CC BY
57
УДК 591.481.1:616-001-092.9.259:616.1/.9-055.5/.7-092]-085
Бшошицъкий В.В.1, Михалъсъкий С.А.2, Гридта Н.Я.3, Квтницъка-Рижова, Т.Ю.2, Педаченко С.Г.1
1 Вщдш травми центрально! нервово! системи, 1нститут нейрохiрургп iм. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра!ни, м. Ки!в, Укра!на
2 Лабораторiя морфологи i цитологи, 1нститут геронтологи iм. акад. Д.Ф. Чеботарьова НАМН Украши, м. Ки!в, Укра!на
3 Лабораторiя експериментально! нейрохiрургп, 1нститут нейрохiрургп iм. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украши, м. Ки!в, Украша
Структурно-функщональна характеристика пошкодження нейрошв гшокампа при експериментальнiй черепно-мозковiй трав]ш i геннiй терапií з використанням гену апо£3
Вступ. Дослiдженi морфолопчш змiни нейронiв гiпокампа та його функцюнальна характеристика за тяжко! черепно-мозково! травми (ЧМТ) в експериментi, оцшена терапевтична ефективнiсть генно! терапi!, спрямована на шдукцш синтезу у нервовш тканинi iзоформи е3 аполiпопроте!ну Е.
Матер1али 1 методи. Тяжку дифузну ЧМТ моделювали у щурiв шд загальним знеболенням шляхом вiльного падшня вантажу масою 450 г з висоти 1,5 м. Внутршньошлуночкову шфузш катiонних лiпосом DOTAP, що несли 25 мкг плазмщного вектору pCMV•SPORT6 з кДНК гену апоЕЗ, здшснювали за допомогою осмотичних помп ALZET.
Результати. Характерними ознаками тяжко! ЧМТ у щурiв е депопуляцiя нейрошв гшокампа, порушення його цитоархiтектонiки, значш змiни якiсних характеристик нейронiв, зокрема, збшьшення частки деструк-тивно-змiнених клггин. Це супроводжувалося вираженим когнiтивним дефщитом, що характеризувалося стiйкою антероградною амнезiею, а саме, зниженням в посттравматичному перiодi просторово! пам'ятi i здатност до навчання. Лiпосомальна трансфекцiя клггин головного мозку плазмiдним вектором, що несе ген iзоформи е3 апоЕ людини, сприяла зменшенню глибини та поширення вторинного пошкодження нейронiв гшокампа, збереженню його цитоархiтектонiки, бiльш швидкому регресовi посттравматичного когнiтивного дефiциту, вщновленню порушених функцiй.
Висновок. Генна терашя мае терапевтичний потенцiал за тяжко! ЧМТ.
Ключов1 слова: черепно-мозкова травма, гтокамп, ультраструктура, когттивт розлади, генна тератя, аполтопротегн Е, експеримент.
Черепно-мозкова травма (ЧМТ) е актуальною проблемою сучасно! медицини. В перюд 1999-2008 рр. в Укра!ш ЧМТ щороку виникала майже у 100 тис. потершлих. Частота внутршньочерепно! травми у 2008 р. становила 19,6 на 10 тис. населення [1].
ЧМТ може спричиняти рiзнi розлади психiчно1 сфери, що значною мiрою попршують яюсть життя потерпiлих. Навiть легка ЧМТ зумовлюе: 1) когнiтивнi порушення; 2) афективш розлади, до яких належать депреыя, тривожнiсть, психоз; 3) порушення поведш-ки, зокрема, змши особистостi. Когнiтивнi функцi!, в тому числ^ пам'ять, здатнiсть до навчання, пов'язують з таким надзвичайно чутливим до травматичного впливу вщдшом мозку, як гшокамп. Нейрокогнiтивнi розлади характерш для ЧМТ, !х спостерiгають у гос-трому перiодi травми у 40-50% потершлих. У багатьох з них когштивш порушення збермються протягом тривалого часу або постшно [2, 3]. Отже, лшувальш зусилля мають сприяти мiнiмiзацi! пошкодження та дисфункци гiпокампа [4].
Метою роботи було дослщження морфологiчних змiн нейронiв гшокампа та його функцюнально! характеристики за тяжко! ЧМТ в експеримент, а також терапевтично! ефективностi генно! терапи, спрямовано! на iндукцiю синтезу в нервовш тканиш iзоформи е3 аполшопротешу Е (АпоЕЗ означае бiлок, апоЕ3-ген).
Матер1али 1 методи дослщження. Дослщження проведене на дорослих (6-8 мгс) щурах-самцях лiнi!
Wistar (масою тша 350-400 г), якi розподiленi на 3 групи по 5 тварин.
- Контроль — група штактних тварин.
- ЧМТ — група тварин з тяжкою дифузною ЧМТ.
- ЧМТ+Пл — у тварин моделювали ЧМТ у такий самий споыб, як i в груш ЧМТ, i встановлювали в ль вий бiчний шлуночок мозку канюлю, яку з'еднували з встановленим шд шкiру резервуаром (осмотичною помпою ALZET), для внутршньошлуночково! iнфузiI протягом 1 доби катюнних лiпосом з плазмщним вектором, який нiс ген апоЕЗ.
