр. Collection of Algae of Leningrad University) [15]. Характеристика мест обитания исходных биопленок дана в табл. 1. Водоемы ТКВ1 (В-3, В-4, В-10) и В-2 (оз. Кызыл-Таш) являются хранилищами жидких низкоактивных отходов (НАО) и расположены на тер-
Таблица 1. Характеристика условий обитания исходных биопленок (водоемы расположены по уменьшению уровня радиоактивности)
Места обитания биопленок Тип загрязнения водоема Характеристики воды водоема по составу основных ионов и другим гидрохимическим показателям по: [16, 17, 18]
оз. Карачай, В-9 средняя удельная активность воды 10-20 Ки/л, сброс среднеактивных отходов поверхностная вода у южного берега, глубина не более 0,5 м, уровень загрязнения — 1 Р/л, соленая — 3-10 г/л
оз. &арое Болото, В-17 то же гидрохимические данные отсутствуют
В-10 ТКВ сумм. активность водоема 100 кКи, содержание активности в воде (по 908г и 137С8) 20 кКи, сброс низкоактивных отходов вода относится к сульфатному классу, группа натрия-кальция — к 1-му типу, по среднегодовой общей жесткости — жесткая (в сентябре — ближе к средней жесткости), соленость зависит от повышенной минерализации, содержание фосфатного Р — 0,16 мг/л, pH 7,8
оз. Кызыл-Таш, В-2 сумм. активность водоема 22 000-100 000 Ки/год [19], средняя удельная активность воды 2,6-10-7 Ки/л [20], активность по 908г > 2000 Бк/кг относится к гидрокарбонатному классу, группе натрия 1-го типа, по среднегодовой общей жесткости — средняя, соленая, мезотрофная t воды 15°С, pH 9,1
В-4 ТКВ, сумм. активность водоема 44 000 Ки/год [21], средняя удельная активность воды 2,640-7 Ки/л, активность по 908г > 24 000 Бк/кг относится к гидрокарбонатному классу, группе натрия 1-го типа, по среднегодовой общей жесткости — средняя (в сентябре — средней жесткости), пресная, полигипертрофная, t воды 7°С, pH 8,7
В-3 ТКВ, сапропель сброс низкоактивных отходов уровень загрязнения — 0,08 Р/л
В-3 ТКВ сумм. активность водоема 7300 Ки/год, активность по 908г > 15 000 Бк/кг относится к гидрокарбонатному классу, группе натрия 1-го типа, по среднегодовой общей жесткости — средняя (в октябре — средняя жесткость), пресная, по степени трофии — мезотрофная (по фосфатному Р), pH 8,3
оз. Алабуга промысловое озеро относится к гидрокарбонатному классу, группе натрия 1-го типа, по общей жесткости относится к классу средней жесткости, по степени минерализации — к водам с относительно повышенной минерализацией, содержание Р04 3- — 0,01 мг/л
1 ТКВ — Теченский каскад водоемов.
ритории санитарно-защитной зоны ПО «Маяк». Озера Алабуга и Большие Кирпичики расположены на периферии головного участка ВУРСа и принадлежат к группе озер верхнего течения рек Теча и Синара.
Паспортизация и сохранение экологически перспективных культур цианобактерий и микроводорослей в коллекции культур водорослей лаборатории микробиологии биологического института САШ была произведена в 2007-2008 гг. В базе данных коллекции для каждой культуры указаны место отбора, дата отбора, название вида и регистрационный номер.
Культуры представлены зелеными протококковыми водорослями Бсепейезтш циайгіоаийа (две культуры, выделенные из В-17, и одна — из В-3 ТКВ соответственно) и цианобактериями: одноклеточными БупесНосувШ зр. (одна культура из оз. Большие Кирпичики и одна из оз. Карачай (В-9)), нитчатыми ЬерЫущЬуа зр. (одна культура
Таблица 2. Культуры цианобактерий и микроводорослей, изоляты из водоемов ВУРСа
№ по каталогу САШ № в коллекции по: [3] Род Место и год сбора исходного образца биопленки Концентрация ШС1, % Устойчивость к 10%-ным стокам Токсич- ность
Оптим Ингиби- рующая
Цианобактерии
1307 10-2 ЗупєсНосузґіз зр. оз. Большие Кирпичики, октябрь, 2005 г. 0,8 1,6
1310 15-3 Ьєрґоіу^Ьуа зр. оз. Алабуга октябрь, 2005 г. 0,8 3,2 + т
1311 7-3 РНогшійіиш зр. В-10 ТКВ июнь-сентябрь 2006 г. 0,2 0,4-3,2 - >>
1314 6-1 РНогшійіиш зр. оз. Кызыл-Таш (В-2) октябрь, 2005 г. 0,4 0,8 - >>
1315 8-2 Ьєрґоіу^Ьуа зр. В-3 ТКВ октябрь, 2005 г. 0,2 0,4-3,2 + >>
1316 6-3 РНогшійіиш зр. В-2 ТКВ октябрь, 2005 г. 0,8 1,6-3,2 - >>
1318 26-3 ЗупєсНосузґіз зр. оз. Карачай (В-9) июнь-сентябрь 2006 г. 1,6 3,2 - >>
1320 13-1 РНогшійіиш зр. оз. Кызыл-Таш (В-2) октябрь, 2005 г. 0,8 1,6 - >>
1323 5-2 Ьєрґоіу^Ьуа зр. то же 0,4 0,8 - -
1324 11-1 РНогшійіиш зр. В-4 ТКВ, октябрь, 2005 г. то же 1,6 3,2 - т
1325 11-2 РНогшійіиш зр. 0,4 0,8 - ср.
