CC BY
243
УДК 617.7
сравнительная оценка цитотоксичности антимикробных глазных капель
© о. и. Александрова1, и. н. околов2, Ю. в. тахтаев2 3, Ю. и. Хорольская1, т. с. Хинтуба3, М. и. Блинова1
1 ФГБУН Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург;
2 Санкт-Петербургский филиал ФГБУ «МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С. Н. Федорова» Министерства здравоохранения Российской Федерации;
3 ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург
G Помимо широты спектра активности антибактериальных препаратов (АБП), а также их фар-макодинамических и фармакокинетических особенностей, важным аспектом является безопасность лекарственного средства. В настоящее время нет единого мнения о токсичности фторхи-нолонов. Цель данного исследования состояла в сравнении общего цитотоксического действия шести антибактериальных глазных капель фторхинолонового ряда: 1. Ципромед™ (ципроф-локсацин 0,3 %; производитель: «Сентисс Фарма Пвт. Лтд.», Индия); 2. Флоксал™ (офлокса-цин 0,3 %; производитель: «Др. Герхард Манн, Химико-фармацевтическое предприятие ГмбХ», Германия); 3. Офтаквикс™ (левофлоксацин 0,5 %; производитель: «АО Сантэн», Финляндия); 4. Сигницеф® (левофлоксацин 0,5 %; производитель: «Сентисс Фарма Пвт. Лтд.», Индия);
5. Вигамокс® (моксифлоксацин 0,5 %; производитель: «Алкон Лабораториз, Инк.», США);
6. Зимар® (гатифлоксацин 0,3 %; производитель: «Аллерган Сейлс ЛЛС», США) с использованием методов in vitro. Исследование показало принципиальную возможность использования культивируемых клеток для сравнительной оценки цитотоксического действия различных офтальмологических препаратов. Установлено, что протестированные АБП могут оказывать цитостатический эффект в условиях in vitro и отличаются по своему цитотоксическому потенциалу.
G ключевые слова: цитотоксичность; фторхинолоны; глазные капли.
A comparative evaluation of ANTIMICRoBIAL EYE DRops cYToToKiGiTY
© O. I. Aleksandrova1, I. N. Okolov2, Yu. V. Takhtaev2,3, Y. I. Khorolskaya1, T. S. Khintuba3, M. I. Blinova1
1 Institute of Cytology of the Russian Academy of Science, Saint Petersburg;
2 IR&TC «Eye Microsurgery» named after academician S. N. Fyodorov, St. Petersburg Branch;
3 State budget institution of higher education "North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov" under the Ministry of Public Health of the Russian Federation, Saint Petersburg
G In addition to the spectrum of antibacterial activity of antimicrobial medicines and their pharmacokinetic and pharmacodynamic properties, their safety is also an important issue. Currently, there is no consensus on the fluoroquinolone toxicity. The purpose of this study was to compare in vitro the overall cytotoxic effect of six antibacterial fluoroquinolone eye drops: 1. Cipromed™ (ciprofloxacin 0.3 %; Sentiss Pharma Pvt. Ltd., India); 2. Floxal™ (ofloxacin 0.3 %; Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik GmbH, Germany); 3. Oftaquix™ (levofloxacin 0.5 %; Santen Oy, Finland); 4. Signicef® (levofloxacin 0.5 %; Sentiss Pharma Pvt. Ltd., India); 5. Vigamox® (moxifloxacin 0.5 %; Alcon Laboratories, Inc., USA); 6. Zymar® (gatifloxacin 0.3 %; Allergan Sales LLC, USA). The study showed the possibility of using cultured cells for comparative evaluation of cytotoxic effects of various ophthalmic preparations. We found that tested antimicrobial medicines may have a cytostatic effect in vitro and differ in their cytotoxic potential. G Key words: cytitoxicity; fluoroquinolones; eye drops.
введение
Выбор антибактериальных глазных капель является важным этапом профилактики послеоперационных инфекционных осложнений. Фторхинолоны различных поколений занимали и продолжают занимать существенное место в профилактике эндофтальмитов после проведения офтальмохирургических операций. Глазные капли, содержащие в качестве МНН ципрофлок-сацин, офлоксацин и левофлоксацин, достаточно давно используются в офтальмологии. В последние годы из-за развития резистентности микроорганизмов к фторхинолонам «ранних» поколений во многих клиниках мира офтальмохирурги стали использовать в своей практике фторхино-лоны IV поколения — моксифлоксацин и гатиф-локсацин, а также безифлоксацин, который в настоящее время имеет ограниченное применение, пока только в Североамериканским регионе [4]. Помимо широты спектра и активности антибактериальных препаратов (АБП), а также их фармакодинамических и фармакокинетических особенностей, важным аспектом для их выбора является безопасность лекарственного средства. Выбирая антибактериальные глазные капли для профилактики послеоперационных осложнений офтальмохирургических операций, необходимо учитывать возможность возникновения нежелательных реакций, которые могут быть следствием токсического действия препарата на эпителиальные клетки конъюнктивы, роговицы и эндотелий роговой оболочки глаза.