Тяжку ЧМТ моделювали шляхом вшьного пад1ння вантажу масою 450 г з висоти 1,5 м. Моделювання експериментально! ЧМТ i вы подальшi маншуля-цН, пов'язанi з встановленням канюлi та введенням вщповщних розчинiв, здiйснювали пiд загальним знеболюванням кетамшом (з розрахунку 0,7 мг/кг маси тша, внутршньом'язово). Як лшувальний засiб використовували комплекс катiонних лшосом DOTAP Methosulfate (Sigma, США) i 25 мкг плазмiдного вектора pCMV- SPORT6 (Invitrogen, США), що мктив ген апоЕЗ людини, шд контролем цитомегаловiрусного промотору.
На 10-ту добу тварин виводили з експерименту шляхом внутршньочеревно! ш'екци розчину тюпен-тал-натрш (200 мг/кг). Головний мозок вилучали з порожнини черепа. Для шдтвердження ефективносл трансфекцiI вiддiляли мозочок i частину довгастого
© Бшошицький В.В., Михальський С.А., Гридша Н.Я., Квггницька-Рижова Т.Ю., Педаченко 6.Г., 2012
Рис. 1. ЛЩН СА1 зони ппокампа rnypÍB з огляду на 'ix яюсну характеристику.
мозку, яю вмiщували у рщкий азот для подальшого RT-PCR-дослiдження.
Електронно-мшроскотчне дослiдження. Тонкi фронтальнi зрiзи (0,5 мм) з дшянки гiпокампа фшсу-вали у 2,5% розчинi глутаральдепду протягом 6 год при температурi 4°С. Шматочки промивали у фосфатному буферi (pH 7,4) протягом 2 год i дофшсовували протягом 2 год в 1% розчиш OsO4 на фосфатному буферi (pH 7,4). Подальше зневоднення у спиртах (70% етанол м^тив 2% ураншацетату) та ацетонi, а також заливання в смолу (епон-аралдит) здшснювали за загальноприйнятою методикою. Виготовляли фрон-тальш напiвтонкi зрiзи (1 мкм) дшянки ппокампа, яю фарбували толу'диновим сишм. Ультратонкi зрiзи (60-70 нм) контрастували у 2% розчиш ураншацетату й цитрату свинцю, дослщжували пiд електронним мшроскопом ПЕМ-125К («Selmi», Укра'на) за приско-рювально! напруги 60 кВ.
Ггётолопчне та морфометричне дослiдження. На нашвтонких зрiзаx з використанням свгглооптичного мiкроскопа Axiolab (Carl Zeiss, Шмеччина) аналiзували цитоарxiтектонiку гiпокампа, обчислювали лшшну щiльнiсть нейронiв (ЛЩН), тобто, юльюсть клiтин на одиницю довжини зони СА1 ппокампа (у 100 полях зору, об'ектив х20, окулярх10).
Нейрофiзiологiчне дослiдження. Порушення когнiтивниx функцiй при експериментальнш ЧМТ ви-являли шляхом оцшки просторово' пам'ятi у водному лабiринтi Морiса з 7-'i до 10-'i доби пiсля травми. Разом виконували 16 «тренувань» щурiв (по 4 «тренування» на день), шд час яких тварини навчалися знаходити платформу, приховану шд поверхнею забарвлено' води, покладаючись на зовнiшнi вiзуальнi орieнти-ри. У кожний день дослщження для кожного щура визначали «час пошуку», середнiй для 4 «тренувань» (у секундах), витрачений твариною на досягнення платформи. На пiдставi цих даних визначали середнш «час пошуку» у кожнш групi експерименту в конк-ретний день дослiдження. Збшьшення «часу пошуку» свiдчило про бшьший дефiцит просторово' пам'ятi i здатносл до навчання.
Статистичну обробку даних проводили з ви-користанням непараметричного методу Вшкоксо-на-Манна-У'iтнi (Рц).
Результати та Чх обговорення. Ефективнiсть трансфекцп (наявшсть апоЕ3-мРНК) пiдтверджена у зразках мозку bcíx тварин, яким вводили плазмщний вектор, шляхом вiзуалiзацií продуктiв амплiфiкацií (вiдповiдно 295 i 180 п.н. для першо! та друго! пар використаних праймерiв) у методi RT-PCR.
За даними гiстологiчного дослiдження, тяжка ди-фузна ЧМТ у щурiв, вiдтворена за допомогою «моделi ударного прискорення», на 10-ту добу характеризу-валася порушенням цитоархiтектонiки гiпокампа, особливо вразливого при ЧМТ, що е морфологiчним субстратом когнiтивних розладiв за травматичного ураження головного мозку. У СА1 зош ппокампа вщ-значеш дiлянки «випадiння» нейронiв, тобто, спостерь гали депопуляцiю нейронiв гiпокампа. При визначенш ЛЩН встановлене значне зменшення показника — в 1,4 разу (рис. 1). Видшяли кiлька тишв нейронiв зони СА1 — незмшеш, великi (гiпертрофованi) i гшерхромш. Кiлькiсть великих нейронiв була стабшьною, незалежно вiд експериментально! групи. Гшерхромш нейрони часто локалiзувалися не тшьки серед не-змiнених, а й окремими групами значно! довжини. Найбшьш показовою була змiна ЛЩН гшерхромного типу. Припускаемо, що основну частку цих нейрошв становлять змiненi внаслщок шемп клiтини. Показано, що ЧМТ впливае на змшу розподiлу клггин видiлених нами типiв — збшьшуеться кiлькiсть гiперхромних i зменшуеться — незмшених нейронiв.
