CC BY
291
Р.Ф. МАСГУТОВ, А.А. БОГОВ (МЛ.), А.А. РИЗВАНОВ, И.И. САЛАФУТДИНОВ, УДК 602 9
И.Г. ХАННАНОВА, А.Р. ГАЛЛЯМОВ, А.А. БОГОВ
Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения Республики Татарстан
Стволовые клетки из жировой ткани — биологические свойства и перспективы клинического применения
|Масгутов Руслан Фаридович
кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник травматологического центра
420141, г. Казань, ул. Ипподромная, д. 13/99, кв. 91, тел. (843) 277-54-06, e-mail: masgut@gmail.com
Представлены экспериментальные и клинико-экспериментальные данные в литературе последних лет по применению стволовых клеток из жировой ткани (adipose derived stem cells — ASCs). Показано, что клетки, полученные из жировой ткани, наиболее безопасны, легкодоступны в препаративном количестве и обладают высоким регенеративным потенциалом для применения в различных областях клинической медицины.
Ключевые слова: стромальная сосудистая фракция, стволовые клетки из жировой ткани, дифференцировка клеток, культура клеток.
R.F. MASGUTOV, A.A. BOGOV (JR.), A.A. RISVANOV, I.I. SALAFUTDINOV, I.G. HANNANOVA, A.R. GALLYAMOV, A.A. BOGOV
Republican Clinical Hospital of Ministry of Health Care of the Republic of Tatarstan
Adipose derived stem cells — biological properties and perspectives for clinical applications
This paper presents experimental and clinical and experimental data in the literature recent years by the use of stem cells from adipose tissue (adipose derived stem cells — ASCs). It is shown that cells derived from adipose tissue, the most secure, easily accessible in preparative quantities and have a high regenerative potential for applications in various fields of clinical medicine. Keywords: stromal vascular fraction, stem cells from adipose tissue, cell differentiation, cell culture.
Одним из перспективных направлений во многих областях практической медицины является клеточная терапия как вспомогательный инструмент в арсенале врача — от высокоспециализированного хирурга до врача общей практики. За последние 20 лет накоплен значительный мировой опыт применения клеточных технологий в экспериментальной биомедицине. Проведено большое количество экспериментальных исследований и первых клинических испытаний, направленных на восстановление функции различных органов и тканей с применением клеточных технологий. Существует много источников получения стволовых клеток. Наиболее распространенными являются красный костный мозг и жировая ткань. Источником стволовых клеток также могут служить: эмбриональная и фетальная ткань, пульпа зуба, волосяной фолликул, синовиаль-
ные оболочки мышц, периферическая кровь, кровь пуповины человека и т.д.
В идеале стволовые клетки должны соответствовать следующим критериям:
1. Быть доступными в достаточном количестве (миллионы и миллиарды клеток) для клинического применения.
2. Должны быть забраны малоинвазивным путем.
3. Способны дифференцировать в различные клеточные типы.
4. Должны безопасно и эффективно трансплантироваться в организм человека, не вызывая иммунных реакций.
Стволовые клетки из жировой ткани (adipose derived stem cells — ASCs) соответствуют всем этим критериям. Для забора
жировой ткани достаточно произвести липосакцию, а данный подход достаточно малоинвазивен. Небольшое количество жира (100-200 мл) может забираться под местной анестезией. Более того, в 1 грамме жира содержится до 5*103 стволовых клеток, а это в 500 раз больше, чем количество стволовых клеток, получаемых из костного мозга [1].
Не менее важной является возможность практически в любом возрасте пациента получить необходимое количество аутологичных клеток, применение которых позволяет предупредить реакции отторжения трансплантата, риск передачи трансмиссивных инфекций и снять многие юридические и этические ограничения клеточной терапии.
Технология получения стволовых клеток
из жировой ткани
Первый опыт получения клеток стромальной сосудистой фракции, содержащей ASCs, из жировой ткани, описан в 1964 году. Стромальная сосудистая фракция жировой ткани (ССФЖТ), полученная путем липосакции и дальнейшей ферментативной диссоциации жировой ткани, включает Т-лимфоциты, М2 поляризированные макрофаги, предшественники эндотелиоцитов, фибробласты, перициты, ГМК, преадипоциты и мезенхимные стволовые клетки, количество которых составляет 1-5% от общего числа клеток [1].