1326 11-3 РНогшійіиш зр. то же то же - >>
1327 12-1 РНогшійіиш зр. В-3 ТКВ октябрь, 2005 г. то же 0,2 0,4 - >>
1328 12-2 РНогшійіиш зр. 0,4 0,8-3,2 - т
1329 12-3 РНогшійіиш зр. то же то же + >>
Зеленые водоросли
1312 27-3 8сепейе$шш quadricauda Водоем В-17 июнь-сентябрь 2006 г. то же 0,2 3,2 + >>
то же то же + >>
1322 24-3 8сепейе$шш quadricauda
1330 28-1 Scenedesmus quadricauda В-3 ТКВ, сапропель июнь-сентябрь 2006 г. 0,2 3,2 + >>
Примечание. т — токсичность, ср. — средняя токсичность.
из оз. Алабуга и две — из В-3 и оз. Кызыл-Таш (В-2)) и Phormidium sp. десять культур Phormidium sp. изначально выделены из различных мест сбора. Место, год сбора, номер CALU и таксономическая принадлежность даны в табл. 2.
Цианобактерии являются источником разнообразных вторичных метаболитов, в том числе токсинов и ингибиторов ферментов. Токсичные цветения снижают качество воды, могут вызывать тяжелые отравления и представляют опасность для здоровья людей [22]. Удобным методом при анализе биологической активности культур является использование клеточных культур млекопитающих.
Тест для обнаружения цитотоксической активности цианобактериальных штаммов (МТТ). Данные предоставлены Т. С. Остапенко (Дмитриева), оценка по методике из работы [23], которая основана на способности живых, не поврежденных ци-тотоксическими веществами лимфобластных клеток линий: Sp-2 — мышиная миелома и Yac-1 — мышиная лимфома, преобразовывать МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия бромид; SIGMA) в кристаллы формазана. Эта способность основана на работе систем дегидрогеназ, расположенных в митохондриях. Погибшие в результате цитотоксического действия клетки, в свою очередь, не обладают ферментативной активностью. В тесте использовали 200 мг лиофилизированной биомассы цианобактерий CALU 1310 (Leptolyngbya sp.), 1323 (Leptolyngbya sp.) и 1329 (Phormidium sp.). В качестве контроля использовали интактные суспензии клеточных линий.
Была определена цитотоксическая активность трех культур цианобактерий CALU 1310, 1323 и 1329 родов Leptolyngbya sp., Leptolyngbya sp. и Phormidium sp. соответственно. Культуры были описаны ранее, они обладали необходимым набором биоремедиационных характеристик: культура CALU 1310 — устойчива к сточной жидкости (СЖ), взятой из карт Красного Бора, CALU 1323 — к повышенной концентрации соли до 3,2% и CALU 1329 — к СЖ, среднетоксичная. Также все 3 культуры иммобилизовались на твердом носителе.
Результаты анализа представлены в табл. 3. Экстракт считался цитотоксически активным, если степень ингибирования клеток превышала 25%. Все 3 культуры оказались токсичными.
Таблица 3. Результаты МТТ-теста (личное сообщение Т. С. Остапенко (Дмитриева))
№ CALU Род Степень ингибирования экстрактов клеточными линиями, % Среднее значение степени ингибирования (I), %
Yac-1A Sp-2
1310 Leptolyngbya sp. 49 62 55,5
1323 Leptolyngbya sp. 50 68 59
1329 Phormidium sp. 56 61 58,5
Необходимо было изучить приспособленность культур цианобактерий и микроводорослей к различным условиям среды обитания. Исследовано влияние следующих физико-химических факторов на рост культур: температуры, рН, высокой концентрации нитратов в среде, УФ-облучения коротковолновой области (253,7 нм) и восстановление роста культур после длительного высушивания.
методы исследования
При выделении и идентификации мы использовали общепринятые методы [24-26].