Результати електронномiкроскопiчного дослщ-ження також свiдчать, що при ЧМТ вщбуваються значнi деструктивнi змши в зонi СА1 гiпокампа. Видь ленi на свiтлооптичному рiвнi незмшеш й гшерхромш нейрони (рис. 2) виявилися гетерогенними за сво!м складом. Серед гшерхромних (електроннощшьних) нейронiв вщзначали як апоптотично-змiненi клiтини, що гинуть (див. рис. 2, верхнш лiвий кут), так i акти-воваш (див. рис. 2, праворуч, посередиш). Нерiдко в ядрах нейронiв мютилися фiбрилярнi включення (рис. 3, лiве фото), що може свiдчити про глибоку перебу-дову бiлкiв ядра i початок необоротних деструктивних процеав у ядрг
У цитоплазмi нейрошв спостершали вакуолiзацiю цистерн апарата Гольдж^ серйозних змiн зазнавали миохондрп. Шд час аналiзу ушкодження мiтохондрiй встановлено, що шсля травми переважна частина деструктивно-змшених органел значно набряклi (ва-куолiзованi, з деструкцiею i дискомплексащею крист — див. рис. 3) або у початкових стадiях деструкцп. Виявляли велику кiлькiсть гiпертрофованих мгго-
Рис. 2. Електронограма. Дiлянка CA1 зони ппокампа дорослого щура шсля ЧМТ. Гетерогеншсть морфолопчних змш, 3 з 10 нейронiв — електронно-щiльнi, деструктивно-змiненi. Зб.х1600.
.£1: 4 4 '
з, ^ • <7
Рис.3. Електронограма. Деструктивш змiни в нейронах СА1-зони гiпокампа. А — нейрон шрамщального шару з включенням (позначене стршкою) у карiоплазмi та великою юльюстю набряклих мiтохондрiй у цитоплазмi. Зб.х6400; Б — дiлянка цитоплазми нейрона шрамщального шару, що мiстить юлька гранул лiпофусцину (позначенi трикутниками), поряд з вакуолiзованими мiтохондрiями та дещо набряклими каналь-цями ендоплазматично! мережi та комплексу Гольджi. Зб.х9600.
хондрш, в деяких з них локальш або тотальнi де-структивнi змши. Деякi мiтохондрi! з ушкодженими мембранами, залишки !х включенi у залишковi тiльця та гранули лiпофусцину, юльюсть яких значно збшь-шувалась — вщ 1-4 гранул — у контролi до 10 i бшьше — при ЧМТ. Збiльшувалися i розмiри окремих гранул. Значна юльюсть зруйнованих миохондрш свiдчила не тшьки про порушення енергозабезпечення клiтин, а й про активацш процесiв !х загибелi.
За даними морфометричних дослщжень, опубль кованих нами ранiше [5], юльюсть деструктивно-змь нених мiтохондрiй при ЧМТ збшьшуеться у десятки разiв у порiвняннi з такою у контроле У групi ЧМТ спостертали зменшення кiлькостi активованих мгто-хондрш — незмiнених i помiрно набряклих i збшьшен-ня кiлькостi рiзко набряклих, у початкових стадiях деструкцп мембран i вакуолiзованих форм.
При застосуванш генно! терапi! (група ЧМТ+Пл) вщзначеш менша iнтенсивнiсть та поширення спри-чинених ЧМТ деструктивно-дистрофiчних змш у нейронах. Iндукцiя синтезу АпоЕЗ справляла позитивний вплив на ЦНС i запобiгала утворенню зон вторинно! дезiнтеграцi! у травмованому мозку. У цитоплазмi нейронiв кiлькiсть деструктивно-змшених миохон-дрiй менша, нiж у тварин з ЧМТ, яким проводили терапш, вщповщно 55 i 70%. Як свщчили результати якiсного аналiзу структурних змiн мiтохондрiй [5], шд впливом генно! терапi! не лише зменшуеться тяжюсть деструкцi!, а й змшюеться спiввiдношення органел, що перебувають у рiзному функцiональному станi, тобто, в груш ЧМТ+Пл спостертали деяке збшьшення юль-костi незмiнних та функционально активних (помiрно набряклих) органел i зменшення кiлькостi деструктив-но-змшених форм — рiзко набряклих, у початкових стадiях деструкцi! мембран i вакуолiзованих.
Як встановлено нами рашше [6], при ЧМТ глибокi ультраструктурш змiни вiдбувалися не лише в перь карiонах, а й у вщростках нервових клiтин. Вiдзначене пошкодження бшьш нiж 33% мiелiнових волокон. Характерною реакщею е пошкодження аксошв у виглядi !х локального набряку, деформацп осьового цилiндра, його облгтерацп, а в деяких спостереженнях — вщ-шарування вiд мiелiново! оболонки. При цьому досить часто спостермли вираженi порушення самих мiелi-нових оболонок у виглядi розшарування, дезагрегацп, порушення ламелярно! структури, формування здут-тiв i випинань. Це супроводжувалося дезштегращею,
гомогенiзацiею i деструкщею внутрiшньоклiтинних структур нейритiв. Спостерiгали виражене ушкодження нейрофшаменив, локальну, рiдше повну втрату мшротрубочок, що спричиняло порушення аксонального транспорту. Змши миохондрш аксонiв були аналопчш таким у тiлах нейронiв. Крiм того, вiдзначали деструктивнi змiни деяких си-напсiв.
