CC BY
84
УДК 577.2
Структура димера трансмембранного домена гликофорина А в окружении липидов и детергентов
К. С. Минеев, Э. В. Бочаров*, П. Е. Волынский, М. В. Гончарук, Е. Н. Ткач, Я. С. Ермолюк,
А. А. Шульга, В. В. Чупин, И. В. Масленников, Р. Г. Ефремов, А. С. Арсеньев Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 *E-mail: bon@nmr.ru Поступила в редакцию 24.02.2011 г.
РЕФЕРАТ Специфические взаимодействия между трансмембранными а-спиралями во многом определяют биологическую функцию мембранных белков при нормальном развитии организма и в его патологических состояниях. Для изучения структурно-динамических особенностей, определяющих олигомеризацию трансмембранных а-спиралей, используют различные мембраноподобные среды, которые отчасти воспроизводят условия многокомпонентных биологических мембран. Состав мембраноподобной среды выбирают так, чтобы трансмембранный белковый комплекс имел биологически значимую конформацию, а стабильность образца позволяла проводить серию длительных экспериментов. В настоящей работе методами гетеро-ядерной спектроскопии ЯМР и молекулярной динамики на примере димеризующегося трансмембранного домена битопного белка гликофорина А показано, что две широко используемые среды в виде детергентных мицелл ДФХ и липидных бицелл ДМФХ/ДГФХ позволяют проводить структурно-динамические исследования специфических взаимодействий между трансмембранными а-спиралями. Однако ряд особенностей ставит липидные бицеллы ближе по своим характеристикам к природному липидному бислою.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА мембраноподобные среды, битопные мембранные белки, трансмембранный домен, диме-ризация, пространственная структура, молекулярная динамика, спектроскопия ЯМР.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ТМ - трансмембранный; GpAtm - фрагмент гликофорина А, GpA61 , содержащий ТМ-домен; ДФХ - додецилфосфохолин; ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин; ДГФХ - дигексаноил-фосфатидилхолин; СКО - среднеквадратичное отклонение; ЯЭО - ядерный эффект Оверхаузера; NOESY -ЯМР-спектроскопия ЯЭО; HSQC - гетероядерная одноквантовая корреляция.
ВВЕДЕНИЕ
Мембранные белки, составляя более 25% протео-ма [1], обеспечивают уникальность биологической роли каждой клеточной мембраны и определяют ее физико-химические свойства. Важнейшие процессы в клетке, такие, как межклеточная рецепция и коммуникация, молекулярный и ионный транспорт, слияние мембран и т.д., непосредственно связаны с участием мембранных белков. Взаимодействие между трансмембранными (ТМ) доменами белков, способных олигомеризоваться в мембране, во многих случаях важно для проявления их активности. Так называемые битопные мембранные белки, имеющие только один ТМ а-спиральный сегмент, играют ключевую роль во многих биологических процессах в организме человека. Регуляция активности битопных белков в большинстве случаев сопряжена с гомо- или гете-родимеризацией в клеточной мембране при непосредственном участии их ТМ-доменов [2, 3]. К этому
классу белков принадлежит большая часть рецепторных протеинкиназ, иммунорецепторов и апоптоз-ных белков, которые принимают непосредственное участие в управлении развитием и гомеостазом всех тканей организма как в норме, так и при патологических состояниях.
Для изучения физических параметров взаимодействия ТМ-доменов белков методом спектроскопии ЯМР в растворе необходимо поместить их в среду, имитирующую клеточную мембрану [4]. Для получения спектров ЯМР высокого качества необходимо, чтобы размер частиц такой среды был относительно небольшим, а стабильность образца позволяла проводить серию длительных экспериментов. В то же время очень важно подобрать адекватный состав мембраноподобной среды, в которой ТМ-белковый комплекс имеет биологически значимую конформацию. На настоящий момент широкое применение получили два класса сред, имитирующих мембранное
окружение - детергентные мицеллы, имеющие сферическую форму, и фосфолипидные бицеллы, которые, как полагают, имеют дисковидную форму [5].