Оценка цитотоксичности лекарственных препаратов в рамках стандартов Надлежащей лабораторной практики (GLP) является необходимым этапом их исследования на доклиническом этапе [19]. Под цитотоксичностью понимают появление патологических изменений в клетках при действии физических, химических и биологических агентов. В зависимости от силы и мишени воздействия возможна широкая гамма изменений, ограниченная с одной стороны цитостатическим эффектом, нарушающим прохождение клетки по клеточному циклу, а с другой стороны — цитоцидным эффектом, ведущим клетку к гибели [18, 20].
На уровне организма понимание цитотоксич-ности усложняется, поскольку конечный эффект цитотоксического действия химического вещества на клетки может зависеть от множества различных процессов и факторов [16].
Анализ научных публикаций, в которых приводятся сравнительные данные по оценке токсического воздействия офтальмологических
фторхинолонов на различные клеточные структуры глаза, показал, что в настоящее время нет единого мнения по данному вопросу [8]. В отдельных работах цитотоксичность антибактериальных глазных капель связывают с наличием в их составе бензалкония хлорида (БАХ). Данный консервант, как известно, может оказывать неблагоприятное воздействие на эпителий поверхности глаза и подлежащие структуры [13, 17]. Другие авторы считают, что сама молекула АБП может оказывать цитотоксическое действие [6].
Цель данного исследования состояла в сравнении общего цитотоксического действия шести антибактериальных глазных капель фторхиноло-нового ряда, зарегистрированных в Российской Федерации: 1. Ципромед™ (ципрофлоксацин 3 мг/мл; консервант БАХ 0,1 мг/мл; производитель: «Сентисс Фарма Пвт. Лтд.», Индия), далее — «ципрофлоксацин»; 2. Флоксал™ (офлоксацин 3 мг/мл; консервант БАХ 0,025 мг/мл; производитель: «Др. Герхард Манн, Химико-фармацевтическое предприятие ГмбХ», Германия), далее — «офлоксацин»; 3. Офтаквикс™ (левофлоксацин 5 мг/мл; консервант БАХ 0,05 мг/мл; производитель: «АО Сантэн», Финляндия), далее — «левофлоксацин (оригинальный)»; 4. Сигницеф® (левофлоксацин 5 мг/мл; консервант БАХ 0,1 мг/мл; производитель: «Сентисс Фарма Пвт. Лтд.», Индия), далее — «левофлоксацин (генерик)»; 5. Вигамокс® (мок-сифлоксацин 5 мг/мл; без консервантов; производитель: «Алкон Лабораториз, Инк.», США), далее — «моксифлоксацин»; 6. Зимар® (гатиф-локсацин 3 мг/мл; консервант БАХ 0,05 мг/мл; производитель: «Аллерган Сейлс ЛЛС», США), далее — «гатифлоксацин».
материалы и методы
Исторически сложилось, что токсикологическая экспертиза проводится на основании данных острых, подострых, хронических и других специальных исследований на теплокровных животных (мыши, крысы, морские свинки, кролики, реже — кошки и собаки, как исключение — обезьяны) [3].
До недавнего времени токсикологические исследования на животных считались «золотым стандартом», однако эти исследования являются трудоемкими и дорогостоящими, они травмируют подопытных животных и приводят к их гибели. Кроме того, исследования цитотоксичности лекарственных препаратов с использованием
систем in vivo осложняются наличием структурной и функциональной гетерогенности клеток и не могут быть использованы для раскрытия точных молекулярных механизмов действия лекарств. Поэтому в последние годы все чаще обосновываются предложения о разумном сочетании экспериментов in vivo, in vitro и in silico (компьютерное моделирование) для оптимизации оценки цитотоксичности лекарственных препаратов и биологически активных веществ [2]. Интерес к исследованиям in vitro постоянно повышается с этической точки зрения, так как это позволяет уменьшить количество используемых животных для биологического тестирования. Преимущество методов in vitro состоит в том, что они являются достаточно информативными для оценки общей цитотоксичности лекарственных препаратов и выявления их специфической токсичности. Высокая технологичность процесса исследований позволяет проводить быстрый скрининг одновременно нескольких препаратов непосредственно на клетках и тканях человека. В настоящее время существуют множество различных тест-систем для исследований in vitro: 1) изолированные перфузируемые органы; 2) тканевые срезы; 3) клеточные культуры/суспензии; 4) изолированные органеллы/мембраны/фер-менты; 5) системы беспозвоночных; 6) non-living системы; 7) компьютерные модели. Наиболее простыми и доступными системами являются монослойные клеточные культуры [1, 5]. Исследования на клеточных культурах позволяют проводить количественную оценку цитотоксично-сти и имеют практическое значение при выборе и обосновании применения лекарственных препаратов.