При застосуваннi плазмщно-го вектору, що мiстить ген апоЕ3 (група ЧМТ+Пл), вiдзначенi менша штенсившсть та поширення деструктивно-дистрофiчних змiн, спричинене ЧМТ. ЛЩН знижува-лася менше (в 1,2 разу), шж у не-лiкованих тварин, дещо полшшувався якiсний склад популяцп нейронiв — меншою мiрою збшьшувалася кiлькiсть вакуолiзованих i гiперхромних нейрошв (див. рис. 1). Виявлене нами зменшення юлькосл нейронiв при ЧМТ лсно пов'язане з процесами апоптозу, яю, ймовiрно, за даними лиератури [4], вiдбуваються в першi дш пiсля травми. Структура аксонiв у груш ЧМТ+Пл була пошкоджена меншою мiрою, шж у тварин групи ЧМТ. Нормалiзувалися структура осьового цилшдра, його цитоскелет (мiкротрубочки, нейрофiламенти), миохондрп, структура мiелiнових оболонок. Рiдше виявляли набряк i деформацiю ак-сошв. Пошкодженi мiелiновi волокна спостерiгали з частотою 22%, у груш ЧМТ — 35% [6].
Оцшка впливу генно! терапп на динамшу розладiв просторово! пам'ятi у щурiв з ЧМТ (рис. 4) свщчи-ла, що в груш Контроль «час пошуку» платформи у посттравматичному перiодi швидко зменшувався. Вже у перший день дослщження у водному лабiринтi Морюа (7-ма доба пiсля травми) вщзначали достовiрнi розбiжностi «часу пошуку» платформи: в груш ЧМТ — (86,4±5,41) с, в груш Контроль — (69,2±3,56) с (Р=0,009). Така рiзниця зумовлена тим, що в груш Контроль щури швидше знаходили платформу вже шд час 3-го i 4-го «тренування» у перший день до-слiдження. У групi ЧМТ «час пошуку» зменшувався бшьш повшьними темпами, i в усi строки спостере-ження достовiрно перевищував аналопчний показник у групi Контроль — (74,2±4,32) та (17,2±3,27) с — на
8-му добу (Р=0,009); (64,2±4,21) та (16,2±2,49) с — на
9-ту добу (Р=0,009); (61,2±4,32) та (9,6±2,41) с— на
10-ту добу шсля травми (Р=0,009). У груш ЧМТ+Пл трансфер гену АпоЕ3 сприяв бшьш швидкому рег-ресовi когштивних порушень, зокрема, зменшенню дефiциту просторово! пам'ят i здатностi до навчання. На 8-му добу експерименту «час пошуку» в дослщнш груш становив (49,0±6,21) с, в груш ЧМТ — (74,2±4,32) с (Р=0,009); на 9-ту добу — вщповщно (34,8±3,96) с та (64,2±4,21) с (Р=0,009); на 10-ту добу — (30,2±3,96) та (61,2±4,32) с (Р=0,009).
Шд час розробки методiв експериментально! нейротравматологп накопиченi данi, якi свiдчать, що деяю вiддiли мозку «вибiрково вразливЬ» при травматичному ушкодженнi. Встановлено, що не лише за дифузного, а й за суворо локального пошкодження кори великого мозку через деякий час шсля ЧМТ
100
о -I-,-,-,-
7 8 9 10
Доба експерименту
—#—Контроль -■—ЧМТ —а— ЧМТ+Пл
Рис. 4. Вплив лшосомально! трансфекцп плазмщ-ним вектором, що несе ген АпоЕЗ, на динамшу ког-нiтивного дефiциту у щурiв з експериментальною ЧМТ (рiзниця показниюв достовiрна у порiвняннi з такою: * — в груш ЧМТ, # — в груш Контроль).
спостершали загибель нейрошв на значнш вщсташ вiд мiсця первинно! травми.
Зручним об'ектом дослiдження вибiрково вразли-вих при ЧМТ вiддiлiв мозку е гiпокамп, депопуляцiя нейронiв якого е чггким критерiем тяжкостi травми як в експериментальних тварин, так i в людини [7, 8]. Незважаючи на те, що мехашчний вплив на гiпокамп значно менший, нiж на кору великого мозку, гшокамп зазнае суттевого пошкодження, в тому чи^ загибелi клiтин [4], тривалого електрофiзiологiчного порушення [9], виявляли ознаки реактивного глюзу [10]. У свою чергу, застосування методiв лшування, що сприяють зменшенню загибелi нейрошв гшокампа, полiпшуе функцiональнi наслiдки травми як в експерименл, так i в клiнiцi [11].
Роль гшокампа в засвоенш шформацп та пам'ял доведена. При пошкодженнi ц}е! структури виявляють неспроможнiсть формувати короткотермiнову пам'ять та втрату здатност до навчання, орiентацil в про-сторi. За даними експериментальних дослщжень, при пошкодженнях гiпокампа виявлений функцiональний дефiцит, що нагадуе такий у потерпших з ЧМТ. Гшокамп е також м^цем регуляцп негативного оберненого зв'язку оа гiпоталамус - гiпофiз - наднирковi залози та контролю циркуляцп глюкокортиковдв. Отже, наслiдками пошкодження гшокампа е не тшьки порушення пам'ял. Вважають, що при зменшенш об'ему гiпокампа пiдвищуеться ризик виникнення депресп, посттравматичних стресових розладiв i шизофренп [12]. Отже, запорукою усшшного лiкування ЧМТ е можливiсть зменшити вираженiсть структурного пошкодження гiпокампа i вiдповiдних порушень його функцiй [4].
Оскшьки в усiх моделях ЧМТ первинне пошкодження кори великого мозку в м^щ травматичного впливу спричиняе не менш суттеве, а у функцюналь-ному плаш — бшьш значуще ураження гiпокампа, вчеш стверджують, що питання: «Чому нейрони гь покампа такi вразливi?» е одшею з фундаментальних загадок сучасно! нейротравматологп [12].