В представленной работе методами гетероядерной спектроскопии ЯМР и молекулярной динамики впервые в мире проведено сравнительное исследование влияния разных мембраноподобных сред на конформацию димеризующегося ТМ-домена битопного белка. Гликофорин А (GpA) - антигенпредставляющий белок на поверхности эритроцитов человека - широко используется как модельный объект для отработки экспериментальных и теоретических методик изучения пространственной структуры и внутримолекулярной динамики взаимодействующих ТМ-доменов битопных белков. Именно для ТМ-домена GpA, солюбилизированного в мицеллах, была впервые установлена пространственная структура ТМ-димера, хотя до сих пор остались некоторые неопределенности в его строении [6-8]. Для оценки степени влияния мембраноподобного окружения на конформацию взаимодействующих ТМ а-спиралей в настоящей работе были исследованы структурно-динамические характеристики гомодимера ТМ- фрагмента GpA61-98 (GpAtm) в двух средах: детергентных мицеллах из додецилфосфохолина (ДФХ) и липидных бицеллах из смеси димиристоилфосфатидилхоли-на/дигексаноилфосфатидилхолина (ДМФХ/ДГФХ).
экспериментальная часть
Получение ЯМР-образцов рекомбинантного ТМ-фрагмента GpA61-98 (GpAtm) в мембраноподобных средах
Рекомбинантный пептид, соответствующий фрагменту R61VQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILL-ISYGIRRL98 GpA человека (GpAtm), включающий ТМ-домен (подчеркнут), был получен по методу [9, 10]. Для проведения ЯМР-исследований в качестве мембраноподобных сред использовали детергентные мицеллы ДФХ и небольшие бицеллы ДМФХ/ДГФХ с молярным соотношением липидов 1 : 4. Использовали полностью дейтерированный детергент d^-ДФХ (Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA, США), а также липиды d^-ДМФХ и d^-ДГФХ с дейтерированными ацильными цепями, синтезированными как описано в [11]. Сухие порошки белка и детергента или липидов растворяли в смеси трифторэтанол-вода 1 : 1 (v/v), а затем лиофили-зовали. Сухой порошок растворяли в буфере, содержащем дейтерированный ацетат натрия (20 мМ, рН 5.0, 5% D2O), EDТА (1 мМ) и азид натрия (0.05 мМ), и проводили по пять циклов замораживания-нагрева (до ~ 40°С) с последующим озвучиванием в течение нескольких минут в ультразвуковой бане до полной
прозрачности раствора. Все образцы готовили из расчета 2 мМ GpAtm в 0.5 мл раствора мицелл или би-целл с молярным соотношением пептид/детергент или липиды приблизительно 1 : 35, что обеспечивает содержание примерно двух молекул ТМ-пептида на мицеллу/бицеллу (при этом с учетом критической концентрации мицеллообразования липидов эффективное соотношение количества длинных и коротких липидов в бицелле q « 0.3). В обеих мембраноподобных средах были приготовлены по три образца димера GpAtm с использованием только 15П-меченного или 15П/13С-меченного ТМ-пептида, а также смеси 1 : 1 из 15N/13С-меченного и немеченого ТМ-пептида («изотопно-гетеродимерный» образец).
Размер мицелл и бицелл со встроенным GpAtm, а также его вторичную структуру контролировали с помощью оптических методов - динамического светорассеяния и кругового дихроизма. Эксперименты по динамическому светорассеянию проводили на установке DynaPro Titan (Wyatt Technology Corporation, США) в 12 мкл кювете при температуре 30°C. Спектры кругового дихроизма для GpAtm, встроенного в мицеллы, бицеллы или липосомы (фосфолипидный бислой), получали на спектропо-ляриметре J-810 (Jasco, Япония) в 0.1 мм кварцевой кювете при температуре 30°C и концентрации пептида 1 мг/мл. Спектры кругового дихроизма анализировали с использованием программы CDSSTTR [12]. Для приготовления небольших однослойных везикул суспензию липосом из ДМФХ при соотношении пептид/липид 1 : 50 обрабатывали ультразвуком во льду при помощи ультразвукового дезинтегратора с титановым наконечником (VirSonic-600, США) до полной прозрачности образца (примерно 10 мин).
ЯМР-спектроскопия, расчет и релаксация пространственной структуры димера ТМ-фрагмента GpA61-98, солюбилизированного в мембраноподобных средах
ЯМР-спектры GpAtm, солюбилизированного в мицеллах ДФХ и бицеллах ДМФХ/ДГФХ при pH 5.0 и 40°С, получены на спектрометрах UNITY (Varian, Palo Alto, CA, США) и AVANCE-III (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Германия) с рабочими частотами на протонах 600 МГц. Анализ ЯМР-спектров проводили с использованием программы CARA [13]. Отнесения :H-, 13C- и ^N-резонансов пептида и получение структурной информации проводили по стандартной методике с использованием экспериментов тройного резонанса [14, 15]. Информация о внутримолекулярной динамике ТМ-пептида получена на основе анализа ^^релаксационных данных: значений ге-тероядерного 15N{:H} ЯЭО, времен продольной (Т1) и поперечной (Т2) релаксации, а также эффективных
времен вращательной корреляции (tr), измеренных по методике, описанной в [16]. Скорости обмена амидных протонов на дейтерий растворителя оценены из изменения интенсивностей сигналов в наборе спектров 1H/15N-HSQC, последовательно накопленных в течение суток для растворенных в D2O образцов GpAtm, предварительно встроенных в мицеллы или бицеллы и лиофилизованных.