На данный момент существует отработанный протокол получения клеток СВФЖТ, описанный [2] и автоматизированный компанией Myltenyi biotec для проведения экспериментальных и клинических исследований:
Процедура забора: Под местной анестезией или под ин-тубационным наркозом производится липосакция жировой клетчатки из области передней брюшной стенки, ягодичной области и наружной поверхности бедер. Для этого выполняется разрез кожи около 5 мм, через который подкожно вводится липосактор, соединенный с вакуумным насосом. Производится забор фрагментированной жировой ткани в стерильный сосуд. Объем жировой ткани определяется объемом жировой ткани у пациента. Далее, в стерильных условиях из жировой ткани выделяется СВФЖТ.
Протокол выделения СВФЖТ:
Процедура выделения ССФЖТ производится в стерильных условиях в ламинаре с использованием одноразовых расходных материалов.
1) Забранная жировая ткань промывается в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут.
2) Производится аспирация буфера.
3) Жировая ткань растворяется в 0,1%-ном растворе колла-геназы в течение 40 минут в шейкере при температуре 37°С.
4) Зрелые адипоциты и соединительная ткань отделяются от SVF путем центрифугирования (800 об/мин., 10 мин.)
5) Для удаления эритроцитов полученные клетки ресу-спендируются в лизирующем буфере (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) в течение 5 минут при комнатной температуре.
6) Клетки промываются в фосфатном буфере и центрифугируются в режиме 800 об/мин., 10 минут.
7) Подсчет клеток производится в камере Горяева с использованием трипанового синего для определения количества жизнеспособных клеток.
Жировая ткань живота является предпочтительной для липоаспирации с целью получения стволовых клеток. ASCs в СВФЖТ из области живота составляют около 5%, а из области бедра — 1%. При этом их пролиферативный и диффе-ренцировочный потенциалы практически не отличаются [3]. В противовес этим исследованиям в работе J. Fraser et al. показано, что клетки жировой ткани из бедра образуют больше
колоний фибробластов (в 2,3 раза) и остеопрогениторов (в 7 раз), чем клетки из брюшной стенки. Висцеральный жир также содержит ASCs с соответствующим фенотипом и потенциалом дифференцировки. На животных показано, что стволовые клетки из белой жировой ткани паховой области обладают большей пластичностью, чем из бурой [4]. Липоаспират может храниться при комнатной температуре до 4 часов без существенного снижения жизнеспособности клеток, а при 2-8 °С — до 24 ч. Таким образом, существует значительный запас времени на транспортировку и выделение стволовых клеток.
Основные мультипотентные свойства ASCs:
остео-, хондро- и адипогенная дифференцировка
Как известно, ASCs, полученные из жировой ткани, обладают большим потенциалом к дифференцировке в различных направлениях. Так, итальянские ученые из University of Udine в своем исследовании показали, что полученная из единственной клетки популяция мезенхимных стволовых клеток из жировой ткани in vitro может быть дифференцирована в структуру, напоминающую зубной зачаток [5]. Морфогенез и дифференцировку зубных зачатков регулируют сложные взаимодействия между мезенхимными стволовыми клетками краниального нейрального креста и эпителия ротовой полости. Исследователи инкубировали первичную культуру полученных из человеческой жировой ткани мезенхимных стволовых клеток в среде, индуцирующей дифференцировку в клетки, образующие зачаток зуба. Сформировавшиеся трехмерные скопления клеток продолжали культивировать еще 4 недели. Образовавшаяся структура была сходна с зачатком зуба. При помощи различных методов анализа была установлена экспрессия маркеров, характерных для тканей зуба. В индуцирующей дифференцировку среде клетки экспрессировали маркеры амелобластов и одонтобластов, а также характерные для них матричные РНК и белки. Кроме того, в соответствии с расположением клеток выявлялась экспрессия маркеров основной мембраны, а также эпителиальных и мезенхимных, сходная с экспрессией маркеров при нормальном физиологическом морфогенезе зуба. Физико-химический анализ обнаружил 200-нм и 50-нм правильно ориентированные кристаллы ги-дроксиапатита, соответствующие строению эмали и дентина in vivo. Таким образом, результаты данного исследования говорят о том, что выделенные из жировой ткани стволовые клетки in vitro даже в отсутствие специфического структурного матрикса или подложки способны к дифференцировке в специализированные клетки, организующиеся в трехмерную структуру, фенотипически сходную с зачатком зуба [5].