1. Состав питательных сред, условия культивирования цианобактерий и микроводорослей. В качестве минеральной питательной среды использована среда № 6,
имеющая следующий состав (мг/л): KNO3 — 1000; K2HPO4 — 200; MgSO4 — 200; CaCl2 — 150; NaHCO3 — 200; ZnSO4 ■ 7H2O — 0,022; MnSO4 — 1,81; CuSO4 ■ 5H2O — 0,079; NaBO3 ■ 4H2O — 2,63; (NH4)6Mo7O24 ■ 4H2O — 1; FeSO4 ■ 7H2O — 9,3; CaCl2 — 1,2; Co(NO3)2 ■ H2O — 0,02; ЭДТА — 10.
При приготовлении твердой среды добавлялся порошковый агар до 1,5%.
В лаборатории микробиологии СПбГУ цианобактерии и микроводоросли выращивались при 23-25°C под постоянным освещением 2000-2500 лк.
Культуры цианобактерий и микроводорослей в коллекции поддерживались на плотной среде № 6 и на этой же среде с добавкой до 10% аминопептида.
2. Подготовка культур к эксперименту. Для постановки опыта необходимо было иметь суспензию цианобактерий и микроводорослей достаточной степени гомогенности для засева во все варианты опыта. Так как нитчатые исследуемые культуры цианобактерий Phormidium sp. и Leptolyngbya sp. росли не в виде гомогенной суспензии, а образовывали скопления кожистых нитей (комки и пленки), посевной материал гомогенизировали. Суспензия готовилась на той же среде, на которой изучался рост.
3. Микроскопические методы. Морфологию цианобактерий и микроводорослей изучали с помощью светового микроскопа МБИ-3.
4. Регистрация роста культур цианобактерий и микроводорослей. Регистрация роста проводилась путем измерения оптической плотности (ОП) в полосе 610 нм на нефелометре (KF-5, ZAL, Польша), подсчета клеток в камере Горяева и КОЕ (колониеобразующих ед./мл).
5. Чувствительность цианобактерий и микроводорослей к температуре. Для
выяснения устойчивости к температуре цианобактерии и микроводоросли в жидкой питательной среде № 6 помещали в термостаты при разных температурах: 10, 23, 32 и 60°С. Прирост ОП за сутки служил оценкой размножения клеток. По степени накопления клеточной массы определяли оптимальные, минимальные и максимальные температуры для роста. Повторность трехкратная.
6. Чувствительность цианобактерий и микроводорослей к кислотам и щелочам. Для выявления отношения цианобактерий и микроводорослей к кислотности питательной среды, в жидкую питательную среду № 6 добавляли буферные смеси, поддерживающие определенную реакцию среды. В качестве буферных растворов использовали стандарт-титр для приготовления образцовых буферных растворов: рН 4,01 (калий фталевокислый кислый С8Н5О4К), рН 6,86 (фосфатный буфер КН2РО4 и NaH2P04), рН 9,18 (натрий тетраборнокислый №В4О7-ЮН2О). Величину рН определяли с помощью рН-метра типа рН-150М (Беларусь). После 7 суток инкубации при 23-25°С по росту клеточной массы устанавливали предельные значения кислотности среды, при которой еще возможен рост культур. Повторность трехкратная.
7. Получение высохших пленок культур. Культуры, выращенные на плотной питательной среде № 6, оставлялись и высушивались при температуре 23-25°C. После образования тонких высушенных агаровых пленок в чашки добавлялись дистиллированная вода и разбавленная в 2 раза жидкая минеральная среда № 6. Морфологию клеток культур восстановивших рост после высыхания изучали микроскопированием.
8. Метод облучения цианобактерий ультрафиолетом. Источником ультрафиолетового (УФ) излучения служила ртутная лампа низкого давления (Philips Ultraviolet TUV 30W/G30T8, UVC). Ультрафиолет-С, коротковолновой диапазон, длина волны 253,7 нм. Расстояние от УФ-лампы до облучаемых чашек 10 см (табл. 4).
Таблица 4. Контрольные культуры микроводорослей и цианобактерий в опыте на устойчивость к УФ-облучению
№ по CALU Род штамма Происхождение штамма
13 Scenedesmus obliquus (Turp.) Kruger Coll. Pringsheim, A-125; получен: коллекция ЧСА^ Прага, 1960 г. Характерный тип спаривания: нейтрофил, мезофил, автотроф, одноклеточный
157 Chlorella vulgaris Beijer. Северный Кавказ, р. Кубань, нейтрофил, мезофил, автотроф, штамм Б. В. Громова, 1962 г.
435 Scenedesmus quadricauda оз. Шор-Куль, Восточный Памир, выделен В. М. Андреевой; ценобии по 4 клетки
734 Synechocystis sp. Центральная Камчатка, пос. Снежный, источник с t = 37o, рH 8,0, штамм Б. В. Громова, 1973 г.
1202 Scenedesmus obliquus (Turp.) Kutz. нефтезагрязненная почва г. Ростова, устойчив к фенолу, a-метилнафталину, фенантрену, выделен Е. Ф. Сафоновой, 1995 г. (ES-55), одноклеточный
899 Phormidium sp. штамм Б. В. Громова, 1988 г., окрестности Владивостока, налет на почве
1226 Leptolyngbya sp. штамм H. H Титовой, собран Л. H. Волошко, август 2003 г., р. Солоница, водозабор г. Шрехты Костромской обл.