Расчет пространственной структуры осуществлен по стандартной методике [14] в программе CYANA 3.0 [17] с использованием метода молекулярной динамики в пространстве двугранных углов и алгоритма «моделируемого отжига» (simulated annealing). Ограничения на межпротонные вну-тримономерные расстояния получены из объемов кросс-пиков ЯЭО в спектрах 1H/15N-NOESY-HSQC и 1H/13C-NOESY-HSQC, накопленных со временем смешивания t = 80 мс. Межмономерные контакты ЯЭО на интерфейсе димеризации GpAtm получены из спектра 3D 1H/15N/13C-F1-filtered/F3-sepa-rated-NOESY-HSQC (tm = 80 мс) с использованием «изотопно-гетеродимерного» образца [15]. Диапазоны двугранных углов ф, ^ и х1 основной цепи белков оценивали из значений 1H, 15N и 13C химических сдвигов NH-, CaH- и CO-групп GpAtm в программе TALOS [18]. Ограничения на водородные связи добавлены после предварительного расчета структуры на основе анализа данных по скоростям обмена амидных протонов на дейтерий растворителя и пространственной близости амидных протонов и атомов кислорода основной цепи GpAtm в предварительном наборе структур. Были введены следующие ограничения: для углов 140° < NHO < 180° и 130° < COH < 170° и расстояний 1.9 А < d(O, HN) < 2.3 А, 3.0 А < d(O, N) < 3.4 А, 3.2 А < d(C, HN) < 3.6 А [19]. В результате на основе верхних ограничений на межпротонные расстояния (с учетом стереоспецифического отнесения групп пептида), а также ограничений на двугранные углы ф, ^ и х1 и на водородные связи рассчитаны наборы из 200 структур для GpAtm, встроенного в мицеллы или бицеллы. Из этих наборов в качестве репрезентативных были выбраны по 20 структур с наименьшими значениями штрафной функции.
Энергетическую релаксацию репрезентативных ЯМР-структур димера GpAtm проводили соответственно в явно заданных гидратированных мицеллах ДФX (60 молекул) или бислое ДМФX (512 молекул) методом молекулярной динамики (МД) с использованием программного пакета GROMACS 3.3.1 [20] как подробно описано в [21]. После уравновешивания и минимизации энергии системы рассчитывали траектории МД длительностью 2 нс с фиксированным положением атомов димера GpAtm, затем 10 нс с экспериментальными ЯМР-ограничениями на рас-
стояния и, наконец (для оценки стабильности системы), 10 нс без каких-либо ограничений.
Для анализа и визуализации пространственных структур использовали программы CYANA 3.0, MOLMOL [22] и PYMOL [23]. Гидрофобные свойства поверхности а-спиралей рассчитывали с использованием подхода молекулярного гидрофобного потенциала (МГП) [24]. Площадь контакта между а-спиралями рассчитывали с использованием программы DSSP [25] как разность площадей доступной растворителю поверхности остатков GpAtm в мономерном и димерном состояниях.
результаты и обсуждение
Пространственная структура и внутримолекулярная подвижность димера GpAtm
Влияние мембраноподобного окружения на взаимодействия спиралей в гомодимере GpAtm исследовано на примере двух сред, часто используемых в ЯМР-спектроскопии мембранных белков (рис. 1а,б): сферических мицеллах ДФХ и дискообразных липидных бицеллах ДМФХ/ДГФХ (q « 0.3) [4, 5]. Для исключения возможных разночтений, связанных с различными методиками сбора экспериментальных ЯМР-данных и расчета пространственной структуры, полученная ранее пространственная структура ТМ-фрагмента GpA62 в мицеллах ДФХ [6] в данной работе не рассматривается.