Представляет интерес направленная дифференцировка ASCs в хондрогенном направлении. Оптимальной комбинацией ростовых факторов для направленной хондрогенной диффе-ренцировки ASCs является BMP-2/TGF-P3 (bone morphogenetic protein-2/transforming growth factor-p3), Для восстановления хрящевой ткани в качестве носителя стволовых или дифференцированных клеток возможно использование различных биодеградирующих матриксов. ASCs на фибриновом клее способны восстановить дефект сустава у кроликов, продуцируя гиалиноподобный хрящ и вызывая субхондральную репарацию кости [6].
Адипогенная дифференцировка ASCs, как наиболее изученная, может быть реализована при добавлении к культуре дексаметазона, инсулина, изобутил-метилксантина, индоме-тацина, тиазолидинедиона и других факторов. В результате через несколько недель формируется культура адипоцитов. [7]. Трансплантация ASCs в сочетании с собственным жиром значительно увеличивает объем подкожно-жировой клетчатки [2].Терапевтический потенциал ASCs при лечении длительно
20 ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
'7 (55) декабрь 2011 г.
не заживающих ран огромен. Это доказывают доклинические исследования, проведенные японскими учеными. У животных с раком кожи после проведенной радиотерапии образовывались длительно незаживающие язвы. После трансплантации аутологичных ASCs было показано закрытие язв и ремиссия симптомов поражения у всех животных. Несмотря на то, что механизм действия ASCs на молекулярном уровне недостаточно изучен, данный терапевтический подход может играть ключевую роль при лечении хронических язв, закрытии кожных дефектов и дефектов мягких тканей.
ASCs для восстановления периферических нервов
Особенный интерес представляет нейрогенная дифференцировка ASCs для восстановления функции поврежденного периферического нерва.
Рассмотрим сам механизм регенерации периферических нервов: Ученые из Университетского колледжа Лондона сделали шаг к пониманию того, как происходит посттравматическая регенерация периферических нервов. Результаты исследования, объясняющие механизм регенерации, были опубликованы в журнале Cell [8]. В отличие от нейронов спинного мозга периферические нервы способны к регенерации после травм. Как известно, в регенерации аксонов задействованы Шваннов-ские клетки, участвующие в процессе миелинизации. Данный тип клеток в инактивированном состоянии не пролиферирует. Однако при повреждении нейронов последние приобретают свойства стволовых клеток в процессе обратной дифферен-цировки и служат в качестве моста между поврежденными частями нерва в области повреждения. К другим клеткам, способных возвращаться к состоянию стволовых клеток, относятся также клетки печени и эндотелиальные клетки, выстилающие кровеносные сосуды [8]. Тем не менее, как показано в исследовании, Шванновских клеток самих по себе недостаточно для полноценной регенерации нервов. Ключевым механизмом регенерации периферичесих нервов служит запуск каскада процессов, приводящих к экспрессии различных ростовых факторов, таких как фактор роста нервов (NGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и т.д., экспрессируемых микроокружением и самими Шванновскими клетками. Фибро-бласты посылают специализированный сигнал (ephrin-B signal) к Шванновским клеткам, которые, реагируя на него, образуют бюнгеровские ленты, служащие основанием для роста аксона в поврежденных участках периферического нерва из центрального конца к периферическому. Без этого сигнала Шванновские клетки неспособны к организованной миграции, вследствие чего регенерация аксонов оказывается неполноценной. Ответ на сигнал зависит от активности фактора транскрипции Sox2, который присутствует в эмбриональных стволовых клетках и известен своей способностью перепрограммировать взрослые клетки обратно в состояние стволовых клеток. В дальнейшем ученые ставят целью разработать методы, которые могли бы улучшить естественную регенерацию аксонов, поскольку природный механизм восстановления периферических нервов несовершенен.