500 мкл гомогенной суспензии клеток культур помещали в чашки Петри диаметром 40 мм, толщина слоя 1 мм. Время облучения составляло 5, 10, 15 и 20 мин. Суспензии тщательно перемешивали для предотвращения оседания клеток на дно.
5 мкл облученной гомогенной суспензии клеток наносили пипеткой-дозатором на плотную питательную среду № 6 в виде непрерывного штриха длиной 35 мм и шириной 10 мм, равномерно распределяя бактериальной петлей по всей поверхности агара в пределах штриха. При нанесении суспензии клеток особо уделялось внимание тому, чтобы клетки не образовывали скоплений, были одиночными для удобства последующего наблюдения за их делением.
Для предотвращения фотореактивации чашки с посевами облученных клеток хранили в темноте одни сутки, после чего выставлялись на досветку. Первые результаты учитывали на следующий день. Оценивалась длина штриха в миллиметрах в зоне облучения, зона сплошного роста и зона единичных колоний для одноклеточных форм.
Для количественного учета выживаемости клеток культур после воздействия облучения УФ использовался метод реплик. Репликатором из матрицы с 25-ю лунками 20 мкл суспензии клеток в разведениях от 106 до 102 кл./мл переносилась на чашки Петри. Это обеспечивало тестирование выживаемости клеток пяти тестируемых культур. Инкубацию проводили при 25°С под постоянным освещением 2000-2500 лк, результаты учитывали через 7 дней. Повторность опыта трехкратная.
Набор представленных данных был описан при помощи уравнений регрессии и построения соответствующих линий тренда. Кривая роста представлялась в виде прямой, уравнение регрессии вида у = ах + Ь, где коэффициент х — суточный прирост ОП. Сравнивая соответствующие коэффициенты, можно более наглядно показать различие в росте культур в разных условиях — температуре или рН. Я2 — надежность линии тренда показывала близость значений линии тренда к фактическим данным. Чем больше величина этого показателя, тем достовернее линия тренда.
Результаты исследований
Все выделенные культуры цианобактерий и микроводорослей росли в интервале рН от 7 до 10, при этом не были отмечены какие-либо морфологические изменения. При крайних рН (5, 6 и 11) роста нет, в связи с этим произошло полное выцветание пленок нитчатых и суспензий одноклеточных цианобактерий и микроводоросли Бсепейезтш с^иайгкаийа. Критерий детерминации уравнений для рН 7, 8, 9 и 10 достаточно высок, что позволяет считать, что культура Боепейевшив ^иайпоаийа CALU 1312 растет при высоких значениях рН и относится к алкалифильному типу (рис. 1).
контр. (7,6) _у(контр.) = 0,0695л + 0,096 Я2 = 0,9244 у(5) = -0,0045* + 0,178 Я2 = 0,5704 у{6) = -0,005*+ 0,172 Я2 = 0,5076 у(1) = 0,0595* + 0,146 Я1 = 0,9586 ;у(8) = 0,0655* +0,112 Я2 = 0,09467 >>(9) = 0,0588*+ 0,126 Я2 = 0,9283 ^(10) = 0,0645*+ 0,116 Я2 = 0,9316 МП) = -0,0065*+ 0,194 Я2 = 0,6706
Рис. 1. Эффект подщелачивания среды на рост ценобий штамма Зеепейгтш циайткаийа (CALU 1312)
контр. — контроль (то же для рис. 2).
Аналогичные графики были построены и для других 17 культур (данные не приводятся), в результате сделан вывод, что оптимум роста для всех культур наблюдался при значениях рН от 7 до 10 и они относятся к алкалифильному типу.
Все выделенные культуры цианобактерий и микроводорослей росли в интервале температур от 10 до 32°С. У культур цианобактерий и микроводорослей, выращиваемых при различных температурах не были отмечены морфологические изменения: форма и цвет клеток, а также изменение цвета культуральной среды, образуемых пленок (для нитчатых культур) и цвета суспензии (для одноклеточных культур). При повышении температуры (до 60°С) происходило полное обесцвечивание пленок нитчатых цианобактерий и суспензий одноклеточных цианобактерий и зеленых микроводорослей. Суточный прирост биомассы ценобий штамма Бсепейезтш с^иайгкаийа (CALU 1312) при четырех температурах (10, 23, 32 и 60°С) был охарактеризован кривыми роста ОП и в уравнениях регрессии величины биомассы культуры (у=ОП) от времени (х=сутки). Критерий детерминации уравнений для первых трех температур был достаточно высок, что позволяет считать, что культура CALU 1312 относится к мезофильному типу (рис. 2).