Вiдповiддю на це запитання може бути рiзна чутливють до мехашчно'^ деформацп або особливосл бiохiмiчноl вiдповiдi на пошкодження, притаманно! рiзним вiддiлам головного мозку [13]. Щодо чутли-
восл до мехашчно! деформацп, значення можуть мати розмiри клiтин, щiльнiсть, CTyniHb зв'язностi та структура цитоскелету. Зокрема, показано, що велию та не щшьно «упаковаш» клiтини гiпокампа бiльш схильнi до ураження мехашчною ударною хвилею [14]. При вивченш чутливостi нейронiв кори великого мозку i гiпокампа до мехашчного розтягування in vitro доведено, що, незважаючи на бшьш тривале збшьшення проникносл мембран у нейронах кори, у нейронах гшокампа значно бшьша концентращя внутрiшньоклiтинного Ca2+ та бшьш часта загибель клиин [13]. У цьому ж дослщженш виявлеш реГю-нарнi особливостi бiохiмiчних змш у пошкоджених нейронах. Зокрема, в нейронах гшокампа шсля ЧМТ спостершали вiдстрочений та тривалий дефiцит АТФ, що може пояснювати бiльшу частоту загибелi клiтин, тодi як у нейронах кори вш виникае у ранш строки i менш тривалий. З одного боку, дефщит АТФ може бути зумовлений бшьшим навантаженням нейрошв гшокампа кальщем, з шшого — гiперактивацiGЮ Na+/K+-АТФази, оскiльки доведено, що селективна деполяризащя в гшокамш пiсля ЧМТ залежить вiд дисфункцп Na+/K+-АТФази i долаеться пiдвищенням активносл АТФ.
Ще однiею причиною вразливост гiпокампа при ЧМТ можуть бути особливосл його будови. Вiн складаеться з шести регюшв, що мають цiлком рiзну цитоархiтектонiку i пов'язаш унiкальними непрямими проекцiйними шляхами [15]. Життево важливi сина-птичнi зв'язки мiж вiддiлами гiпокампа можуть бути його «Ахшесовою п'ятою», оскiльки пошкодження одного вщдшу здатне спричиняти ураження шших через нестачу трофiчних чинниюв або гiперактивнiсть збудливих глутаматергiчних проекцш [12].
Також суттевою е рiзниця вразливостi рiзних популяцiй клiтин у межах гшокампа. СА1 вщдш надзвичайно чутливий до шдуковано! глутаматом ексайтотоксичност та глобально! шемп, дiлянки СА3 вщдшу та гiлуса (hilus) вважають чутливими до травматичного впливу [16, 17].
Невролопчш наслщки ЧМТ залежать не тшьки вщ поширення первинного пошкодження головного мозку, а й вторинних нейрохiмiчних i патофiзiоло-пчних змiн, що вiдбуваються внаслiдок мехашчно! травми i спричиняють подальше ураження головного мозку й формування функционального дефщиту. В ос-новi вторинного пошкодження мозку лежать декшька механiзмiв загибелi нервових клiтин, зокрема, некроз, апоптоз або поеднання цих механiзмiв [4, 18, 19]. Проте, !х непроста взаемодiя значно ускладнюе визначення, який саме з шляхiв загибелi клиин мае стати пер-шочерговою мшенню терапi! при ЧМТ. Припускають, що розшзнавання шляхiв смертi клiтин сприятиме розробЦ нових методiв лiкування, здатних впливати на рiзнi компоненти каскаду вторинного пошкодження головного мозку [20, 21].
У нашому дослщженш частота загибелi нейрошв гшокампа зменшувалась внаслщок застосування генно! терапi!, спрямовано! на шдукцш синтезу у нервовiй тканиш iзоформи 83 АпоЕ. Пiсля ЧМТ АпоЕЗ сприяе репарацi! лiпiдного компоненту мембран нейрошв i глiоцитiв, забезпечуючи транспорт холестерину й фос-фолшвдв пiд час реiннервацi! [22], модифшуе запальнi реакцi! активовано! мiкроглi! в головному мозку, захи-щае нервовi клiтини вiд ексайтотоксичного ураження
[23]. Можливими мехашзмами, за допомогою яких АпоЕЗ обмежуе структурш прояви i функцiональнi на-слiдки ЧМТ, е вплив на нейрогенез, запальну вiдповiдь, процесинг Aß, метаболiзм нейронiв [24]. Дослiдження останшх рокiв свiдчать про антиапоптознi властивосл АпоЕЗ [25]. Зважаючи на зазначене, закономiрною е гiпотеза про доцшьшсть використання АпоЕЗ як те-рапевтичного агента, здатного справляти лшувальний влив. Актуальним е пошук методiв доставки АпоЕЗ до вогнищ ураження [26]. За нашими даними, одним з таких метод1в може бути генна терашя.
Висновки. 1. Характерними ознаками тяжко! ЧМТ у щурiв е депопулящя нейронiв гiпокампа, по-рушення його цитоархiтектонiки, а також значш змiни якiсних характеристик нейронiв, зокрема, збшьшення кiлькостi деструктивно-змiнених клiтин. Це супро-воджуеться вираженим когнiтивним дефщитом, що характеризуеться стiйкою антероградною амнезiею, а саме, зниженням в посттравматичному перiодi про-сторово! пам'ятi та здатносл до навчання.
