CC BY
84
УДК 575.17.015.3
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ОКУНЕЙ РОДА SEBASTES (PISCES, SEBASTIDAE) ПО ДАННЫМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПЕРВОГО УЧАСТКА D-ПЕТЛИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК
© А.О. Катугина
Ключевые слова: морские окуни; митохондриальная ДНК;
Исследованы нуклеотидные последовательности секвенированного фрагмента контрольного региона ф-петли) митохондриальной ДНК. Реконструировано филогенетическое древо для пяти видов окуней рода 5еЪа5ге5 трех Дальневосточных морей. Новые данные для особей из районов Японского, Охотского и Берингова морей согласуются с выдвинутыми ранее гипотезами о филогенетических взаимоотношениях видов рода 5еЪа5ге5. Исследованные нами и другими авторами особи одних и тех же видов группируются в тесные кластеры. Особи разных видов формируют обособленные кластеры более высокого уровня. Значения р-расстояний между выборками подробнее исследованного вида Хасхапсмкки, из разных бассейнов составили величину 0,7-1,4 %. Эти относительно небольшие величины р-расстояния могут свидетельствовать об отсутствии существенных барьеров для потока генов между относительно удаленными группировками этого вида из зал. Петра Великого Японского моря.
Систематика морских окуней, а также их видовая идентификация основаны на морфологических признаках [1-3]. Однако морфологические признаки не всегда позволяет идентифицировать симпатрические виды морских окуней [4-5]. В связи с этим для различения видов морских окуней применяют молекулярно-генетические маркеры [6-8]. В частности, при анализе внутри- и межвидовой генетической изменчивости и дивергенции морских окуней эффективно использование последовательности нуклеотидов контрольного региона или D-петли митохондриальной ДНК (мтДНК) [9].
Ранее исследования окуней проводили в основном на видах, обитающих у Тихоокеанского побережья Северной Америки [10-13] и у побережья Японии [9]. Морские окуни дальневосточных морей России в этом отношении практически не изучены.
В связи с этим, основные задачи работы:
1) описание внутри- и межвидовой изменчивости последовательностей нуклеотидов D-петли мтДНК;
2) оценка дивергенции четырех дальневосточных видов рода БеЪазТез по этим данным.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В качестве материала брали образцы тканей морских окуней, отловленных в Японском, Охотском и Беринговом морях. Отлов рыб производили донным тралом на судах НИС «ТИНРО» (август 2008 г.), НИС «Профессор Кизеветер» (апрель 2009 г.). Отлов проводили жаберной сетью (бухта Киевка) и удильной снастью (заливы Улисс и Восток). Для молекулярно-генетического анализа взяли по 20 экземпляров представителей 4 видов рода БеЪазТез (табл. 1; рис. 1). Кроме того, использовали последовательности 6 видов, извлеченные из генного банка GenBank (ЫСВ1, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (рис. 2).
Выделение ДНК проводили с использованием фенол-хлороформной экстракции [13] с небольшими изменениями [14], состоящими в удалении фенола и добавлении РНК. В качестве исходного материала брали ткани сердца, фиксированные в 96 % этиловом спирте.
Участок D-петли мтДНК амплифицировали при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя праймеры L-pro-1 (ACT CTC ACC CCT AGC TCC CAA AG) и H-DL-C-1 (CCT GAA GTA GGA ACC AGA TGC CAG) [7]. В состав реакционной смеси для ПЦР входили: выделенная тотальная ДНК (1 мкл); 10Х буфер (SE) (1,25 мкл); 10 мМ смеси dNTP (1,25 мкл), по 1,25 мкл каждого праймера (10 мМ); 25 мМ MgCl2 (1 мкл); 0,1 мкл Тад-полимеразы; 3,9 мкл деионизиро-ванной воды.
Реакцию проводили в амплификаторе GeneAmpPCR 9700 (Perkin-Elmer) по следующей программе: первичный нагрев 94 °C - 5 мин. (плавление 94 °C - 1 мин., отжиг 49 °C - 1 мин., элонгация 72 °C -45 с) 30 циклов, 73 °C - 3 мин. Продукты амплификации очищали осаждением одним объемом 96 % этилового спирта и второй раз двумя объемами 70 % спирта.