Спектры кругового дихроизма для фрагмента GpAtm, встроенного как в мицеллы ДФХ или бицел-лы ДМФХ/ДГФХ, так и в однослойные липосомы ДМФХ (фосфолипидный бислой), оказались практически идентичными и соответствовали 75 ± 8% содержанию а-спирали. Параметры ЯМР-релаксации ^N-ядер основной цепи GpAtm: 15N{:H} NOE, времена T1 и T2, а также рассчитанные эффективные локальные времена вращательной корреляции tr векторов 15N-H (рис. 2) доказывают наличие стабильного ТМ-сегмента E70-R96, фланкируемого гибкими N- и C-концевыми участками. Время корреляции вращения комплекса пептид/мицелла или бицелла как целого, оцененное из отношения T1/T2 на ТМ-участке, составляет ~13 и ~16 нс, что, согласно эмпирической зависимости [26], соответствует димеру GpAtm, образующему комплекс с ~65 молекулами детергента (~34 кДа) или ~70 молекулами липида (~43 кДа). При этом, согласно данным динамического светорассеяния, обе супрамолекулярные системы имеют сходный гидродинамический радиус 26 ± 4 А.
Чтобы получить информацию о взаимодействиях между спиралями GpAtm, использовали спектр ЯМР, накопленный для «изотопно-гетеродимерного» образца (рис. 1в). В этом спектре представлены
'И 1 м.д.
2
3
4
5
6
7 -
в
Рис. 1. Гетероядерные ЯМР-спектры 1H/15N-HSQC GpAtm в водной суспензии мицелл ДФХ (а) и бицелл ДМФХ/ДГФХ (б) с молярным отношением пептид/детергент и пептид/липид 1 : 35, рИ 5, 40°С. Приведено отнесение сигналов. в - 1Н-1Н-проекция 3D 1H/15N/13C-F1-filtered/F3-edited-NOESY-спектра с межмоно-мерными контактами ЯЭО для «изотопно-гетеродимер-ного» образца GpAtm в мицеллах ДФХ. Наблюдаемые в спектре кросс-пики соответствуют отфильтрованным межмоно-мерным протон-протонным контактам ЯЭО. Пунктирными овалами обозначены области с межмономерными контактами ЯЭО между метильными и остальными группами остатков димера GpAtm. Стрелками указаны неотфильтрованные внутримономерные контакты ЯЭО с участием гидроксильной группы ОуН остатка T87. Эти контакты свидетельствуют о том, что в основной конформации ОуН-группа T87 образует внутримолекулярную связь с карбонильной группой G83.
1 1Н м.д.
8
7
б
4
3
2
кросс-пики ЯЭО, соответствующие переносу намагниченности от протонов, связанных с атомами 14П и 12С, на протоны, связанные атомами 15П и 13С [15]. В результате обнаружено 17 межмономерных ЯЭО-контактов в мицеллах и 14 в бицеллах. Наборы внутри- и межмономерных ЯЭО-контактов, идентифицированных в ЯМР-спектрах, показали, что в обеих средах GpAtm формирует симметричный в шкале времени ЯМР гомодимер, состоящий из двух параллельных спиралей. Следует отметить, что большинство различий в системах ЯЭО-контактов, наблюдаемых для GpAtm в мицеллах и бицеллах, можно объяснить изменениями химических сдвигов сигналов и связанными с этим различиями в перекрытиях кросс-пиков. Пространственные структуры
GpAtm определены с высоким качеством и разрешением (таблица, рис. 3а). Экспериментальные ЯМР-ограничения, использованные для расчета пространственных структур, и полученные координаты атомов для наборов структур димера GpAtm, встроенного в мицеллы ДФХ и бицеллы ДМФХ/ДГФХ, депонированы в международном банке данных пространственных структур RCSB (www.rcsb.org) с кодами доступа 2кре и 2kpf соответственно. Репрезентативные структуры димера GpAtm подвергнуты энергетической МД-релаксации в явно заданной мицелле ДФХ и липидном бислое ДМФХ с наложенными экспериментальными ограничениями на расстояния. Это позволило адаптировать ЯМР-структуру к модельному мембранному окружению (рис. 3в) и про-
70 80 90
RVQLAHHFSEPEITLIIFGVMAGVIGTILLISYGIRRL
Рис. 2. ^-релаксационные параметры для амидных групп GpAtm в мицеллах ДФХ (пунктирная линия) и бицеллах ДМФХ/ДГФХ (сплошная линия). а - Значения эффективного времени корреляции броуновского вращения tr, рассчитанного из отношения времен Т1/Т2 ^N-ядер соответствующих аминокислотных остатков; б - значения гетероядерного 15N{1H} ЯЭО.
верить используемые в МД-расчете силовые поля на соответствие результатам эксперимента. В обоих случаях продолжение МД-траектории без ограничений не вызвало существенных изменений структуры димера, что указывает как на его относительную стабильность, так и на приемлемость используемых силовых полей.
