CC BY
87
УДК 576.3:577.12
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОРЕЗОРБЦИИ КЛЕТОЧНЫХ И БЕСКЛЕТОЧНЫХ МАТРИКСОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИОКСИАЛКАНОАТОВ И ПОЛИКАПРОЛАКТОНА, ПОТЕНЦИАЛЬНО ПРИГОДНЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГИБРИДНОГО СОСУДИСТОГО ГРАФТА МАЛОГО ДИАМЕТРА
Л. В. АНТОНОВА, А. Ю. БУРАГО, В. Г. МАТВЕЕВА, Я. Г. ТОРОПОВА,
Е. А. ВЕЛИКАНОВА, Ю. А. КУДРЯВЦЕВА, М. В. НАСОНОВА, А. С. ГОЛОВКИН Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Кемерово, Россия
Цель. Изучить влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) на скорость биодеградации сополимерных композиций из полиоксиалканоатов и поликапролактона, потенциально пригодных для создания сосудистого графта.
Материалы и методы. В работе использованы: пленочный матрикс (ПМ) № 1 на основе 5 % полигидроксибутирата с вале-ратом (ПГБВ) и 10 % поликапролактона (PCL) и ПМ № 2 на основе 7,5 % ПГБВ и 10 % PCL. ММСК КМ получали путем выделения костного мозга из бедренных костей крыс линии Wistar.
Результаты. В ходе эксперимента выявлено, что ПМ № 2 начал резорбироваться на два месяца раньше, чем ПМ № 1, за счет большей доли ПГБВ.
Выводы. Наличие ММСК КМ отодвигало начало биорезорбции сополимерных матриксов на месяц с параллельным сокращением продолжительности воспалительной реакции со стороны окружающих тканей.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, биополимеры, время биодеградации.
COMPARING BIORESORPTION OF PLAIN AND CELL-LOADED POLYHYDROXYALKANOATE AND POLYCAPROLACTONE SCAFFOLDS POTENTIALLY SUITABLE FOR SMALL HYBRID
VASCULAR GRAFTS PRODUCTION
L. V. ANTONOVA, A. Y. BURAGO, V. G. MATVEEVA, Y. G. TOROPOVA,
E. A. VELIKANOVA, Y. A. KUDRYAVTSEVA, М. V. NASONOVA, A. S. GOLOVKIN
Federal State Budgetary Institution «Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases» under the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Kemerovo, Russia
Purpose. The study was aimed at evaluating the impact of multipotent mesenchymal stromal cells derived from the marrow (MMSC) on the biodegradation speed of polyhydroxyalkanoate and polycaprolactone copolymer compositions potentially suitable for small vascular graft production.
Materials and methods. The study compared film scaffold (FS) № 1 made from 5 % polyhydroxybutirate and valerate and 10 % polycaprolactone (PCL) and film scaffold (FS) № 2 made from 7,5 % polyhydroxybutirate and valerate and 10 % PCL. MMSC were derived from Wistar rat femoral bones.
Results. The experiment showed that FS № 2 resorption started 2 months earlier than that of FS № 1 due to higher percentage of polyhydroxybutirate and valerate.
Conclusions. The presence of MMSC delayed the start of copolymer scaffold bioresorption for 1 month and reduced the duration inflammatory response in the surrounding tissues.
Keywords: multipotent mesenchymal stromal cells, biopolymers, biodegradation time.
Введение
Биодеградируемые полимеры широко применяются в клеточной трансплантологии и тканевой инженерии [4, 6, 11]. На их основе создаются шовные материалы, трансплантаты для восстановления хрящевой, костной ткани и кожи. Ведутся разработки по созданию сосудистых протезов. Однако в каждом случае выбор полимера обусловлен сроком его
биодеградации, который должен быть достаточным для завершения регенерации или воссоздания органа. Так, для создания сосудистого графта пригодны гемосовместимые биополимеры, скорость биодеградации которых не должна быть меньше 2-3 лет. Именно за это время на месте биорезорбируемого сосудистого графта формируется новый собственный сосуд.
Полигидроксиалканоаты - линейные полимеры, получаемые микробиологическим путем при бактериальной ферментации сахаров или липидов. В силу особенностей биосинтеза материалов этой группы существует возможность получения широкого спектра значений скорости деградации и механических параметров, что позволяет применять поли-оксиалканоаты в различных областях медицинской науки и практики [1].