контр.(23)
_у(контр.) = 0,059х + 0,1338 Я2 = 0,9164 ;К10) = 0,0545* + 0,164 Я1 = 0,9063 у(32) =0,0613* + 0,118 Я2 = 0,9253 у(60) = -0,0045* + 0,17 Я2 = 0,587
Рис. 2. Эффект повышения температуры от 10 до 60°С на рост суспензий штамма Зеепейгтиь циайткаийа (CALU 1312)
Аналогичные графики были построены и для других 17 культур (данные не приводятся), в результате сделан вывод, что все культуры цианобактерий и микроводорослей росли в интервале температур от 10 до 32°С и относятся к мезофильному типу.
Цианобактерии и микроводоросли, находившиеся долгое время под влиянием высокого радиационного облучения, по мнению Шевченко, должны обладать также высоким уровнем резистентности и к другим неблагоприятным факторам окружающей среды.
Авторы настоящей статьи изучили действие повышенной концентрации нитратов на уровень роста культур из своей коллекции.
На рис. 3 дана динамика ОП культуры CALU 1312 (Бсепейезтш циайгкаийа). Из графика видно, что концентрация нитратов 20 и 30 г/л была ингибирующей.
7(4) = 0,0488*+ 0,1895 Я2 = 0,9827 Х8) = 0,0512* + 0,1509 Я2 = 0,9615 ХЮ) = 0,0519*+ 0,1423 Я2 = 0,9501 Х20) = -0,0098* + 0,238 Я2 = 0,9724 Х30) =-0,0119*+ 0,1953 Я2 = 0,8003
Рис. 3. Динамика оптической плотности (ОП) культуры CALU 1312 (Зеепейгтш циайткаийа) при различных концентрациях KNOз (г/л)
Аналогичные графики были построены и для других 17 культур (данные не приводятся). Определено, что две культуры CALU 1318 (Synechocystis sp.) и 1330 (Scenedesmus циайткаийа) устойчивы к концентрации нитратов до 8 г/л в жидкой среде, все остальные устойчивы к концентрации нитратов до 10 г/л.
Мы испытали также действие УФ-облучения коротковолновой области (253,7 нм), оказывающее губительное и мутагенное действие на клетки. Предварительные эксперименты по облучению клеток культур, нанесенных на плотную питательную среду в виде штрихов, показали, что из всех 18 изучаемых культур, культуры CALU 1312 и 1322, 1330 рода Scenedesmus quadricauda устойчивы к облучению УФ в течение 15 мин (рис. 4, где по оси абсцисс отложено время УФ-облучения, мин; по оси ординат: N — число фрагментов нитей при определенной дозе УФ-облучения, N0 — число фрагментов нитей в контроле). Другие 15 культур были не устойчивыми к УФ при облучении в течение 15 мин, одноклеточные культуры не образовывали видимых колоний, нитчатые не давали рост нитей. Следует отметить, что данные культуры были сохранены в коллекции, как обладающие наибольшим числом биоремедиационных характеристик (устойчивость к сточной жидкости и повышенной концентрации соли).
Штаммы CALU 1307, 1318, выделенные из водоемов ВУРСа, более устойчивы к воздействию УФ-облучения, чем штамм из нерадиоактивного места обитания CALU 734 (рис. 5).
Рис. 4. Выживаемость на 7-е сутки при УФ-облуче-нии клеток штаммов Synecho-cystis sp
CALU 734 (контроль из нерадиоактивного места обитания) и культуры, выделенные из водоемов ВУРСа, CALU 1307, 1318.
о
Рис. 5. Выживаемость при УФ-облучении клеток штаммов 1202 (контроль из нерадиоактивного места обитания), 1312, 1322, 1330 — Scenedesmus quadricauda
В отличие от штаммов зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda штаммы одноклеточной цианобактерии Synechocystis sp. менее устойчивы к УФ-облучению, так при 15 мин экспозиции УФ роста нет.
Штаммы CALU 1311 и 1320 — Phormidium sp., выделенные из водоемов ВУРСа (рис. 6), более устойчивые к воздействию УФ-облучения (рис. 7), чем штамм из нерадиоактивного места обитания CALU 899 (рис. 8).
Штамм CALU 1314 и 1316, выделенный из оз. Карачай, по устойчивости к УФ-облуче-нию сходен с контрольным штаммом CALU 899.