2. Застосування лшосомально! трансфекцi! клiтин головного мозку плазмщним вектором, що несе ген iзоформи е3 апоЕ людини, сприяе зменшенню глиби-ни та поширення вторинного пошкодження нейронiв гiпокампа, збереженню його цитоархiтектонiки, бiльш швидкому регресовi посттравматичного когнiтивного дефiциту й вщновленню порушених функцiй.
Список лiтератури
1. Лехан В.М. Особливост1 етдемюлогп черепно-мозково! травми в Укра!ш / В.М. Лехан, А.П. Гук // Укра!на. Здоров'я наци. — 2010. — №2. — С.7-14.
2. Magnesium attenuates post-traumatic depression/anxiety following diffuse traumatic brain injury in rats / L. Fromm, B. Pharm, D.L. Heath [et al.] // J. Am. Coll. Nutr.
— 2004. — V.23, N5. — P.529-533.
3. Greve K.W. The Booklet Category Test and malingering in traumatic brain injury: classification accuracy in known groups / K.W. Greve, K.J. Bianchini, T. Roberson // Clin. Neuropsychol. — 2007. — V.21. — P.318-237.
4. Effect of post-traumatic mild hypothermia on hippocampal cell death after traumatic brain injury in rats / F. Jia, Q. Mao, Y.M. Liang [et al.] // J. Neurotrauma. — 2009. — V.26.
— P.243-252.
5. Бшошицький В.В. Структурш змши мггохондрш кл1тин гшокампа при експериментальнш черепно-мозковш травм1 та геннш терапп з використанням гену апоЕЗ / В.В. Бшошицький, С.А. Михальський, Т.Ю. Квггни-цька-Рижова // В1сн. морфологи. — 2011. — Т.17, №2.
— С.238-244.
6. Бшошицький В.В. Вплив лшосомально! трансфекцп кл1тин головного мозку геном апоЕЗ на пошкодження аксошв, зумовлене експериментальною черепно-мозко-вою травмою / В.В. Бшошицький, С.А. Михальський, Т.Ю. Квггницька-Рижова // Укр. нейрох1рург. журн.
— 2011. — №3. — С.43-49.
7. Progressive atrophy and neuron death for one year following brain trauma in the rat / D.H. Smith, X.H. Chen, J.E.S. Pierce [et al.] // J. Neurotrauma. — 1997. — V.14.
— P.715-727.
8. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects / D.H. Smith, H.D. Soares, J.S. Pierce [et al.] // J. Neurotrauma. — 1995.
— V.12. — P.169-178.
9. Traumatic brain injury impairs synaptic plasticity in hippocampus in rats / B. Zhang, X. Chen, T. Tan [et al.] // Chin. Med. J. — 2011. — V.124, N5. — P.740-745.
10. Sofroniew M.V. Reactive astrocytes in neural repair and protection / M.V. Sofroniew // Neuroscientist. — 2005.
— V.11. — P.400-407.
11. Protective effects of glial cell line-derived neurotrophic factor on hippocampal neurons after TBI / B.-T. Kim, V.L.R. Rao, K.A. Sailor [et al.] // J. Neurosurg. — 2001.
— V.95, N4. — P.674-679.
12. McCarthy M.M. Stretching the truth. Why hippocampal neurons are so vulnerable following traumatic brain injury / M.M. McCarthy // Exp. Neurol. — 2003. — V.184.
— P.40-43.
13. Geddes D.M. Susceptibility of hippocampal neurons to mechanically induced injury / D.M. Geddes, M.C. LaPlaca, R.S. Cargill // Exp. Neurol. — 2003. — V.184.
— P.420-427.
14. Instantaneous perturbation of dentate interneuronal networks by a pressure wave-transient delivered to the neocortex / Z. Toth, G.S. Hollrigel, T. Gorcs, I. Soltesz // J. Neurosci. — 1997. — V.17. — P.8106-8117.
15. Harry G.J. Dentate gyres: alteration that occur with hippocampal injury / G.J. Harry, C.L. d'Hellencourt // NeuroToxicology. — 2003. — V.24. — P.343-356.
16. Selective vulnerability of dentate hilar neurons following traumatic brain injury: a potential mechanistic link of between head trauma and disorders of the hippocampus / D.H. Lowenstein, M.J. Thomas, D.H. Smith, T.K. McIntosh // J. Neurosci. — 1992. — V.12. — P.4846-4853.
17. Nawashiro H. Selective vulnerability of hippocampal CA3 neurons to hypoxia after mild concussion in the rat / H. Nawashiro, K. Shima, H. Chigaskai // Neurol. Res. — 1995.
— V.17. — P.258-269.
18. From cell death to neuronal regeneration: building a new brain after traumatic brain injury / N.C. Royo, J.W. Schouten, C.T. Fulp [et al.] // J. Neuropathol. Exp. Neurol.
— 2003. — V.62, N8. — P.801-811.
19. Stoica B.A. Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury / B.A. Stoica, A.I. Faden // Neurotherapeutics. — 2010. — V.7, N1. — P.3-12.
20. Faden A.I. Neuroprotection and traumatic brain injury: theoretical option or realistic proposition / A.I. Faden // Curr. Opin. Neurol. — 2002. — V.15. — P.707-712.
21. Faden A.I. Neuroprotection and traumatic brain injury: the search continues / A.I. Faden // Arch. Neurol. — 2001.
— V.58. — P.1553-1555.
22. Poirier J. Apolipoprotein E in animal models of CNS injury and in Alzheimer's disease / J. Poirier // Trends Neurosci.
— 1994. — V.17, N12. — P.525-530.