Используемые клеточные культуры
В эксперименте были использованы два типа клеток: клетки постоянной трансформированной клеточной линии СНО-К1 (клетки опухоли яичника китайского хомячка) и нормальные фи-бробласты кожи человека (ФК). Выбор данных клеточных культур обусловлен тем, что к общей токсичности чувствительны все клетки независимо от их происхождения и специализации в организме. Клетки CHO-K1, имеющие высокую эффективность клонирования и стабильный уровень спонтанных мутаций, активно применяются в качестве модельной тест-системы для скрининга потенциальной мутагенности и канцерогенности у млекопитающих (OECD, Test № 476:1997, IDT). Нормальные фибробла-
сты, сохраняющие на протяжении всего срока культивирования постоянный диплоидный набор хромосом и характерную морфологию, являются одной из наиболее перспективных моделей тест-систем для биохимико-токсикологических исследований in vitro. Гистологически в конъюнктиве различают эпителиальный слой (epithelium conjunctivae) и соединительнотканную основу — собственную пластинку конъюнктивы (lamina propria conjunctivae). Используемые для тестирования в данной работе клеточные культуры являются элементами таких тканей: клетки CHO-K1 — эпителиальной, а фибробласты — соединительной.
Методы оценки воздействия тестируемых АБП на клетки
Для определения жизнеспособности клеток использовали количественные и качественные методы оценки:
1. количественная оценка — метод клонирования клеток и колориметрический метод оценки пролиферации клеток;
2. качественная оценка — прижизненное визуальное наблюдение под инвертированным микроскопом за морфологическим состоянием клеток в процессе культивирования с фотофиксацией их в момент наблюдения. Метод клонирования. Клон — популяция
клеток, произошедших из одной клетки. Четкие клоны образуются при редком посеве отдельных клеток. Эффективность клонирования определяется процентным отношением числа образовавшихся клонов через N суток культивирования к числу посеянных клеток. Эффективность клонирования характеризует жизнеспособность клеток в данных условиях культивирования. Влияние тестируемых препаратов на эффективность клонирования проверяли на клетках линии СНО-К1. Клетки линии CHO-K1 высевали на чашки Петри диаметром 3 см из расчёта 100 клеток в 2 мл среды. Культивирование проводили на среде F12 с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37 °С в СО2-инкубаторе в газовой среде с 5 % СО2. Тестируемые препараты добавляли в питательную среду в момент посева клеток. Контролем служили клетки той же линии CHO-K1, культивировавшиеся в стандартных условиях без добавления препаратов. Срок культивирования составил 5 суток. Колонии, образовавшиеся за 5 суток культивирования, фиксировали 70 % раствором этанола и окрашивали 0,1 %
92
ВОПРОСЫ ОФТАЛЬМОФАРМАКОЛОГИИ
раствором генцианвиолета. Эффективность клонирования определяли как выраженную в процентах долю числа сформировавшихся колоний, состоящих из 10 и более клеток, по отношению к числу посеянных клеток.
Колориметрический метод оценки пролиферации клеток. Степень пролиферации (т. е. размножения и роста клеток) характеризует жизнеспособность клеток в данных условиях культивирования и определяется по оптической плотности красителя (генцианвиолет), связанного с клеточными белками и экстрагированного из клеток, окрашенных после фиксации их через N суток культивирования. Влияние тестируемых препаратов на пролиферацию определяли на клетках линии СНО-К1 и нормальных фибро-бластах кожи человека (ФК). Культивирование клеток проводили в 96-луночных планшетах. Клетки высевали из расчёта 400 клеток на лунку в 200 мкл среды. Культивирование клеток линии CHO-Ю проводили в среде F12 с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37 °С в СО2-инкубаторе в атмосфере 5 % СО2. ФК культивировали в среде DMEM/F12 с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота также при 37 °С в СО2-инкубаторе в атмосфере 5 % СО2. Тестируемые препараты добавляли в питательную среду в момент посева клеток. Контролем служили клетки линии CHO-К и ФК, культивировавшиеся в стандартных условиях. Срок культивирования — 6 суток. На 6-е сутки культивирования клетки фиксировали 70 % раствором этанола и окрашивали 0,1 % раствором генцианвиолета. Количество клеток, выросших за время культивирования, определяли методом фотоколориметрического анализа с помощью анализатора Fluorofot «Charity» (Россия) по опти-
ческой плотности красителя (генцианвиолета), связанного с клеточными белками. Измерения проводили при длине волны 570 нм. Предварительно была построена калибровочная кривая, с помощью которой по величине оптической плотности растворов в лунках судили о количестве клеток. Полученные данные обрабатывали с помощью компьютерной программы MS Excel. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.