Штаммы CALU 1324, 1325, 1326, 1327, 1328, 1329 — Phormidium sp., выделенные из водоемов ВУРСа, более устойчивые к воздействию УФ-облучения, чем штамм из нерадиоактивного места обитания CALU 899 (рис. 9).
Ьо§ N/N0
-6 ---------1--------1--------1-------1--------1-------г
О 2 4 6 8 10 12
УФ, мин
Рис. 6. Выживаемость при УФ-облучении фрагментов нитей штаммов CALU 899 (контроль из нерадиоактивного места обитания), 1311, 1314, 1316, 1320 — Phormidium sp.
-5 ---------1--------|--------1--------1-------1--------1
0 1 2 3 4 5 6
УФ, мин
Рис. 7. Выживаемость при УФ-облучении фрагментов нитей штаммов 899 (контроль из нерадиоактивного места обитания), 1324, 1325, 1326 — Phormidium sp.
Рис. 8. Выживаемость при УФ-облучении фрагментов нитей штаммов 899 (контроль из нерадиоактивного места обитания), 1327, 1328, 1329 — Phormidium sp.
Ьсщ N/N0 О
УФ, мин
^N/N0 О
Рис. 9. Выживаемость при УФ-облучении фрагментов нитей штаммов 1324, 1327, 1324-5, 1327-5 (после 500 Гр острого гамма-облучения) — Phor-midium sp.
5 6
УФ, мин
Штаммы CALU 1310 и 1323 — Leptolyngbya sp., выделенные из водоемов ВУРСа, более устойчивые к воздействию УФ-облучения, чем штамм из нерадиоактивного места обитания CALU 1226 (рис. 10).
N/N0
О
Рис. 10. Выживаемость при УФ-облучении фрагментов нитей штаммов 1226 (контроль из нерадиоактивного места обитания), 1323, 1315, 1310 — Leptolyngbya sp.
10 12 УФ, мин
Штамм CALU 1315, выделенный из ТКВ, водоема В-3, по устойчивости к УФ-облуче-нию сходен с контрольным штаммом CALU 1226.
Таблица 5. Оживление культур, разбавленной средой № 6 и дистиллированной водой
№ САШ Род Оживление
разб. среда № 6 дистилл. вода
1311 Synechocystis зр. + -
1312 Scenedesmus qua.drica.uda + +
1314 Phormidium зр. + +
1315 Leptolyngbya зр. + -
1316 Phormidium зр. + -
1318 Synechocystis зр. + -
1320 Phormidium зр. + -
1322 Scenedesmus quadricauda + -
1323 Leptolyngbya зр. + -
1324 Phormidium зр. + +
1327 Phormidium зр. + +
1329 Phormidium зр. + +
1330 Scenedesmus quadricauda + -
Было исследовано высыхание культур и восстановление роста после высыхания при добавлении дистиллированной воды и основной минеральной среды № 6, разбавленной в 2 раза (табл. 5). Повторность опыта трехкратная. В результате показана уникальная способность культур к восстановлению роста после высыхания в разбавленной основной среде. При этом морфологических и физиологических изменений клеток культур, восстановивших рост после высыхания по сравнению с контрольными культурами замечено не было.
Обсуждение результатов исследования
В данной работе приводятся дополнительные характеристики штаммов второго сбора июнь-сентябрь 2006 г. по показателям: устойчивость к соли, сточной жидкости и токсичности по отношению к тест-объекту Daphnia magna (см. табл. 2).
Все культуры цианобактерий и микроводорослей, представленные в табл. 2, росли при температуре 10, 23 и 32°С и рН от 7 до 10.
Изначально было известно, что гидрохимические показатели водоемов (см. табл. 1), из которых были выделены различные биопленки, существенно различались.
Так, например, рН водоемов варьировался от 7,8 до 9,1. Культуры Phormidium зр. САШ 1314 и 1320, выделенные из водоемов с изначально высоким значением рН 9,1, были устойчивы и к более низким значениям (до рН 7). Культура Phormidium зр. САШ 1311, выделенная из водоема В-10 с низким значением рН 7,8, была устойчива к рН 10. Таким образом, выделенные культуры устойчивы как к рН изначального их места роста, так и могут расти в более жестких условиях.
Температура воды различных водоемов в момент сбора биопленок составляла 7-15°С. Было показано, что культуры цианобактерий и микроводорослей, изоляты из водоемов ВУРСА, способны активно расти и при более высоких температурах.
Общий ряд сравнения устойчивости культур к УФ-облучению следующий:
1312 > 1330 > 1322 (Scenedesmus quadricaudd) >> 1318 (Synechocystis зр.) > 1311 (Phormidium зр.) > 1307 (Synechocystisзр.) > 1310 (Leptolyngbyaзр.) > 1323 (Leptolyngbya зр.) >> 1325, 1328 (Phormidium зр.) > 1327, 1329 (Phormidium зр.) > 1326 (Phormidium зр.) > 1320 (Phormidium зр.) > 1324 (Phormidium зр.) > 1315 (Leptolyngbya зр.) > 1316 (Phormidium зр.) > 1314 (Phormidium зр.).