Очищенные продукты ПЦР секвенировали методом Сэнджера в обоих направлениях при помощи набора реагентов "Big Dye Terminal Cycle Sequncing Kit V 3.1" (USA) и праймеров, использованных для ПЦР. Циклическое секвенирование проводили в том же приборе GeneAmpPCR 9700 (Perkin-Elmer) при использовании программы 96 °C - 10 с, 50 °C - 5 с, 60 °C - 4 мин. (25 циклов). Секвенирование проводили в анализаторе ABI-3500 (Applied Biosystems, USA). Консенсусные последовательности нуклеотидов на основе цепей прямого и обратного прочтения после реакции секвениро-вания получили посредством ChromasPro 2.31 (http://www.echnelysium.com.au/chromas.html), и затем были подписаны в генный банк EMBL с номерами доступа, представленными в табл. 1 [15].
Таблица 1
Место и дата вылова видов рода Sebastes
Вид Год Место сбора Сокращенное название образца Номер образца в GenBank
S. alutus 2009 Охотское море AlOS09 HF952710
S. borealis 2008 Берингово море BrBS08 HF952711
S. owstonii 2009 Японское море OwsJS09 HF952712
S. taczanowskii 2008 Японское море, зал. Улисс TcUB08 HF952715
S. taczanowskii 2009 Японское море, б. Киевка TcKB09 HF952719
S. taczanowskii 2010 Японское море, зал. Восток TcVB10 HF952721
S. taczanowskii 2011 Японское море, б. Киевка TcKB11 HF952725
Рис. 1. Карта-схема расположения районов вылова морских окуней
Выравнивание нуклеотидных последовательностей, а также расчет генетических расстояний, степени дивергенции и филогенетические реконструкции проводили с использованием пакета MEGA 5.0 [16]. Стандартное отклонение рассчитывали в пакете Arlequin 3.5 [6]. При реконструкции филогенетических деревьев использовали три метода: максимальной парсимонии (MP), максимального правдоподобия (ML) и ближайшего соседства (NJ) с алгоритмами, реализованными в MEGA-5. На основе метода максимального правдоподобия и информационного критерия Акайке (MEGA-5), как оптимальная для представленного набора последовательностей, была выбрана модель замен нуклеотидов Тамуры-Нея (TrN). Соответственно, при построении генных деревьев ML и NJ использовали модель TrN. При реконструкции МР-дерева применяли стандартный подход. Бутстреп поддержки в каждом из трех методов получили по 1000 репликам. При укоренении генных деревьев использовали внешнюю группу, представленную Hozukius emblemarius (Teleostei: Sebastidae) [17].
РЕЗУЛЬТАТЫ
После выравнивания общая длина всех исследуемых последовательностей участка D-петли мтДНК составила 379 пар нуклеотидов (п. н.). Число вариабельных сайтов для сравниваемых последовательностей -
67 из 379, или 17,8 %, а число информативных для парсимонии сайтов составило 50 из 379, или 13,2 %.
Генетическая дивергенция (р-расстояние) между проанализированными последовательностями пяти исследованных видов рода Sebastes изменялась в пределах от 3,2 до 7,2 % (табл. 2). При этом внутривидовая дивергенции S. taczanowskii, для которого имеются выборки из разных географических локальностей, составила 0,7-1,4 % (табл. 3). Топология трех генных деревьев MP, ML и NJ принципиально не отличалась (рис. 2). В качестве иллюстрации представлено ML-дерево с бутстреп поддержками для других методов. Все изученные виды сгруппировались в два хорошо поддержанных кластера. В первом кластере были представлены виды: S. shlegelii и S. taczanowskii, при этом S. owstoni образовал с этими видами сестринскую группу. Второй кластер был представлен S. borealis и S. alutus. (рис. 2). Все три типа деревьев продемонстрировали относительно высокую генетическую неоднородность S. taczanowskii [18]. Было обнаружено также, что внутривидовые генетические расстояния не имеют каких-либо отчетливых различий, связанных с географической локализацией выборок (рис. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
Три молекулярно-филогенетические реконструкции (MP, ML, NJ) показали, что исследованные виды рода Sebastes четко обособленны один от другого, формируя хорошо поддержанные статистически кластеры (рис. 2). На представленном сводном дереве видно, что кластер с наибольшей бутстреп поддержкой был сформирован двумя видами - S. shlegeli и S. taczanowskii. Этот кластер вместе с S. owstoni из Японского моря образовал следующий кластер, также имеющий высокую статистическую поддержку (рис. 2).