Поликапролактон - полимер, обладающий малой скоростью гидролиза эфирной связи. Продукты гидролиза поликапролактона утилизируются макрофагами и глиальными клетками с возможным возникновением воспалительной реакции. Однако в настоящее время существует ряд экспериментальных работ, доказывающих пригодность поликапролактона в качестве основы для создания сосуцистых графтов [5, 6, 7].
При этом в случае заселения внутренней поверхности графта функционально активными клетками (мультипотентными мезенхимальными стро-мальными или эндотелиальными) необходимо иметь четкую уверенность, что культивирование подобных клеточных типов не повлияет на скорость биодеградации сополимерного каркаса. Вместе с тем различные типы клеток обладают специфическими функциональными свойствами и в процессе своей жизнедеятельности синтезируют массу биоактивных веществ, способных оказывать влияние на некоторые характеристики полимерных конструкций.
Мультипотентные мезенхимальные стромаль-ные клетки (ММСК) способны секретировать как компоненты внеклеточного матрикса (фибронектин, коллаген, протеогликаны, ламинин) [3, 9, 10], так и комплекс цитокинов с противовоспалительным и ан-тиапоптотическим действием и хемокинов, участвующих в поддержании гемопоэза (ИЛ 1, ИЛб, ИЛ7, ИЛ8, ИЛ11, факторы роста стволовых клеток и гепатоци-тов, макрофагальный, сосудисто-эндотелиальный, гранулоцитарно-макрофагальный) [2, 8, 9]. Известен также хоуминг-эффекг ММСК, реализующийся через выработку цитокина БОР-1 [10].
Взаимодействие в системе «функционально активная клетка - клеточный носитель» реализуется через иммунологические механизмы внутри организма. Метаболизм клетки способен вносить серьезные изменения в процессы резорбции клеточного носителя. Однако, несмотря на широкий интерес к биодегради-руемым полимерам, вопрос влияния функционально активных клеточных типов на скорость резорбции полимеров остается до конца неизученным.
Цель исследования
Изучить влияние мупьтипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на скорость биодеградации сополимерных композиций из полиок-сиалканоатов и поликапролактона, потенциально пригодных для создания гибридного сосудистого графта.
Материалы и методы
Двухмерные матриксы в виде пленок получали методом полива растворов полимеров в хлороформе на обезжиренную поверхность стекла. Использовали пленочные матриксы (ПМ) следующего состава: ПМ J4e 1 — композиция 5 % полиги-дроксибутирата с гидроксивалератом (ПГБВ) ММ 2307кДа (производитель - Институт биохимии и физиологии им. Г. К. Скрябина СО РАН (г. Пущине, Московская область) и 10 % поликапролактон (PCL) ММ 80000кДа (Sigma, США); ПМ № 2 - композиция 7,5 % ПГБВ и 10 % PCL. Культуру ММСК КМ получали путем выделения костного мозга бедренных костей крыс линии Wistar. Культивирование клеток проводили при 37 °С и 5 % СО, в среде DMEM, содержащей 1 % HEPES буфера, 10 % эмбриональной бычьей сыворотки, 1 % L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 0,1 мкг/мл стрептомицина,
0,1 мкг/мл амфотерицина В. Фенотип каждого пассажа определяли методом проточной цитофлуори-метрии с использованием моноклональных антител CD90, CD45, CD106 и CDllb, меченных флуорох-ромами. Жизнеспособность клеток до и после культивирования на сополимерных пленках оценивали путем окрашивания 0,1 %-ным раствором трипано-вого синего. ММСК КМ 4 пассажа высевали на матрицы, расположенные в 6-луночных культуральных планшетах, в концентрации 4,1 х Ю5 на лунку и культивировали в течение 7 дней. За сутки до окончания культивирования в две контрольные лунки с ПМ № 1 и № 2 добавляли флуорохром РКН26 с последующим подсчетом меченных ММСК КМ, видимых в десяти полях зрения микроскопа, усредненных и пересчитанных на единицу площади в 1 мм2. Матриксы с клетками (опыт) и без них (контроль) имплантировали подкожно 36 крысам линии Wistar. Вывод животных из эксперимента с оценкой гистологической картины осуществляли ежемесячно вплоть до 6 месяцев.