23. Laskowitz D.T. Apolipoprotein E and neurological disease: Therapeutic potential and pharmacogenomic interaction / D.T. Laskowitz, M.P. Vitek // Pharmacogenomics. — 2007.
— V.8, N8. — P.959-969.
24. Apolipoprotein E-genotype dependent hippocampal and cortical responses to traumatic brain injury / F. Crawford, M. Wood, S. Ferguson [et al.] // Neuroscience. — 2009.
— V.159. — P.1349-1362.
25. Apolipoprotein E-containing lipoproteins protect neurons from apoptosis via a signaling pathway involving low-density lipoprotein receptor-related protein-1 / H. Hayashi, R.B. Campenot, D.E. Vance, J.E. Vance // J. Neurosci. — 2007. — V.27, N8. — P.1933-1941.
26. Teasdale G.M. Craniocerebral trauma: protection and retrieval of the neuronal population after injury / G.M. Teasdale, D.I. Graham // Neurosurgery. — 1998. — V.43, N4. — P.723-738.
Надшшла до редакцгг 24.03.12 Прийнята до публтацИ 17.05.12 Адреса для листування:
Бшошицький Вадим Васильович 04050, Кигв, вул. Платона Майбороди, 32 1нститут нейрохiрурггi iM. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украгни, вiддiл травми центральног нервовог системи e-mail: headinjury@ukr.net
Белошицкий В.В.1, Михальский С.А.2, Гридина Н.Я.3, Квитницкая-Рыжова Т.Ю.2, Педаченко Е.Г.1
1 Отдел травмы центральной нервной системы, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, г. Киев, Украина
2 Лаборатория морфологии и цитологии, Институт геронтологии им. акад. Д.Ф. Чеботарева НАМН Украины, г. Киев, Украина
3 Лаборатория экспериментальной нейрохирургии, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины,
г. Киев, Украина
Структурно-функциональная характеристика повреждения нейронов гиппокампа при экспериментальной черепно-мозговой травме и генной терапии с использованием гена апоЕЗ
Вступление. Изучены морфологические изменения нейронов гиппокампа и его функциональная характеристика при тяжелой черепно-мозговой травме (ЧМТ) в эксперименте, а также терапевтическая эффективность генной терапии, направленной на индукцию синтеза в нервной ткани изоформы еЗ аполипопротеина Е.
Материалы и методы. Тяжелую ЧМТ моделировали у крыс под общим обезболиванием путем свободного падения груза массой 450 г с высоты 1,5 м. Внутрижелудочковую инфузию катионных липо-сом DOTAP, несущих 25 мкг плазмидного вектора pCMV-SPORT6 с кДНК гена апоЕЗ, осуществляли с помощью осмотических помп ALZET.
Результаты. Характерными признаками тяжелой ЧМТ в эксперименте были депопуляция нейронов гиппокампа, нарушения его цитоархитектоники, в частности, увеличение количества деструктивно-измененных клеток. Это сопровождалось выраженным когнитивным дефицитом, что характеризовалось стойкой антероградной амнезией, а именно снижением в посттравматическом периоде пространственной памяти и обучаемости. Липосомальная трансфекция клеток головного мозга плазмидным вектором, несущим ген изоформы еЗ апоЕ человека, способствовала уменьшению глубины и распространенности повреждения нейронов гиппокампа, сохранению его цитоархитектоники, более быстрому регрессу посттравматического когнитивного дефицита, восстановлению нарушенных функций.
Вывод. Генная терапия обладает терапевтическим потенциалом при лечении тяжелой ЧМТ.
Ключевые слова: черепно-мозговая травма, гиппокамп, ультраструктура, когнитивные расстройства, генная терапия, аполипопротеин Е, эксперимент.
Поступила в редакцию 24.03.12
Принята к публикации 17.05.12
Адрес для переписки:
Белошицкий Вадим Васильевич 04050, Киев, ул. Платона Майбороды, 32 Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины,
отдел травмы центральной нервной системы e-mail: headinjury@ukr.net
Biloshytsky V.V.1, Mikhalsky S.A.2, Gridina N.Ya.3, Kvitnytska-Ryzhova T.Yu.2, Pedachenko E.G.'
1 Neurotrauma Department, Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov NAMS Ukraine, Kiev, Ukraine
2 Laboratory of Morphology and Cytology, Institute of Gerontology named after D.F. Chebotaryov NAMS Ukraine, Kiev, Ukraine
3 Laboratory of Experimental Neurosurgery, Institute of Neurosurgery named after A.P. Romodanov NAMS Ukraine, Kiev, Ukraine
Structural and functional characteristic of hippocampal neuronal damage after experimental traumatic brain injury and apoE3 gene therapy
Introduction. The purpose of the study was to estimate the neuronal morphologic changes in hippocampus and its functional characteristics after experimental severe traumatic brain injury (TBI), and the possibilities of such disorders correction by means of gene therapy that launches the synthesis of 83 isoform of apolipoprotein E in brain tissue.
Materials and methods. Severe diffuse TBI in rats was modeled under overall anesthesia by free load weighing 450 g, falling from a 1.5 m elevation. The mixture of DOTAP liposome and 25 ^g of plasmid vector pCMV- SPORT6 with cDNA of apoE3 gene was infused intraventricularly using ALZET osmotic pumps.