Как следует из сравнительного анализа данных контрольного региона из работы R. Hyde, D. Vetter [10], в которой дерево реконструировано на основе MP-подхода, в один хорошо поддержанный кластер объединились S. shlegelii и S. taczanowskii. Эти результаты так же подтвердили генетическую близость видов S. shlegelii и S. taczanowskii, обнаруженную в работе (рис. 2). На генных деревьях S. alutus и S. borealis объединялись в один кластер, который получил высокую бутстреп поддержку. Однако в работе R. Hyde, D. Vetter [10] S. alutus и S. borealis находились в разных кластерах, что, скорее всего, обусловлено большим разнообразием видов, использованных авторами в работе, и относительно невысокой поддержкой их кластера. Тем не менее, в реконструкции [10].
ifs
100/100/-
100/Ю0/-99/10Î
100/-/
9
99/100/j; 100/100/100
100/100/-
Sebastes taczanowskii (D0678597.I) Sebastes taczanowskii 1 Ulysses bay 2008 (HF952715) Sebastes taczanowskii 3 Ulysses bay 2008 f HF952717)
- Sebastes taczanowskii 5 Vostock bay 2010 (HF952722) Sebastes taczanowskii 4 Ulysses bay 2008 (HF952718) Т|?л Sebastes taczanowskii 5 Kievka bay 2009 (HF952720) ' Sebastes taczanowskii 4 Kievka bay 20И (HF952725) Sebastes taczanowskii 4 Vostock bay 2010 (HF952721) Sebastes taczanowskii 3 Kievka bay 2011 (HF952724) Sebastes taczanowskii 4 Kievka bay 2009 (IIF952719) — Sebastes taczanowskii 2 Kievka bay201 I (HF952723) Sebastes taczanowskii 2 Ulysses bay 2008 (HF952716) -Sebastes shtegelii (D0678584.1)
t:
Sebastes owstoni (AB274264.1)
48/100/100
99/82/-
100/100/100
Sebastes owstoni 3 Sea of Japan 2009 (HF952714) - Sehastes owstoni 1 Sea of Japan 2009 (HF952712) Sebastes owstoni 2 Sea of Japan 2009 (HF9527I3) 100/100/99 I Sebastes alutus (DQ678519.1)
~~I- Sebastes alutus I Sea ofOchotsk 2009 (HF952710)
100/100/99
Sebastes borealis (DQ678609.1)
Sebastes borealis 2 Sea of Bering 2008 (HF95271I)
| Sei
- Hozukius emblemarius (D0678602)
0,02
Рис. 2. Филогенетическое дерево видов рода Sebastes, построенное с помощью алгоритма максимального правдоподобия (Cavalii-Sforza, Edwards, 1967, модификация Фельзнштейна: Felsenstein, 1973, Felsenstein, 1981) по данным последовательностей участка D-петли мтДНК. В узлах показаны поддержки для трех использованных методов MP/ML/NJ
Таблица 2
Генетическая дивергенция (р-расстояния) между 4 видами рода Sebastes (в %)
S. alutus S. borealis S. owstoni S. taczanowskii
S. alutus 1,4 1,8 2,8
S. borealis 3,4 1,9 2,7
S. owstoni 4,3 4,8 2,5
S. taczanowskii 3,2 7,2 6,5
Примечание: в верхней части таблицы показано стандартное отклонение, в нижней части - значения р-расстояния (%).