В целом, пространственная структура и внутримолекулярная подвижность ТМ-домена GpA в мицеллах и бицеллах отличаются незначительно: в обоих случаях оси трансмембранных а-спиралей расположены под углом 9, равным -40°, а расстояние d между ними составило около 6.5 А. Вместе с тем сравнение пространственных структур димера (рис. 3а) показывает, что при переходе от мицелл
к бицеллам происходит небольшой изгиб на С-конце ТМ-спиралей. Периодический характер изменений химических сдвигов сигналов амидных протонов, A6hN, вдоль аминокислотной последовательности GpAtm при переходе от мицелл к бицеллам также указывает на небольшой изгиб на С-конце спиралей (рис. Зб). Тенденция изменения средних значений A6hN от отрицательных к положительным вдоль ТМ-спирали указывает на возможное небольшое растяжение ее N-концевой части до интерфейса диме-ризации и сжатие после. Небольшой изгиб С-концов ТМ-спиралей, наряду с общим наклоном димера GpAtm по отношению к нормали липидного бислоя ДМФX, также наблюдали в течение МД-релаксации (рис. Зв). Напротив, существенных искривлений ТМ-спиралей в димере GpAtm, встроенном в мицеллу ДФX, не регистрировали ни в наборе рассчитанных структур, ни в течение МД-релаксации. Так как ацильные цепи в ДФX короче (образованы 12 атомами углерода), чем в ДМФX (14 углеродных атомов), то можно было бы ожидать более длинную ТМ-спираль (например, за счет частичного перехода a-спирали в спираль 3/10) в бицеллах по сравнению с мицеллами. Однако в полученном наборе ЯМР-структур димера GpAtm в мицеллах и бицеллах разница в длине a-спирального участка не обнаружена. И только во время МД-релаксации в явно заданной мицелле для первого витка ТМ-спирали GpAtm изредка наблюдали переходы спираль-изгиб (рис. Зв). Это согласуется с тем, что мицеллы являются более пластичными структурами, чем бицеллы, и в большей степени способны адаптироваться к форме и размерам ТМ-белка [27, 28]. В свою очередь, мицеллы по сравнению с бицеллами могут предоставлять большую свободу конформационной динамики для встроенного в них ТМ-белка. Действительно, во время МД-релаксации GpAtm без наложения ЯМР-ограничений параметры димера характеризовались в 2 раза большими амплитудами случайных флуктуаций в мицеллах ДФX (9 46 ± 6°, d 6.3 ± 0.8 А), чем в бислое ДМФX (9 42 ± 3°, d 6.4 ± 0.4 А), что указывает на более плотную упаковку ТМ-спиралей димера в липидном окружении. По-видимому, изменения в пространственной структуре димера GpAtm, наблюдаемые методом ЯМР в бицеллах по сравнению с мицеллами и в течение его МД-релаксации в липидном бислое, обусловлены адаптацией димера к бислою ДМФX для предотвращения так называемого «гидрофобного несоответствия» [29, 30].
Поверхность димеризации GpAtm
Спирали GpAtm, встроенные в мицеллу ДФК или в бицеллу ДМФX/ДГФX, ассоциируют в параллельный димер через так называемый тандемный
A6, ,N,
Рис. 3. а - Сравнение ЯМР-структур димера GpAtm в бицеллах ДМФХ/ДГФХ (показаны красным) и в мицеллах ДФХ (показаны черным). 20 структур в бицеллах и 20 структур в мицеллах совмещены по атомам основной цепи а-спирали Е72-195. Показаны только ковалентные связи с участием тяжелых атомов остатков (70-98)2. б - Справа показана разница (Д6нм) химических сдвигов сигналов протонов амидных групп GpAtm в бицеллах ДМФХ/ДГ ФХ и мицеллах ДФХ. Слева на структуре димера GpAtm в бицеллах голубым и красным выделены амидные группы остатков с локальными минимумами и максимумами значений Д6нм соответственно. Значение Д6нм сильно зависит от длины водородной связи, в которой участвует данный амидный протон, при этом локальное увеличение Д6нм указывает на укорочение водородной связи [37]. в - Структуры димера GpAtm после МД-релаксации в явно заданной мицелле ДФХ (слева) и бислое ДМФХ (справа). Желтыми сферами показаны атомы фосфора молекул детергентов и липидов. Ацильные цепи липидов и детергентов показаны голубыми линиями. Для наглядности разные мономеры окрашены в зеленый и лиловый цвета.