Results. Severe TBI is characterized by the neuronal depopulation of hippocampus, damage to its cyto-architectonics with considerable changes of neuronal qualitative characteristics including the increased proportion of destructively changed cells. It is accompanied by profound cognitive deficits, particularly persistent anterograde amnesia which is characterized by post-traumatic decrease of spatial memory and learning. The liposome-mediated brain tissue transfection with plas-mid vector carrying the gene of 83 isoform of apolipo-protein E diminishes the depth and extent of secondary injury of hippocampal neurons, preserves hippocampal cytoarchitectonics and facilitates the speedy recovery of posttraumatic cognitive deficits.
Conclusion. Gene therapy has therapeutic potential in treatment of severe TBI.
Key words: traumatic brain injury, hippocampus, ultrastructure, cognitive disorders, gene therapy, apolipoprotein E, experiment.
Received March 24, 2012 Accepted May 17, 2012
Address for correspondence:
Vadym Biloshytsky 04050, 32 Platon Mayboroda St, Kiev, Ukraine Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov NAMS Ukraine,
Neurotrauma Department e-mail: headinjury@ukr.net
Коментар
до статт Бшошицького В.В. та спiвавторiв «Структурно-функцiональна характеристика пошкодження нейронiв гiпокампа при експериментальшй черепно-мозковiй травмi i геннiй терапп з використанням гену апоЕЭ»
Представлена стаття е фрагментом тривалого експериментального дослщження, результати якого автори продовжують публiкувати у серií робiт. Актуальшсть теми не викликае сумнiвiв, оскшьки черепно-мозкова травма (ЧМТ) створюе для сус-пiльства серйозний тягар медико-сошальних та еко-номiчних проблем. Автори зосереджують увагу на змiнах такого чутливого до травми вщдту головного мозку, як ппокамп, i зумовленому цими змшами посттравматичному функцюнальному дефiцитi. З метою корекцií порушень автори пропонують застосування аполiпопротеíну Е, синтез якого в ^тинах травмо-ваного головного мозку збiльшуеться тд впливом генноí терапií. Одержанi результати заслуговують на увагу, оскiльки перебувають у руслi сучасного пошуку ефективних методiв лiкування, спрямованих на зменшення вираженостi наслiдкiв ЧМТ в клЫчних умовах. Позитивною рисою е детальне патогенетичне пояснення змш, якi вщбуваються внаслiдок травми, а також обфунтування лiкувального ефекту аполЬ попротеíну Е. В робот наведенi цiкавi дан л^ера-тури щодо сучасного уявлення про патогенез ЧМТ. Так, обговорюючи результати власних дослщжень та ствставляючи |'х з новими даними л^ератури, автори звертають увагу на деяк принциповi положення сучасноí нейротравматологií.
1. У головному мозку, незалежно вщ тяжкост травми, е «вибiрково вразлив^> вiддiли, якi можуть локалiзуватися на вщдаленш вiд зони травми.
2. Через 10 дiб пiсля ЧМТ в головному мозку змен-шуеться кiлькiсть нейронiв як у вогнищi забою, так i в шших дiлянках, що можна пов'язати та пояснити лише формуванням вторинних тслятравматичних порушень як в ЦНС, так i в органiзмi в цтому.
3. За даними електронномiкроскопiчних дослщ-жень на 10-ту добу тсля ЧМТ виявляють пошкодження не лише нейроци^в, а й Тх вщростюв i особливо мiелi-нових оболонок, а отже, i олiгодендроцитiв, а також синапав. Тобто, пaтологiчний процес поширюеться
не тiльки на нейрони, як тiсно залежать вiд ппокси та функцií тканинного дихання, а й на шин клiтини та структури, зокрема, мiелiновi оболонки .
4. Звернута увага на роль ппокампа у патоге-незi ЧМТ та и нaслiдкiв. Сьогоднi немае пояснень, чому така структура, як ппокамп, розташована на великiй вщсташ вiд зони травми, зазнае значних змш тсля травми, та чому не весь ппокамп, а лише одна його дшянка. Автори припускають, що провщну роль у пошкодженш ппокампа в^грае мехашчний чинник, проте, тодi чому не всього, а лише одше^ зони. Можливо, тут е й шин пояснення, як треба дослiджувaти.
Нaведенi новi даш про ЧМТ доповнюють наши уявлення про и патогенез, вaжливiсть вивчення не лише зони забою, а й шших дтянок головного мозку. Отримаш даш стосуються перюду до Юч доби пiсля травми та поширення пошкодження практично на весь головний мозок, вони дозволяють ще раз гово-рити про ПОСТТРАВМАТИЧНУ ХВОРОБУ, яку вивчали у 80-т роки минулого стол^тя тд керiвництвом акад. А.П. Ромоданова. Причин таких поширених змш структури тканини мозку може бути багато, починаючи з оксидантного стресу i до апоптозних та iмунних чинниюв. Все це мае важливе значення для кл^чно: практики, а саме, патогенетично-обгрун-гавано! терапп, яка мае бути спрямована не лише на раннш перюд ЧМТ, а й на вторинш пaтологiчнi реакци та профiлaктику вторинного пошкодження мозку. З шею метою використано генну конструкшю з апоЕЗ, яка сприяла корекцп порушень тсля ЧМТ. На жаль, автори не видтили первинний мехашзм дií апоЕЗ, а лише вщзначили його полiфункцiонaльнiсть, це завдання подальших дослiджень з використанням шших методiв.
Одержaнi результати i сформульовaнi авторами положення обгрунтоваш посиланнями на сучaснi дaнi л^ератури, що представляе певний iнтерес для нейрохiрургiв.
М.1. Лсяний, член-кор. НАМН Укра/ни, професор, завдувач вддлу нейро/мунолоп/ 1нституту нейрох/рургп ¡м. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра/ни