Таблица 3
Генетическая дивергенция внутри вида SeЪastes taczanсwskii из 4 районов лова и по данным из генного банка
DQ678597.1 TcUB08 TcKB09 TcVB10 TcKB11
DQ678597.1 0,4 0,5 0,5 0,6
TcUB08 1,0 0,4 0,3 0,4
TcKB09 1,1 1,0 0,3 0,3
TcVB10 1,1 1,1 0,8 0,3
TcKB11 1,4 1,3 0,7 0,9
Примечание: в верхней части таблицы показано стандартное отклонение, рассчитанное в пакете Arlequin 3.5, в нижней части -значения р-расстояния. Видовую принадлежность образцов см. в табл. 1.
S. а1ыи и S. ЪсгеаШ были расположены ближе друг к другу, чем к видам S. сwstсni, S. shlegeli или S. taczanсwskii, что соответствовало полученным ре-
зультатам данного исследования (рис. 2). Таким образом, кластеризация пяти видов окуней Охотского, Берингова и Японского морей соответствовало объедине-
ниям этих же видов, полученным ранее из других районов Северной Пацифики [19].
Для S. taczanowskii значения р-расстояния между выборками составили от 0,7 до 1,4 %, Различия даже этих минимальных и максимальных значений находились в пределах стандартного отклонения. Т. е. обнаруженные различия ^-расстояний не являлись значимыми статистически. Топология генных деревьев не выявила ясной географической подразделенности вида. Это может свидетельствовать об отсутствии каких-либо барьеров, препятствующих генетическому обмену между локальными группировками S. taczanowskii, обитающими на географически не столь удаленных территориях, представленных в изученном материале выборками из залива Петра Великого Японского моря.
Для объединенной выборки S. taczanowskii средний уровень дивергенции составил 3.67 %. Подобный уровень внутривидовой генетической дифференциации отмечался для S. thompsoni в работе M. Higuchi, K. Kato [9] и был охарактеризован авторами как высокий по сравнению с другими видами. Полиморфизм S. tacza-nowskii так же, как и в работе M. Higuchi, K. Kato по S. thompsoni, по-видимому, был обусловлен большим размером популяции исследуемого вида, по сравнению с другими. Однако сравнительный популяционно-генетический анализ видов Sebastes является предметом дальнейшей работы [20].
Из проведенного анализа следует, что виды окуней, обитающие в Японском, Охотском и Беринговом морях, кластеризовались друг с другом по изученным последовательностям D-петли аналогично тому, что уже известно для других районов исследования по применяемому и, в т. ч., по другим маркерам [10], подтверждая выдвинутые ранее гипотезы о филогенетических отношениях этих видов. Выявленный высокий уровень полиморфизма нуклеотидных последовательностей D-петли у S. taczanowskii позволяет в перспективе организовать более подробное исследование по-пуляционно генетической структуры вида на основе данного маркера.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барсуков В.В. Аннотированный и иллюстрированный каталог морских окуней Мирового океана. СПб. : ЗИН РАН, 2003. 319 с.
2. Снытко В.А. Морские окуни северной части Тихого океана. Владивосток: ТИНРО-Центр, 2001. 469 с.
3. Kendall A.W. Systematics and identification of larvae and juveniles of the genus Sebastes // Environ. Biol. Fish. 1991. V. 30. P. 173-190.
4. Картавцев Ю.Ф. Молекулярная эволюция и популяционная генетика. Владивосток, 2005. 234 с.
5. Лухтанов В.А., Кузнецова В.Г. Молекулярно-генетические и цитологические подходы к проблемам видовой диагностики систематики и филогенетики // Журнал общей биологии. 2009. С. 415-437.
6. Excoffier L., Lischer H.E.L. Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows // Molecular Ecology Resources. 2010. V. 10. № 3. P. 564567.
7. Gharrett A.J., Matala A.P., Peterson E.L. et al. Distribution and population genetic structure of sibling rougheye rockfish species // Biology,
Assessment and Management of North Pacific Rockfishes. 2007. P. 121-140.