Метод прижизненного наблюдения под инвертированным микроскопом с фотофиксацией позволяет визуально оценить морфологическое состояние клеток в процессе их культивирования в данных условиях и сравнить с контрольным вариантом. Прижизненное наблюдение под инвертированным микроскопом с фотофиксацией осуществляли в процессе культивирования обоих типов клеток как в средах, содержащих тестируемые АБП, так и в контроле.
Расчет концентрации препаратов для эксперимента
Для выявления различия в активности тестируемых АБП возникла необходимость в выборе тех концентраций глазных капель, при которых можно было наблюдать их действие на клетки. В зависимости от конструкции флакона объём одной капли варьирует от 25 до 50 мкл (как известно, конъюнктивальный мешок может вместить около 10 мкл жидкости). Концентрация АБП в капле принималась за 100 %. Для тестирования были выбраны две концентрации АБП от объёма питательной среды — 12,5 и 1,25 %, то есть разведение препаратов в 8 и в 80 раз.
Расчёт концентраций исследуемых препаратов в клинике и в эксперименте in vitro представлен в таблице 1.
Таблица 1
Соотношение концентраций исследуемых АБП в клинике и эксперименте
Клиника Эксперимент
Терапевтическая доза однократного применения (1 капля в конъюнктиваль-ный мешок) Метод клонирования Колориметрический метод
Доза препарата в конъ-юнктиваль-ном мешке (мкл) Концентрация препарата в капле (%) Доза препарата в чашке Петри (мкл/мл) Концентрация препарата в объёме питательной среды (%) Доза препарата в лунке(мкл/мкл) Концентрация препарата в объёме питательной среды (%)
25 100 250/2 12,5 25/200 12,5
10 100 25/2 1,25 2,5/200 1,25
G ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИЕ ВЕДОМОСТИ
Том VIII № 1 2015
ISSN 1998-7102
результаты
Влияние тестировавшихся АБП на эффективность клонирования оценивали на клетках линии СНО-К1 в двух сериях экспериментов с различной концентрацией тестируемых препаратов в объеме питательной среды — 12,5 и 1,25 %.
Результаты серии экспериментов по эффективности клонирования клеток линии СНО-К1 с концентрацией тестируемых препаратов от объёма питательной среды 12,5 % показали, что ни в одном из опытных вариантов данной серии экспериментов клетки линии СНО-К1 клоны не образовали. Все препараты в такой концентрации проявили высокую степень цито-токсичности при редком посеве клеток.
В процессе культивирования клеток линии СНО-К1 в питательной среде, содержащей 1,25 % тестируемых препаратов, было установлено, что эффективность клонирования в экспериментальных вариантах была ниже, чем в контроле. По эффективности клонирования по отношению к контролю препараты распределились следующим образом: ципрофлоксацин (74 %) = офлоксацин (74 %) > левофлоксацин (оригинальный) (56 %) > гатифлоксацин (51 %)
Рис. 1. Гистограмма эффективности клонирования клеток линии СНО-К1 на 5-е сутки культивирования в питательной среде, содержащей 1,25 % тестируемых препаратов. Варианты экспериментов: 1 — ципрофлоксацин, 2 — офлоксацин, 3 — левофлоксацин (оригинальный), 4 — левофлоксацин (генерик), 5 — моксифлоксацин, 6 — гатифлоксацин, К — контроль
> левофлоксацин (генерик) (45 %) > моксифлоксацин (18 %). Результаты представлены на рисунке 1.
Морфологическое состояние клонов и клеток в них представлено на рисунке 2.
Контроль
Рис. 2. Морфология клеток линии СНО-К1 в клонах, образовавшихся через 5 суток культивирования в среде содержащей 1,25 % тестируемых препаратов, (х20)
Представленных на рисунке 2 фотографиях наблюдаются различия в морфологии клонов и отдельных клеток в контроле и экспериментальных вариантах. В контроле: колонии плотные, эпителиоподобной формы, сформированы из 100 и более клеток типичных для линии CHO-К1. Наиболее близкими к контролю по морфологическим признакам клонов и клеток, следует отметить клоны, культивировавшиеся при добавлении ципрофлоксацина и офлоксацина. В обоих вариантах присутствуют как плотные, так и диффузные по структуре клоны, сформированные из 50—80 клеток. В варианте с левоф-локсацином (оригинальным) клоны имеют более диффузную структуру и состоят из 20—50 клеток, не всегда имеющих характерную эпителио-подобную морфологию. В колониях преобладают округлившиеся и вытянутые клетки, с зернистой структурой, вакуолями. В вариантах с левофлок-сацином (генерик) и гатифлоксацином наблюдается наиболее сильная вакуолизация клеток, а в варианте с моксифлоксацином колонии очень мелкие, диффузные и содержат менее 10 клеток. Полученные результаты показали, что тестировавшиеся АБП в концентрации 1,25 % от объёма питательной среды оказывают на клетки линии CHO-К1 цитотоксическое действие разной степени. Наиболее цитопатогенное действие на клетки линии CHO-К1 оказывал моксифлоксацин.