Для культур, изолятов одинаковых мест выделения также характерна различная устойчивость к УФ-облучению.
Штаммы зеленой водоросли Scenedesmus quadricauda устойчивы к УФ-облучению в течение 15 мин, причем штаммы, выделенные из водоемов жидких низкоактивных отходов ПО «Маяк», обладают большей устойчивостью к действию УФ, чем контрольные культуры.
Штаммы одноклеточной цианобактерии Synechocystis зр., изоляты водоемов ВУРСа, также обладают большей устойчивостью к действию УФ, чем контрольные культуры из нерадиоактивных мест обитания.
Штаммы нитчатой цианобактерии Phormidium зр. и Leptolyngbya зр. имеют различный уровень УФ-устойчивости.
Известно, что промышленные отходы производства, а в большей части отходы атомной энергетики содержат нитраты. Концентрация нитратов в таких отходах может варьироваться от 1 до 50 г/л [27, 28], а может достигать 200 г/л [29]. Для использования культур цианобактерий и микроводорослей в очистке и доочистке загрязненных вод необходимо знать уровень устойчивости данных культур к нитратам в среде их роста. Из всех изученных нами культур две культуры САШ 1318 (Synechocystis зр.) и 1330 (Scenedesmus quadricauda) устойчивы к концентрации нитратов до 8 г/л в жидкой среде, все остальные устойчивы к концентрации нитратов до 10 г/л. Показана способность культур переносить высокие концентрации нитратов в среде.
Культуры САШ 1320 Phormidium зр. и 1323 Leptolyngbya зр. росли при повышенной солености среды 0,8%, САШ 1324 Phormidium зр. — 1,6%, они же и были способны к высыханию и оживлению. Другие культуры САШ 1315 Leptolyngbya зр. и 1329 Phormidium зр., способные к высыханию и оживлению, были устойчивы к СЖ.
Способность культур к длительному хранению и последующему восстановлению роста — важная биотехнологическая характеристика. Одним из этапов получения большинства бактериальных препаратов для очистки сточных вод является получение сухой биомассы бактерий. Это необходимо для удобства работы с ним (адсорбирование нефтяных пленок на поверхности, не насыщение препарата водой), а также для удобства его хранения.
Тот факт, что 3 культуры оказались токсичными по отношению к клеткам млекопитающих, позволяет рассматривать их только как кандидатов для очистки промышленных сточных вод.
Таким образом, исследованные нами штаммы, выделенные из водоемов жидких низкоактивных отходов, уже адаптированы к условиям первоначального роста и обладают необходимыми свойствами для решения задач биоремедиации.
* * *
Авторы выражают искреннюю благодарность Т. С. Остапенко за предоставленные характеристики цитотоксичности цианобактерий.
1. Шевченко В. А., Печкуренков В. Л., Абрамов В. И. Радиационная генетика природных популяций. М.: Наука, 1992. С. 13.
2. Шевченко В. А. Естественный и индуцированный мутационный процесс у хлореллы // Успехи соврем. генетики. 1962. Т. 1. С. 246-278.
3. Шевченко В. А. О генетической адаптации популяции хлореллы к хроническому воздействию ионизирующей радиации // Генетика. 1970. Т. 6, № 8. С. 64-73.
4. Шевченко В. А. Радиационная генетика одноклеточных водорослей. М.: Наука, 1979. С. 259.
5. Бакеева А. В., Титова Н. Н., Волошко Л. Н. и др. Биоразнообразие цианобактерий, обитателей водоемов Восточно-Уральского радиоактивного следа (ВУРС) // Региональная молодежная научная конференция «Экологическая школа в г. Петергофе — наукограде Российской Федерации: проблемы национального сектора Балтийского региона и пути их решения». 28-29 ноября, 2007. С. 30-39.
6. Abed R. M. M., Safi N. M. D., Koster J. et al. Microbial diversity of a heavily polluted microbial mat and its community changes following degradation of petroleum compounds // Applied and Environmental Microbiology. 2002. Vol. 68, N 4. P. 1674-1683.
7. Al-Hasan R. H., Al Bader D., Sorkhoh N.A., Radwan S. S. Evidence for n-alkane consumption and oxidation by filamentous cyanobacteria from oil-contaminated coasts of the Arabian Gulf // Marine Biology. 1998. Vol. 130. P. 521-527.