8. Magnuson-Ford K., Ingram T., Redding D.W., Mooer A. Rockfish (Sebastes) that are also large, morphologically distinctive and vulnerable to overfishing // Biological conservation. 2009. V. 142. P. 17871796.
9. Higuchi M., Kato K. Sequence variability in the mitochondrial DNA control region of five Sebastes species // Fish. Sci. 2002. V. 68. P. 643650.
10. Hyde R.J., Vetter D.R. The origin, evolution, and diversification of rockfishes of the genus Sebastes (Cuvier, 1829) // Mol. phylogenetics and evolution. 2007. V. 44. P. 790-811.
11. Moser H.G. Scorpaenidae: scorpionfishes and rockfishes // CalCOFI Atlas. 1996. V. 33. P. 793-795.
12. Rocha-Olivares A., Rosenblatt R.H., Vetter R.D. Cryptic species of rockfish (Sebastes: Scorpaenidae) in the southern hemisphere inferred from mitochondrial lineages // Journal of Heredity. 1999. V. 90. P. 404-411.
13. Roques P., Robertson D.L., Souquiere S. et al. Phylogenetic analysis of 49 newly derived HIV-1 group O strains: high viral diversity but no group M-like subtype structure // Virology. 2002. V. 302. P. 259-273.
14. Завлавская Н.И., Скурихина Л.А., Панькова В.В., Рязанова И.Н. Методы генетических исследований морских организмов: учебно-методическое пособие к спецкурсу «Методы генетических исследований». Владивосток, 2009. 160 с.
15. European Nucleotide Archive. URL: http://www.ebi.ac.uk/ena/da-ta/view/HF952710-HF952725 (дата обращения: 19.04.2014).
16. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28. № 10. P. 2731-2739.
17. Лукашов В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ. М.: БИНОМ, 2009. 256 c.
18. Sambrook J., Frisch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Labora-tion Manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. P. 1626.
19. Gharrett A.J., Gray A.K., Li Z. et al. A key to selected rockfishes (Sebastes spp.) based on mitochondrial DNA restriction fragment analysis // Fish. Bull. 2006. V. 104. P. 182-196.
20. Love M.S., Yoklavich M., Thorsteinson L. The rockfishes of the Northeast Pacific. Univ. Berkeley CA: California Press, 2002. 405 p.
БЛАГОДАРНОСТЬ: Благодарю за помощь и поддержку Орлюк Анну Сергеевну, Катугина Олега Николаевича, Атопкина Дмитрия Матвеевича, Картавцева Юрий Федоровича.
Поступила в редакцию 26 мая 2014 г.
Katugina A.O. COMPARATIVE GENETIC ANALYSIS SOME OF ROCKFISHES GENUS SEBASTES USING SEQUENCE DATA OF THE FIRST PART OF CONTROL REGION (D-LOOP) MITOCHONDRIAL DNA
The partial nucleotide sequences of control region (D-loop) of mitochondrial DNA were investigated. For the five rockfish species (Sebastes) from the Far Eastern seas of Russia the molecular phygenetic trees were built using Neighbor-joining, Maximum likelihood, and Maximum parsimony methods. The comparative analysis of data obtained on nucleotide sequences have been made jointly with the results in published papers and shown that all the representatives from the Sea of Japan, the Sea of Okhotsk and the Sea of Bering are clustered in a single node with the same species from other places. The average nucleotide divergence within S. taczanovskii was in range from 0.7 up to 1.4 %. These comparatively low genetic distances may mean that no significant barriers exist for the genetic exchange among populations of this species from different regions.
Key words: rockfish; mitochondrial DNA; Sebastes.
Катугина Анна Олеговна, Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток, Российская Федерация, аспирант по специальности «Ихтиология»; Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской Академии наук, г. Владивосток, Российская Федерация, младший научный сотрудник, e-mail: anna_katugina@yahoo.com
Katugina Anna Olegovna, Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russian Federation, Post-graduate Student of "Ichthyology" Speciality; A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Science, Vladivostok, Russian Federation, Junior Researcher, e-mail: anna_katugina@yahoo.com
1G18