Влияние тестировавшиеся АБП на пролиферацию определяли на клетках линии CHO-К1 и нормальных фибробластах кожи человека (ФК). С каждым типом клеток было вы-
полнено по две серии экспериментов с различной концентрацией тестируемых препаратов 12,5 и 1,25 % от объёма питательной среды. Проведение фотоколориметрического анализа выявило очень высокую степень токсичности всех тестируемых АБП, присутствующих в составе питательной среды в концентрации 12,5 %, как для клеток линии CHO-К1, так и для ФК. Результаты обеих серий экспериментов на клетках линии CHO-К1 и ФК с концентрацией тестируемых АБП 1,25 % от объёма питательной среды, полученные с помощью метода фотоколориметрического анализа, приведены на рисунке 3.
При концентрации тестируемых препаратов 1,25 % от объёма питательной среды, было установлено цитотоксическое действие АБП на клетки линии CHO-К1 в следующей последовательности (по убыванию токсичности): моксифлоксацин > левофлоксацин (оригинальный) > левофлокса-цин (генерик) > гатифлоксацин > ципрофлокса-цин > офлоксацин.
Цитотоксическое действие АБП в той же концентрации на ФК представлено следующим образом (по убыванию токсичности): ципрофлок-сацин > моксифлоксацин = гатифлоксацин > левофлоксацин (генерик) = левофлоксацин (оригинальный) > офлоксацин.
обсуждение
Помимо токсического действия, которое могут оказывать фторхинолоны при системном применении: суставные и мышечные боли, разрывы сухожилий, нефро- и гепатотоксичность, действие
Рис. 3. Гистограммы оценки пролиферации клеток линии СНО-К1 и ФК в присутствии тестируемых АБП в питательной среде в концентрации 1,25 %. Варианты экспериментов: 1 — ципрофлоксацин, 2 — офлоксацин, 3 — левофлоксацин (оригинальный), 4 — левофлоксацин (генерик), 5 — моксифлоксацин, 6 — гатифлоксацин, К — контроль
на лимфатическую систему, имеются сообщения о нежелательных реакциях при местном применении антибактериальных глазных капель фторхино-лонового ряда: синдром «сухого глаза», кровоизлияния под конъюнктиву, деструкция стекловидного тела, увеит, диплопия, оптическая нейропатия, депигментация радужки, а в отдельных случаях отслойка сетчатки и перфорация роговицы.
В настоящее время не существует стандартных методик по определению цитотоксичности глазных капель, в т. ч. антибактериальных. Стоит также отметить, что интерпретация результатов экспериментальных исследований in vitro и in vivo не всегда коррелирует с клинической картиной нежелательных реакций, возникающих при использовании местных лекарственных форм [10].
Результаты оценки цитотоксичности антибактериальных глазных капель фторхинолонового ряда, полученные в данном исследовании in vitro показали, что антибактериальные глазные капли имеют различную степень цитотоксичности. Все протестированные препараты обла дали ярко выраженным цитотоксическим действием на клетки линии CHO-K1 (клетки опухоли яичника китайского хомячка) и на нормальные фибробла-сты кожи человека (ФК) в концентрации 12,5 % от объёма питательной среды. При концентрации тестировавшихся препаратов 1,25 % от объёма питательной среды нами были установлены различия в степени их токсичности: наиболее цито-токсичным для клеток линии CHO-K1 оказался моксифлоксацин, а для ФК — ципрофлоксацин.
Несмотря на некоторые отличия в методологии проведения эксперимента по оценке ци-тотоксичности антибактериальных глазных капель, наши данные во многом совпадают с результатами, опубликованными в зарубежной научной литературе. Проведённые ранее зарубежные исследования показали, что фторхино-лоны в различной степени способны подавлять пролиферацию кератоцитов [14] и при высоких концентрациях оказывать цитотоксический эффект на эндотелий роговицы [12]. В ранних работах по оценке цитотоксичности фторхинолонов было установлено, что ципрофлоксацин обладал наименьшей цитотоксичностью по отношению к роговичному эпителию в сравнении с норф-локсацином и офлоксацином, а также гентами-цином и тобрамицином [9]. В последние годы в научной литературе появились публикации, в которых оценивалась цитотоксичность фторхи-нолонов III—IV поколений. В экспериментальных исследованиях было установлено, что левофлок-
сацин является менее токсичным фторхиноло-ном, чем моксифлоксацин или гатифлоксацин [7]. По данным других авторов, из пяти офтальмологических фторхинолонов левофлоксацин также показал наименьшую цитотоксичность по отношению к клеткам эндотелия роговицы человека и к кератоцитам, а ципрофлоксацин оказался наиболее цитотоксичным [8]. Kim S. et al. (2007) установили, что жизнеспособность эпителиоци-тов роговицы человека через 24 часа экспозиции культуры клеток в присутствии левофлоксацина составила 64 %, в то время, только 5 % клеток были жизнеспособными после экспозиции в присутствии моксифлоксацина. Кроме того, оценка миграционной способности клеток показала, что в течение 24 часов в присутствии левофлоксаци-на реэпителизация проходила на 95 %, что существенно не отличалось от контроля, а для мок-сифлоксацина этот показатель составил 60 %. Этот факт имеет важное значение, поскольку быстрая реэпителизация роговицы помогает предотвратить вторичное инфицирование глазной поверхности и другие возможные осложнения [11].