Ученые Калифорнийского университета в своей работе провели глиальную дифференцировку ASCs для регенерации периферических нервов. Целью работы являлась оценка способности восстановления периферического нерва с помощью тканевой инженерии и глиально-дифференцированных ASCs человека для стимуляции регенерации периферического нерва на модели травмы седалищного нерва крысы. Для этого на седалищном нерве крысы формировался диастаз длиной 13 мм, который замещался биодеградирующей трубкой, содержащей предшественники Шванновских клеток, предифференцирован-
ных из ASCs человека. Результаты исследования показали, что предшественники Шванновских клеток, дифференцированные из ASCs человека, продемонстрировали значительное улучшение восстановления двигательной и чувствительной функции по сравнению с контрольной группой, где производилась трансплантация трубки без клеток, что сопоставимо с аутонервной пластикой [9]. Интересные результаты продемонстрировали ученные из Китая, которые добились восстановления дефекта лицевого нерва крысы, используя аллотрансплантат артерии, с трансплантацией аутологичных ASCs. Результаты экспериментов подтвердили стимулирующее влияние ASCs на регенерацию нерва. Таким образом, трансплантация аутологичных ASCs представляет альтернативный подход для реконструкции дефектов лицевого нерва [10].
Исходя из вышеизложенного, стволовые клетки из жировой ткани благодаря своим уникальным свойствам, а именно простоте получения, возможности дифференцировки в различные клеточные типы, безопасности и эффективности трансплантации в организм человека в ближайшие годы могут стать одним из наиболее действенных способов лечения, позволяющего быстро и эффективно восстановить утраченные функции органов и тканей.
Благодарности
Работа частично поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований, государственным контрактом ФЦП 16.512.11.2101 Министерства образования и науки Российской Федерации, Научно-образовательным центром фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета, Министерством здравоохранения Республики Татарстан.
ЛИТЕРАТУРА
1. Fraser J., Wulur I. et al. // Differences in stem and progenitor cell yield in different subcutaneous adipose tissue depots // Cytotherapy — 2007. —9. — № 5. — P. 459-467.
2. Yoshimura K. // Supportive Use of Adipose-Derived Stem/Stromal Cells Kotaro Yoshimura, Katsujiro Sato, Noriyuki Aoi, Masakazu Kurita, Toshitsugu Hirohi, Kiyonori Harii // Aesth Plast Surg (2008) 32: 48-55.
3. Jurgens W., Oedayrajsingh-Varma M., Helder M. et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies // Cell Tissue Res. — 2008. — 332, № 3. — P. 415-426.
4. Baglioni S., Francalanci M., Squecco R. et al. Characterization of human adult stem cell populations isolated from visceral and subcutaneous adipose tissue // FASEB J. — 2009. — 23, № 10. — P. 3494-3505.
5. Ferro F., Spelat R., Falini G. et al. // Am J Pathol. 2011 May; 178 (5): 2299-310.
6. Dragoo J., Carlson G., McCormick F. et al. Healing full-thickness cartilage defects using adipose-derived stem cells // Tissue Eng. — 2007. — 13, № 7. — P. 1615-1621.
7. Wall M., Bernacki S., Loboa E. Effects of serial passaging on the adipogenic and osteogenic differentiation potential of adipose-derived human mesenchymal stem cells // Tissue Eng. — 2007. — 13, № 6. — P. 1291-1298.
8. Parrinello S., Napoli I., Ribeiro S. et al. // EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting // Cell. 2010 Oct 1; 143 (1): 145-55.
9. Scholz T., Sumarto A., Krichevsky A. // Neuronal differentiation of human adipose tissue-derived stem cells for peripheral nerve regeneration in vivo // Arch Surg. 2011 Jun; 146 (6): 666-74.
10. Sun F., Zhou K., Mi W.J. et al. // Repair of facial nerve defects with decellularized artery allografts containing autologous adipose-derived stem cells in a rat model // Neurosci Lett. 2011 Jul 20; 499 (2): 104-8. Epub 2011, May 30.