8. Sorkhoh N., Al-Hasan R., Radwan S. Self-cleaning of the Gulf // Nature. 1992. Vol. 359. P. 109.
9. Меньших Т. Б., Никитина Л. В., Ровный С. И., Болсуновский А. Я. Роль фитопланктона в самоочищении водоема-охладителя «ПО «Маяк»» от долгоживущих радионуклидов // Вопросы радиационной безопасности. 2005 г. № 3. С. 71-76.
10. Меньших Т. Б. Депонирование 90Sr и 137Cs в растительно-торфяных сплавинах водоема-накопителя низкоактивных отходов (на примере водоема В-3 Теченского каскада): Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Пермь: Госуниверситет, 2010. C. 14.
11. Чеботина М. Я., Гусева В. П., Трапезников А. В. Планктон и его роль в миграции радионуклидов в водоеме-охладителе АЭС // Екатеринбург: Аврора, 2002. С. 171.
12. Смагин А. И. Экология водоемов зоны техногенной радиационной аномалии на Южном Урале: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. М., 2008. С. 6.
13. Бакеева А. В., Титова Н. Н., Волошко Л. Н. и др. Цианобактерии, выделенные из водоемов, загрязненных жидкими радиоактивными отходами // VI Всероссийская школа по морской биологии «Биоразнообразие сообществ морских и пресноводных экосистем России». Мурманск, 1-2 ноября 2007. С. 26-30.
14. Bakeeva A., Titova N., Voloshko L., Kvitko K. Cyanobacteria of some water basins on the east Urals radioactive trace (EURT) // Abstract. 7th International Symposium for Subsurface Microbiology. Shizuoka, Japan, November 16-21, 2008. P. 42.
15. Громов Б. В., Титова Н. Н. CALU — коллекция культур водорослей лаборатории микробиологии биологического института СПбГУ // Каталог культур микроводорослей в коллекциях СССР. М, 1991. С. 76-125.
16. Алекин О. А. Основы гидрохимии. Л.: Гидрометеоиздат, 1970. С. 296.
17. Андреева М. А. Проблемы экологии, экологического образования и просвещения Челябинской области. Челябинск, 2002. С. 140-141.
18. Черняева Л. Е., Черняев А. М., Еремеева М. Н. Гидрохимия озер. Л., 1977. С. 336.
19. Отчет о научно-исследовательской работе «Исследование специфических аспектов государственного регулирования безопасности при обращении с радиоактивными отходами, накопленными в промышленных водоемах производственного объединения «Маяк», Сибирского химического комбината и горно-химического комбината». М., 2001.
20. Копия письма администрации М.О. «Куяшский сельсовет» № 118 от 13.11.2002.
21. Регенерация отработанного ядерного топлива. Группа информации общественности «ПО “Маяк”», 1995 г. URL: http://www.greenpeace.org/raw/content/russia/ru/press/reports/ 186485.doc 21 (дата обращения: 03.05.2010)
22. Волошко Л. Н. Токсины и другие биологические активные вещества цианобактерий // Региональная молодежная научная конференция. «Экологическая школа в г. Петергофе — наукограде Российской Федерации: проблемы национального сектора Балтийского региона и пути их решения». 28-29 ноября, 2007. С. 19-30.
23. Дмитриева Т. С., Сафронова Т. В. Разнообразие токсинов и других биологически активных соединений, синтезируемых цианобактериями в Невской губе Финского залива // Региональная молодежная научная конференция. «Экологическая школа в г. Петергофе — наукограде Российской Федерации: проблемы национального сектора Балтийского региона и пути их решения». 28-29 ноября, 2007. С. 40.
24. Криг Н. Получение накопительных и чистых культур // Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1983. Т. 1. С. 277-355.
25. Голлербах М. М., Коссинская Е. К., Полянский В. И. Определитель пресноводных водорослей СССР // Вып. 2. Сине-зеленые водоросли. М.: Советская наука, 1953. С. 61, 468.
26. Anagnostidis K., Komarek J. Modern approach to the classification system of cyanophytes. 3-Oscillatoriales // Arch. Hydrobiol. Stuttgart, 1988. Supl. 80. Algological studies (50-53). P. 327-472.
27. Сафонов А. В. Экологические аспекты локализации жидких радиоактивных отходов в глубинном хранилище «Северный»: Автореф. дис. . канд. хим. наук. М., 2009. С. 22.
28. Fredrickson J.K., Zachara J.M., Balkwill D.L., Kennedy D. et al. Geomicrobiology of high-level nuclear waste-contaminated vadose sediments at the Hanford Site, Washington State // Appl. and Environ. Microb. 2004. Vol. 70, N 7. P. 4233.
29. Назина Т. Н., Косарева И. М., Давыдов А. С., Турова Т. П. и др. Физико-химическая и микробиологическая характеристика подземных вод из наблюдательных скважин глубинного хранилища жидких радиоактивных отходов // Микробиология. 2000. Т. 69, № 1. С. 105.
Статья поступила в редакцию 14 октября 2010 г.