Несмотря на опубликованные результаты экспериментальных исследований, свидетельствующие о потенциальной цитотоксичности офтальмологических фторхинолонов IV поколения, в последнее время появляются сообщения, в которых данная информация подвергается сомнению. Так, по данным Watanabe R. et al. (2010), не было установлено статистически достоверных различий между токсичностью левофлок-сацина и моксифлоксацина и неблагоприятного воздействия этих АБП на эпителий и эндотелий роговицы здоровых добровольцев. Оба препарата хорошо переносились и были безопасными при инстилляциях. Эти данные согласуются с результатами другого исследования, в котором также не было выявлено достоверных различий в скорости заживления роговицы среди двух групп пациентов, которые в послеоперационном периоде после факоэмульсификации катаракты получали инстилляции глазных капель моксифлоксацина и левофлоксацина, хотя и наблюдалась тенденция к более быстрому темпу эпителизации в группе левофлоксацина [11]. Авторы сделали вывод, что профилактическое применение фторхинолонов IV поколения в форме антибактериальных глазных капель пациентам в послеоперационном периоде не должно вызывать серьёзных опасений по поводу кератоток-сичности этих АБП.
заключение
Проведенное исследование показало принципиальную возможность использования культивируемых клеток для сравнительной оценки цитотоксического действия различных офтальмологических препаратов in vitro. Представленные в работе результаты исследований по оценке цитотоксичности антибактериальных глазных капель из группы фторхинолонов II—IV поколений демонстрируют, что данные АБП могут оказывать цитостатический эффект в условиях in vitro и отличаются по своему цитотоксическому потенциалу. Офтальмологи должны представлять, что любой офтальмологический препарат, в том числе и антибактериальный, может потенциально оказывать цитотоксическое действие на ткани глаза. Анализ и оценку полученных результатов следует экстраполировать на клинические признаки, которые, как правило, являются неспецифическими. Отмена лекарственного средства или его замена, на менее токсичный препарат, может решить проблему устранения нежелательных реакций, возникающих при использовании глазных капель.
Работа выполнена в рамках проекта РНФ № 14-50-00068.
список литературы
1. Еропкин М. Ю., Еропкина Е. М. Культуры клеток как модельная система исследования токсичности и скрининга цитопро-текторных препаратов. СПб.: Морсар АВ; 2003.
2. Данченко Е. О. Оценка цитотоксичности фармацевтических субстанций с использованием клеточных культур. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2012; 2: 22-31.
3. Курляндский Б. А., Филатов В. А. Общая токсикология. М.: Медицина; 2002.
4. Околов И.Н, Поляк М. С. Моксифлоксацин как средство профилактики и лечения инфекции глаз. Новое в офтальмологии. 2011; 3: 64-71.
5. Романова С. Г., Серебренникова Г. А., Штиль А. А. Синтез, изучение цитотоксических свойств и гемолитической активности катионных глицеролипидов алкильного типа. Вестник МИТХТ. 2008; 3 (5): 101-5.
6. Ayaki M., Iwasawa A., Soda M. et al. Cytotoxicity of five fluoroquinolone and two nonsteroidal anti-inflammatory benzalkonium chloride-free ophthalmic solutions in four corneoconjunctival cell lines. Clinical Ophthalmology. 2010; 4:1019-24.
7. Ayaki M., Iwasawa A., Niwano Y. In vitro assessment of the cytotoxicity of six topical antibiotics to four cultured ocular surface cell lines. Biocontrol Sci. 2012: Jun; 17 (2): 93-9.
8. Bezwada P., Clark L., Schneider S. Intrinsic cytotoxic effects of fluoroquinolones on human corneal keratocytes and endothelial cells. Current Medical Research and Opinion. 2008; 24: 1-6.
9. Cutarelli P., Lass J., Lazarus H. et al. Topical fluoroquinolones: antimicrobial activity and in vitro corneal epithelial toxicity. Curr Eye Res. 1991: Jun; 10 (6): 557-63.
10. Dart J. Corneal toxicity: the epithelium and stroma in iatrogenic andfactitious disease. Eye. 2003; 17: 886-92.
11. Han K., Chung W., Kim T. et al. Epithelial wound healing after cataract surgery comparing two different topical fluoroquinolones. Yonsei Med J. 2014; 55 (1): 197-202.