«четырехчленный» мотив GG4 [31] G79VxxG83VxxT87, также известный как «глициновая застежка» [32]. Мотив образован остатками с малой боковой цепью, что дает возможность получить плотную правозакрученную упаковку ТМ-спиралей GpAtm, контактирующих слабополярными поверхностями (рис. 4а,б) в гидрофобном окружении. В то же время предсказанный ранее методом молекулярного моделирования [33] альтернативный «семичленный» мотив LI76xxG79xxAG83xxG86xxLL90xxY93 с левозакрученной упаковкой ТМ а-спиралей не задействован.
В обеих средах на интерфейсе димеризации GpAtm имеются восемь полярных межмолеку-лярных взаимодействий типа Са—Н---0. Эти взаимодействия, которые можно охарактеризовать как неканонические водородные связи (с соответствующим расстоянием d(O, Н) < 3 А и углом СОН > 120° [34]), образуются между СаН G79, G83, V80 и V84 и карбонильными группами I76, G79 и V80, а также ОуН-группой Т87 соответственно (рис. 4в). Квантово-химические расчеты показали, что при-
сутствие взаимодействий такого типа должно приводить к существенному изменению химических сдвигов сигналов протонов СаН-групп белков [35]. То есть химические сдвиги сигналов протонов СаН являются очень чувствительным сенсором расстояний до карбонильных групп на интерфейсе диме-ризации а-спиралей. Химические сдвиги протонов СаН G79, G83, V80 и V84 практически полностью совпадают в мицеллах и бицеллах (максимальное отличие - 0.05 м.д.), что демонстрирует высокую степень идентичности структурной организации интерфейса димеризации GpAtm в двух средах. Другими словами, не только общая топология, но и структурные детали интерфейса димеризации GpAtm идентичны в обеих мембраноподобных средах.
Сравнение полученных и ранее опубликованных структур ОрА^
Структуры, полученные в рамках нашей работы, хорошо согласуются с опубликованными данными по мутагенезу [31]. С другой стороны, структура
Структурная статистика для репрезентативных наборов из 20 ЯМР-структур димера GpAtm, встроенного в мицеллы ДфХ и бицеллы ДМФХ/ДГФХ
ЯMP-структура димера GpAtm Mицеллы Бицеллы
PDB-код 2kpe 2kpf
ЯMP-данные для расчета структуры
Oбщее количество ограничений ЯЭO 484 520
внутриостаточные 234 278
межостаточные 21б 214
последовательные (|i-j|=1) 128 128
средней дальности (1<|i-j|<4) 88 8б
дальние (|i-j|>4) 0 0
межмономерные 34 28
Oграничения на водородные связи внутримономерные (верхние/нижние) межмономерные (верхние/нижние) 108/108 0/0 108/108 0/0
Oграничения на двугранные углы 15б 15б
угол ф основной цепи 5б 5б
угол ^ основной цепи 5б 5б
угол X1 боковой цепи 44 44
Качество расчета структуры
Штрафная функция (А2) 0.75±0.15 1.02±0.1б
Нарушения ограничений
на расстояния (>0.2 А) 0 0
на расстояния (>0.1 А) б 5
на двугранные углы (>5o) 0 0
Попарное CKO между структурами (А)
TM а-спираль (72-95)2
по атомам основной цепи 0.39±0.17 0.42±0.13
по всем тяжелым атомам 0.94±0.18 1.07±0.15
обобщенное CKO
по атомам основной цепи 0.72±0.45
по всем тяжелым атомам 1.25±0.37
по атомам основной цепи между усредненными структурами 1.03
Анализ карты Pамачандрана, % остатков (70-98)2
в благоприятных регионах 92.7 90.4
в дополнительных разрешенных регионах 7.7 б.4
в принципиально разрешенных регионах 1.4* 0.2*
в запрещенных регионах 0.4* 0.7*
Упаковка TM-спиралей
площадь межспиральных контактов (А2) 370±20 380±20
угол 9 (град) между осями TM-спиралей -40±2 -40±2
расстояние d (А) между осями TM-спиралей б.7±0.4 б.4±0.4
*Остатки из подвижных и неструктурированных участков GpAtm.