Экспрессию VEGF в тканях, окружающих имплантированные матриксы с клетками, оценивали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания замороженных срезов (толщина 14 мкм). Срезы предварительно фиксировали ацетоном. Окрашивание осуществляли поликлональными антителами кролика к VEGF крысы. В качестве вторичных антител использовали ослиные антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с FITC (Millipore, США). Полученные препараты анализировали при помощи флюоресцентного микроскопа «Axio Imager. А1» (Carl Zeiss, Германия).
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica 6.0. При всех видах статистического анализа учитывался уровень статистической значимости 95 % (р < 0,05).
Результаты
Перед культивированием на матриксах количество жизнеспособных ММСК КМ 4 пассажа составило 99,6 %. При этом 89,3 % были CD 90+, 45 , 106 , lib , что соответствовало фенотипу ММСК. Количество клеток на ПМ № 1 и ПМ № 2 через 7 дней культивирования соответствовало 361,3 ± 7,7 и 404,8 ± 5,5 кл/мм2 (жизнеспособных - 93,8 и 96,0 % соответственно).
Выявлено, что воспалительная реакция в тканях вокруг сополимерных матриксов № 1 и № 2 без клеток однотипна, проявлялась в виде умеренной и очаговой лимфогистиоцитарной инфильтрации и сохранялась в течение месяца. Однако частота встречаемости воспалительной реакции в тканях вокруг ПМ № 1 в 2 раза превосходила таковую в случае с ПМ № 2 (66,7 против 33,3 %; р < 0,05). Следовательно, биосовместимость матриксов in vivo выше у образцов, содержащих в своем составе 7,5 % ПГБВ.
Однако обнаружено, что распад образцов с 7,5 % содержанием ПГБВ начался уже через месяц после имплантации (рис. 1), о чем свидетельствовало появление многокамерных фиброзных капсул с расположенным внутри полимером и образование внутри капсул фиброзно-коллагеновых перемычек, подтверждавших наличие изъязвлений на поверхности пленочных матриксов. При этом образцы с 5 % включением ПГБВ начали медленно деградировать лишь через 3 месяца после подкожной имплантации, на что указывало появление многокамерной тонкостенной полости, в которой располагался матрикс, и отсутствие внутри полости фиброзно-коллагеновых перемычек.
При изучении частоты воспалительной реакции со стороны окружающих тканей при имплантации матриксов № 1 и № 2 с ММСК КМ выявлено, что воспалительные изменения в тканях нивелировались в 2 раза быстрее, чем вокруг образцов без клеток (14 дней против месяца, р < 0,05), что косвенно подтверждает противовоспалительное влияние ММСК КМ.
Известно, что резорбция полиоксиалканоатов и поликапролактона in vivo происходит с привлечением клеток моноцитарно-макрофагальной системы. В нашем эксперименте сокращение продолжительности
ПМ № 1
Без ММСК КМ С ММСК КМ
воспалительной реакции в тканях вокруг ПМ № 1 и № 2 с ММСК КМ на своей поверхности привело к отсрочке начала деградации матриксов на месяц (рис. 1).
Так, биодеградация ПМ № 2 (с 7,5 % включением ПГБВ) с клетками началась через 2 месяца после подкожной имплантации, тогда как признаки резорбции подобного матрикса без клеток отмечены уже через месяц после подкожной имплантации. Медленная деградация ПМ № 1 (с 5 % включением ПГБВ) с ММСК КМ началась через 4 месяца, тогда как подобный же бесклеточный матрикс начал резорбироваться к окончанию 3-го месяца подкожной имплантации. Таким образом, увеличение доли ПГБВ в сополимерных композициях вело к ускорению их распада, а присутствие ММСК КМ на поверхности матриксов задерживало биодеградацию на месяц, снижая выраженность воспалительной реакции окружающих тканей и, как следствие, ограничивая привлечение клеток моноцитарно-макрофагальной системы, ответственных за осуществление распада биополимеров in vivo.
Известно, что лишь жизнеспособный клеточный пул способен оказывать на окружающие ткани полноценный паракринный эффект. Косвенным отображением жизнеспособности и длительности пребывания ММСК КМ на матриксах является определение в тканях, окружающих матриксы с клетками, сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF), выделяемого ММСК. Нами отмечено, что максимальная экспрессия данного ростового фактора наблюдалась в течение первого месяца подкожной имплантации матриксов с клетками с заметным снижением в последующие периоды (рис. 2). При этом макроскопически над зоной матриксов, содержащих ММСК КМ, отмечалось полнокровие сосудов подкожной жировой клетчатки. К концу 4-го месяца достоверной разницы в окрашивании флуоресцентным красителем на VEGF тканей вокруг клеточных и бес-клеточных матриксов не зафиксировано.