12. Kaji Y., Oshika T. Fluoroquinolone Toxicities to Corneal Endothelial Cells. Atarashii Ganka. Journal of the Eye. 2007; 24 (9): 1229-32.
13. Kim S., Lim J., Choi J. et al. Comparison of antibiotic effect and corneal epithelial toxicity between levofloxacin and moxifloxa-cin in vitro.Cornea. 2007; 26: 720-5.
14. Sakurai M., Hatou S., Mochizuki H. In vitro effects of fluoroquinolones on corneal epithelial cells and keratocytes. Atarashii Gan-ka.2006; 23: 1209-12.
15. Watanabe R., Nakazawa T., Yokokura S. et al. Fluoroquinolone antibacterial eye drops: effects on normal human corneal epithelium, stroma, and endothelium. Clinical Ophthalmology. 2010; 4: 1181-7.
16. Johnson P. J. Acute and chronic liver disease. Metabolic and Clinical Aspects. W. J. Marshall, S. K. Bangert, eds.Clinical Biochemistry. Churchill livigstone. 1995; 237-56.
17. Oum B., Kim N., Lee J., Park Y. Effects of fluoroquinolone eye solutions without preservatives on human corneal epithelial cells in vitro. Ophthalmic Res. 2014; 51 (4): 216-23.
18. Sturgill M. G., Lambert G. H. Xenobiotic induced hepatotoxicity: mechanisms of liver injury and methods of monitoring hepatic function. Clinical Chemistry. 1997; 43 (8): 1512-26.
19. Tweedale A. C. Uses of «Good Laboratory Practices» by regulated industry and agencies, and the safety of bisphenol A. J. Epidemiol. Community Health. 2011; 65 (6): 475-76.
20. Zimmerman H. J. Hepatotoxicity: The adverse effects of drugs and other chemicals on the liver, 2nd ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 1999.
references
1. Eropkin M.Ju., Eropkina E. M. Kul'tury kletok kak model'naja sistema issledovanija toksichnosti i skrininga citoprotektornyh preparatov. [Cell cultures as a model for toxicity tests and screening of cytoprotector preparations]. SPb. Morsar AV; 2003.
2. Danchenko E. O. Ocenka citotoksichnosti farmacevticheskih sub-stancij s ispol'zovaniem kletochnyh kul'tur. [Assessment of cytotoxicity of pharmaceutical substances using cell cultures]. Immu-nopatologija, allergologija, infektologija. 2012; 2: 22-31.
3. Kurljandskij B. A., Filatov V. A. Obshhaja toksikologija. [General toxicology]. M.: Medicina; 2002.
4. Okolov I.N, Poljak M. S. Moksifloksacin kak sredstvo profilaktiki i lechenija infekcii glaz. [Moxifloxacin as a drug for prophylaxis and treatment of eye infections]. Novoe v oftal'mologii. 2011; 3: 64-71.
5. Romanova S. G., Serebrennikova G. A., Shtil' A. A. Sintez, izuche-nie citotoksicheskih svojstv i gemoliticheskoj aktivnosti kationnyh glicerolipidov alkil'nogo tipa. [Synthesis, examination of cytotoxic
properties and hemolytic activity of cationic alkil glycerol lipids]. Vestnik MITHT. 2008; 3 (5): 101-5.
6. Ayaki M., Iwasawa A., Soda M. et al. Cytotoxicity of five fluoroquinolone and two nonsteroidal anti-inflammatory benzalkonium chloride-free ophthalmic solutions in four corneoconjunctival cell lines. Clinical Ophthalmology. 2010; 4: 1019-24.
7. Ayaki M., Iwasawa A., Niwano Y. In vitro assessment of the cytotoxicity of six topical antibiotics to four cultured ocular surface cell lines. Biocontrol Sci. 2012: Jun; 17 (2): 93-9.
8. Bezwada P., Clark L., Schneider S. Intrinsic cytotoxic effects of fluoroquinolones on human corneal keratocytes and endothelial cells. Current Medical Research and Opinion. 2008; 24: 1-6.
9. Cutarelli P., Lass J., Lazarus H. et al. Topical fluoroquinolones: antimicrobial activity and in vitro corneal epithelial toxicity. Curr Eye Res. 1991: Jun; 10 (6): 557-63.
10. Dart J. Corneal toxicity: the epithelium and stroma in iatrogenic andfactitious disease. Eye. 2003; 17: 886-92.
11. Han K., Chung W., Kim T. et al. Epithelial wound healing after cataract surgery comparing two different topical fluoroquinolones. Yonsei Med J. 2014; 55 (1): 197-202.
12. Kaji Y., Oshika T. Fluoroquinolone Toxicities to Corneal Endothelial Cells. Atarashii Ganka. Journal of the Eye. 2007; 24 (9): 1229-32.