GpAtm как в мицелле, так и в бицелле оказалась близкой (СКО ~ 1.1 А по координатам атомов основной цепи остатков (72 — 95)2) к ранее опубликованной структуре ТМ-фрагмента GpA62 , встроенного
в мицеллу ДФХ [6]. Позднее на основе структурных ограничений, полученных методами ЯМР твердого тела, была предложена конформация димерного
ТМ-фрагмента GpA70 98 в высушенных липидных бислоях из ДМФХ и пальмитоилолеилфосфатидил-холина (ПОФХ) [7, 8]. Помимо небольшого уменьшения угла между осями ТМ-спиралей до -35° и относительного их поворота в димере на ~25°, главным отличием от структуры в мицелле ДФХ является характер водородной связи, образуемой боковой це-
Рис. 4. а - Поверхность ТМ а-спирали правозакрученного димера GpAtm, раскрашенная соответственно значениям молекулярного гидрофобного потенциала (МГП): желтым - гидрофобные, зеленым - гидрофильные участки. Второй мономер димера показан красным цветом. б - Карта поверхности ТМ а-спирали GpAtm с изолиниями, соответствующими (гидрофобным) положительным значениям молекулярного гидрофобного потенциала (детали построения карты описаны в [21]). Красными точками отмечена область межмолекулярного контакта а-спиралей GpAtm. Как видно из рисунка, контакт обеспечивается «четырехчленным» GG4-подобным мотивом G79VxxG83VxxT87. «Семичленный» мотив LI76xxG79xxAG83xxG86xxLL90xxY93, предполагающий левозакрученную упаковку а-спиралей (отмечен штриховой линией), не задействован. в - Центральная часть интерфейса димеризации GpAtm в бицеллах. Серым и черным пунктиром показаны внутримономерные и неканонические Са—H--O межмономерные водородные связи соответственно.
пью Т87. На основании сближенности ОуН-группы треонина с карбонильной группой V84 противоположной спирали авторы работы [8] сделали вывод о межмолекулярном характере этой связи. Согласно полученным в настоящей работе структурам димера GpAtm, встроенного в мицеллы и бицеллы, атомы кислорода гидроксильной и карбонильной групп остатков Т87 и V84 из соседних мономеров находятся на расстоянии ~4 А, при этом в бицеллах эти атомы сближены до ~3.8 А, что в принципе позволяет этим группам образовывать межмолекуляр-ную водородную связь. Однако система контактов ЯЭО, наблюдаемая в спектрах ЯМР, измеренных как в бицеллах, так и в мицеллах (рис. 1в), однозначно свидетельствует о том, что в основной конформации GpAtm ОуН-группа Т87 образует внутримолекулярную связь с карбонильной группой G83 (сближены до ~2 А) (рис. 4в). Тем не менее, во время МД-релаксации в обоих случаях детектировались несимметричные короткоживущие состояния
с межмолекулярной водородной связью между Oy^ группами T87 (с поворотом угла X1 боковой цепи T87 из гош+ в гош- положение). Подобное явление было зарегистрировано и в других работах по моделированию димеризации TM-домена GpA [33, 3б].
ЗАКЛЮчЕНИЕ
Впервые для специфически взаимодействующих TM-спиралей проведено сравнительное исследование пространственной структуры и динамики в двух мембраноподобных средах разного вида. Это важный методический момент, позволяющий сделать вывод, что в случае TM-домена GpA общая топология димера, определяемая спецификой спираль-спирального взаимодействия, не зависит от выбора мембраноподобной среды и только локальная структура TM-спиралей в какой-то степени чувствительна к этому фактору. C другой стороны, известно, что дисковидная форма и липидный состав бицелл приближают их по физическим свойствам к при-
родной липидной мембране, в результате уменьшаются как конформационные флуктуации спиралей, так и флуктуации параметров, характеризующих их относительное расположение (угол 9 и расстояние d между спиралями). В свою очередь, при прочих равных условиях это должно повышать стабильность пространственной структуры а-спирального мембранного белка в бицеллах по сравнению с мицеллами. •
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований, Федеральной целевой программой «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» и Программами Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов».
CMCOK ЛИTEPАTУPЫ
1. Frishman D., Mewes H.-W. // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1999. V. 72. P. 1-17.
2. Li E., Hristova K. // Biochemistry. 200б. V. 45. P. б241-б251.
3. Zviling M., Kochva U., Arkin I.T. // Biochim. Biophys.
Acta. 2007. V. 17б8. P. 387-392.
4. Bocharov E.V., Volynsky P.E., Pavlov K.V., Efremov R.G., Arseniev A.S. // Cell Adh. Migr. 2010. V. 4. P. 284-298.
5. Kim H.J., Howell S.C., van Horn W.D., Jeon Y.H., Sanders C.R. // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2009. V. 55.
P. 335-3б0.
6. MacKenzie K.R., Prestegard J.H., Engelman D.M. // Science. 1997. V. 27б. P. 131-133.
7. Smith S.O., Song D., Shekar S., Groesbeek M., Ziliox M., Aimoto S. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. б553-б558.