Обсуждение
Таким образом, выбранные композиции долевого соотношения ПГБВ и PCL для изготовления клеточных матриксов продемонстрировали высокую
ПМ № 2
Без ММСК КМ С ММСК КМ
Через 3 месяца Через 4 месяца Через 1 месяц Через 2 месяца
Рис. 1. Начало биорезорбции матриксов с ММСК КМ и без клеток после подкожной имплантации (у в. X 100; окраска гематоксилин-эозином)
ПМ № 1 - 1 месяц
ПМ № 2 - 1 месяц
ПМ № 1 - 2 месяца
ПМ № 2 - 2 месяца
ПМ № 1 - 4 месяца
ПМ № 2 - 4 месяца
ПМ № 1 -контроль, 4 месяца
ПМ № 2 -контроль, 4 месяца
Рис. 2. Внутритканевая экспрессия VEGF вокруг пленочных матриксов с ММСК КМ в сравнении с контролем (матриксы без клеток) в различные временные интервалы подкожной имплантации (ув. X 200)
биосовместимость in vitro (клеточная адгезия) и in vivo (реакция окружающих тканей) и пригодны для создания сополимерного каркаса гибридного сосудистого графта. Увеличение доли ПГБВ в сополимер-ных композициях приводило к ускорению их распада, что нежелательно, однако резорбция матриксов на основе 7,5 % ПГБВ и 10 % PCL отмечена только микроскопически. Присутствие ММСК КМ на поверхности ПМ № 1 и № 2 задерживало биодеградацию, снижая воспалительную реакцию окружающих тканей на имплантацию матриксов и привлечение клеток моноцитарно-макрофагальной системы, ответственных за осуществление распада биополимеров in vivo. Данный факт может нивелировать минусы, связанные с включением в сополимерную композицию большей доли полиоксиалканоатов, значительно повысить биологическую инертность и, как следствие, проходимость будущего сосудистого графта.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шишацкая Е. И. Клеточные матриксы из резорби-руемых полигидроксиалканоатов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. Т. II, № 2. С. 68-72.
2. Characterization of nonexpanded mesenchymal progenitor cells from normal adult human bone marrow / N. Boiret [et al ] // Exp. Hematol. 2005. Vol. 33. P. 219-225.
3. Devine S. M, Hoffman R. Role of mesenchymal stem
cells in hematopoietic stem cell transplantation // Curr. Opin. Hematol. 2000. Vol. 7. P 358-363.
4. Fabrication and characterization of six electrospun poly(alpha-hydroxy ester) based fibrous scaffolds for tissue engineering / W. J. Li [et al.] // Acta Biomaterialia. 2006. № 2. P. 377-385.
5. Factorial design optimization and in vivo feasibility of poly(e-caprolactone)-micro- and nanofiber-based small diameter vascular grafts / B. Nottelet [et al.] // J. of Biomedical Materials Research. 2008. Part A. P. 865-875.
6. In vitro and in vivo degradation of non-woven materials made of poly(e-caprolactone) nanofibers prepared by electrospinningunder different conditions / N. Bolgen [et al.] // J. Biomater. Scin. Polym. Ed. 2005. № 16. P. 1537-1555.
7. Shin'oka T., Imai Y., Ikada Y. Transplantation of a Tissue-Engineered Pulmonary Artery//N. Engl. J. Med. 2001. T. 344. P. 532-533.
8. Siegel G., Shaffer R., Dazzi F. The immunosupressive properties of mesenchymal stem cells // Transplantation. 2009. Vol. 87, № 9. P. 45-49.
9. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis / F. Dazzi [et al.] //Blood Rev. 2006. Vol. 20. P. 161-171.
10. The T-box transcription factor Brachury mediates cartilage development in mesenchymal stem cell line C3H10T1/2 / A. Hoffman [et al.] // J. Cell. Sci. 2002. Vol. 115. P. 769-781.
11. Webb A. R., Yang J., Ameer G. A. Biodegradable polyester elastomers in tissue engineering 11 Expert Opin. Biol. Ther. 2004. Vol. 4(6). P. 801-812.