Сведения об авторах:_
Александрова Ольга Игоревна — младший научный сотрудник, отдел клеточных культур, лаборатория биологии клетки в культуре, группа клеточной биотехнологии. ФГБУН Институт цитологии РАН. 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4. E-mail: elga.aleks@gmail.com.
Околов Игорь Николаевич — к. м. н., врач высшей категории, заведующий клинико-бактериологической лабораторией Санкт-Петербургского филиала ФГБУ «МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С. Н. Федорова» Министерства здравоохранения РФ. 192283, Санкт-Петербург, ул. Я. Гашека, д. 21.
Тахтаев Юрий Викторович — д. м. н., профессор, заведующий кафедрой офтальмологии. ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения РФ; заместитель директора по научно-педагогической работе Санкт-Петербургского филиала ФГБУ «МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С. Н. Федорова» Министерства здравоохранения РФ. 195196, Санкт-Петербург, Заневский пр., д. 1/82.
Хорольская Юлия Игоревна — лаборант-исследователь, отдел клеточных культур, лаборатория биологии клетки в культуре, группа клеточной биотехнологии. ФГБУН Институт цитологии РАН. 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.
Хинтуба Тамара Славиковна — врач-офтальмолог, аспирант кафедры офтальмологии. ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения РФ. 195196, Санкт-Петербург, Заневский пр., д. 1/82.
Блинова Миральда Ивановна — к. б. н., ведущий научный сотрудник, отдел клеточных культур, лаборатория биологии клетки в культуре, группа клеточной биотехнологии. ФГБУН Институт цитологии РАН. 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.
13. Kim S., Lim J., Choi J. et al. Comparison of antibiotic effect and corneal epithelial toxicity between levofloxacin and moxifloxa-cin in vitro. Cornea. 2007; 26: 720-5.
14. Sakurai M., Hatou S., Mochizuki H. In vitro effects of fluoroquinolones on corneal epithelial cells and keratocytes. Atarashii Ganka. 2006; 23: 1209-12.
15. Watanabe R., Nakazawa T., Yokokura S. et al. Fluoroquinolone antibacterial eye drops: effects on normal human corneal epithelium, stroma, and endothelium. Clinical Ophthalmology. 2010; 4: 1181-1187.
16. Johnson P. J. Acute and chronic liver disease. Metabolic and Clinical Aspects. W. J. Marshall, S. K. Bangert, eds.Clinical Biochemistry. Churchill livigstone. 1995; 237-56.
17. Oum B., Kim N., Lee J., Park Y. Effects of fluoroquinolone eye solutions without preservatives on human corneal epithelial cells in vitro. Ophthalmic Res. 2014; 51 (4): 216-23.
18. Sturgill M. G., Lambert G. H. Xenobiotic induced hepatotoxicity: mechanisms of liver injury and methods of monitoring hepatic function. Clinical Chemistry. 1997; 43 (8): 1512-26.
19. Tweedale A. C. Uses of «Good Laboratory Practices» by regulated industry and agencies, and the safety of bisphenol A. J. Epidemiol. Community Health. 2011; 65 (6): 475-76.
20. Zimmerman H. J. Hepatotoxicity: The adverse effects of drugs and other chemicals on the liver, 2nd ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 1999.
Aleksandrova Olga Igorevna — junior research scientist, Department of cell cultures, Laboratory of cell biology in culture, Group of cell biotechnology. Institute of Cytology of the Russian Academy of Science. 194064, St. Petersburg, Tikhoretskiy pr., 4. E-mail: elga.aleks@gmail.com.
Okolov Igor Nikolaevich — MD, PhD, Head of the Clinical Bacteriological Laboratory of the St. Petersburg branch of IR & TC «Eye Microsurgery» named after academician S. N. Fyodorov. 192283, St. Petersburg, Yaroslava Gasheka St., 21.
Takhtaev Yuri Victorovich — DSci, Prof., Head of the Ophthalmology department. State budget institution of higher education "North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov" under the Ministry of Healthcare of the Russian Federation. Vice-director of the St. Petersburg branch of IR & TC "Eye Microsurgery" named after academician S. N. Fyodorov. 195196, St. Petersburg, Zanevskiy pr., 1/82.
Khorolskaya Juliya Igorevna — laboratory assistant-scientist, Department of cell cultures, Laboratory of cell biology in culture, Group of cell biotechnology. Institute of Cytology of the Russian Academy of Science. 194064, St. Petersburg, Tikhoretskiy pr., 4.
Hintuba Tamara Slavikovna — MD, ophthalmologist, research student, Dep. of Ophthalmology. State budget institution of higher education "North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov" under the Ministry of Healthcare of the Russian Federation. 195196, St. Petersburg, Zanevskiy pr., 1/82.
Blinova Miralda Ivanovna — PhD, leading research scientist, Department of cell cultures, Laboratory of cell biology in culture, Group of cell biotechnology. Institute of Cytology of the Russian Academy of Science. 194064, St. Petersburg, Tikhoretskiy pr., 4.