8. Smith S.O., Eilers M., Song D., Crocker E., Ying W., Groesbeek M., Metz G., Ziliox M., Aimoto S. // Biophys. J. 2002. V. 82. P. 247б-248б.
9. Гончарук M.B., Шульга А.А., Крмолюк Я.С, 'Гкач К.Н., Гончарук СА., Пустовалова Ю.К., Mинеев K.C., Бочаров SB., Mасленников ИЗ., Арсеньев А.С, Kирпичников M3. // Mол. биол. 2011. T. 45. № 5.
10. ^рпичников M3., Гончарук M.B., Крмолюк Я.С, Гончарук СА., Шульга А.А., Mасленников И.B., Арсеньев А.С // Хехнол. живых систем. 2005. T. 2. C. 20-27.
11. Chakrabarti P., Khorana G. // Biochemistry. 1975. V. 14.
P. 5021-5033.
12. Sreerama N., Woody R.W. // Anal. Biochem. 2000. V. 287.
P. 252-2б0.
13. Keller R.L.J. The computer aided resonance assignment tutorial. Goldau, Switzerland: CANTINA Verlag, 2004. 81 p.
14. Cavanagh J., Fairbrother W. J., Palmer A.G., Skelton N.J. Protein NMR spectroscopy: principles and practice. 2nd ed. San Diego, CA, USA: Acad. Press, 2007. 88б p.
15. Zwahlen C., Legault P., Vincent S.J.F., Greenblatt J., Konrat R., Kay L.E. // Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. б711-б721.
16. Bocharov E.V., Korzhnev D.M., Blommers M.J., Arvinte T., Orekhov V.Y., Billeter M., Arseniev A.S. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 4б273-4б279.
17. Gйntert P. // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2003.
V. 43. P. 105-125.
18. Cornilescu G., Delaglio F., Bax A. // J. Biomol. NMR. 1999. V. 13. P. 289-302.
19. Baker E.N., Hubbard R.E. // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1984. V. 44. P. 97-179.
20. Lindahl E., Hess B., van der Spoel D. // J. Mol. Mod. 2001. V. 7. P. 306-317.
21. Bocharov E.V., Mayzel M.L., Volynsky P.E., Mineev K.S., Tkach E.N., Ermolyuk Ya.S., Schulga A.A., Efremov R.G., Arseniev A.S. // Biophys. J. 2010. V. 98. P. 881-889.
22. Koradi R., Billeter M., Wuthrich K.J. // Mol. Graphics. 1996. V. 14. P. 51-55.
23. DeLano W.L. The PyMOL Molecular Graphics System, Palo Alto, CA, USA: DeLano Scientific, 2002.
24. Efremov R.G., Gulyaev D.I., Vergoten G., Modyanov N.N. // J. Prot. Chem. 1992. V. 11. P. 665-675.
25. Kabsch W., Sander C. // Biopolymers. 1983. V. 22.
P. 2577-2637.
26. Daragan V.A., Mayo K.H. // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1997. V. 31. P. 63-105.
27. Bordag N., Keller S. // Chem. Phys. Lipids. 2010. V. 163.
P. 1-26.
28. Lind J., Nordin J., Maler L. // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1778. P. 2526-2534.
29. Nyholm T.K., Ozdirekcan S., Killian J.A. // Biochemistry. 2007. V. 46. P. 1457-1465.
30. Sparr E., Ash W.L., Nazarov P.V., Rijkers D.T., Hemminga M.A., Tieleman D.P., Killian J.A. // J. Biol. Chem. 2005.
V. 280. P. 39324-39331.
31. Mackenzie K.R. // Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 1931-1977.
32. Kim S., Jeon T.-J., Oberai A., Yang D., Schmidt J. J., Bowie J.U. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 14279-14283.
33. Efremov R.G., Vereshaga Y.A., Volynsky P.E., Nolde D.E., Arseniev A.S. // J. Comput. Aided. Mol. Des. 2006. V. 20.
P. 27-45.
34. Senes A., Ubarretxena-Belandia I., Engelman D.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 9056-9061.
35. Vargas R., Garza J., Dixon D.A., Hay B.P. // J. Am. Chem. Soc. 2000. V. 122. P. 4750-4755.
36. Cuthbertson J.M., Bond P. J., Sansom M.S. // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 14298-14310.
37. Wagner G., Pardi A., Wuthrich K. // J. Am. Chem. Soc. 1983. V. 105. P. 5948-5949.
