CC BY
53
© В. В. ДЕМКИН, Н. В. КИРИЛЛОВА, 2012 УДК 578.873.21:578.5
В. В. Демкин, Н. В. Кириллова СпЕЦИфИчНЫЕ МОТИВЫ В ГЕНОМАх СЕМЕЙСТВА CHLAMYDIACEAE
ФГБУН Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва, Россия; ООО "НаноДиагностика", Москва,
Россия
Поиск генетических областей, которые могут служить надежными и удобными маркерами при идентификации и типировании бактерий, остается актуальной задачей современной молекулярной биологии. Прогресс в секвенировании привел к стремительному росту базы данных полногеномных нуклеотидных последовательностей бактерий, поэтому появилась возможность поиска и выбора генетических мишеней для систем идентификации или генотипирования среди полного набора бактериальных генов на основе прямого сравнительного анализа полногеномных последовательностей. В настоящей работе проведен сравнительный анализ геномов представителей разных видов семейства Chlamydiaceae с целью выявления специфичных ну-клеотидных мотивов, способных служить генетическими маркерами этого семейства. Поиск консенсусных участков выполняли с помощью макросов, написанных на языке Visual Basic for Application в среде MS Excel. Критерием выбора консенсусных последовательностей являлось полное совпадение в сравниваемых геномах участков протяженностью от 25 нуклеотидов. В исследование было взято по одной полногеномной последовательности от каждого представителя 8 видов Chlamydiaceae. В выборку не вошел полногеномный сиквенс C. suis ввиду его отсутствия в базе GenBank на момент исследования. Сравнение генома C. trachomatis с представителями других видов семейства Chlamydiaceae позволило выявить 41 общий мотив для всех восьми включенных в исследование видов хламидий. Наибольшее количество консенсусных мотивов было обнаружено в генах рибосомальных РНК, а также тРНК. Помимо генов рРНК и тРНК, консенсусные мотивы были выявлены в 5 генах и 6 межгенных участках. Выявленные в настоящем исследовании кон-сенсусные мотивы в генах CTL0299, CTL0800, dagA, hctA могут рассматриваться как кандидатные области для идентификации видов семейства Chlamydiaceae.
Ключевые слова: хламидии, Chlamydiaceae, консервативные последовательности, консенсусные мотивы, сравнительная геномика
Микроорганизмы, принадлежащие семейству Chlamydiaceae, являются облигатными внутриклеточными бактериями, способными вызывать разнообразные заболевания у человека и животных. В семействе Chlamydiaceae выделяют 9 видов, но биоразнообразие хламидий и среда их обитания могут быть значительно шире, чем это представлялось до недавнего времени [2, 7]. В настоящее время идентификация видов хламидий основана прежде всего на филогенетическом анализе последовательностей генов 16S и 23S рРНК [4]. Однако высокая консервативность генов рибосомальных РНК затрудняет как четкую дифференциацию хламидий от других бактерий, так и дифференциацию между видами в пределах семейства. Другие генетические мишени, которые были предложены для идентификации и типирования хламидий, ограничиваются очень небольшим количеством генов, большинство из которых являются генами белков наружной мембраны [3, 5, 6, 8, 9]. Поэтому поиск новых генетических областей, которые могут служить надежными маркерами при идентификации видов хламидий, остается актуальной задачей.
Выбор генетической мишени для задач детекции и генотипирования бактерий до недавнего времени был ограничен репертуаром секвенированных генов, депонированных в GenBank. Прогресс в секвениро-
вании привел к стремительному росту базы данных полногеномных сиквенсов бактерий, поэтому появилась возможность поиска и выбора мишеней среди полного набора бактериальных генов на основе прямого сравнительного анализа полногеномных последовательностей.
Сегодня определены полногеномные последовательности у 8 из 9 известных видов семейства Chlamydiaceae (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ lproks.cgi). В настоящей работе мы использовали разработанную нами программу, которая позволяет искать консенсусные участки (мотивы) в заданном наборе нуклеотидных последовательностей, и применили ее для анализа геномов видов семейства Chlamydiaceae с целью выявления специфичных ну-клеотидных мотивов, способных служить генетическими маркерами семейства Chlamydiaceae.
Материалы и методы
Поиск консенсусных участков выполняли с помощью макросов, написанных на языке Visual Basic for Application в среде MS Excel. Консенсусные последовательности определялись как полностью совпадающие в сравниваемых геномах участки протяженностью от 25 нуклеотидов. Допускалась замена одного основания, если она не приходилась на первые 25 оснований. Основной макрос осуществлял попарное сравнение полногеномных последовательностей, выбранных из заданного списка, при этом одна из последовательностей определялась как рефе-ренс, а другие - как последовательности сравнения. Поиск проводился как в прямой, так и в комплементарной последовательности. Алгоритм использовал минимальный отрезок (рамку) протяженностью 25 нуклеотидов для сканирования референс-последовательности на все возможные мотивы с их последующим поиском в последовательностях сравнения. При обнаружении соответствия размеры рамки расширялись на одно основание и сравнение повторялось. Расширение и сравнение мотивов повторялось до тех пор, пока соответствие сохранялось. Алгоритм допускал наличие одного несовпадения в расширяемой части мотива. Обнаруженные консенсусные мотивы помещались в таблицу Excel вместе с данными об их локализации и длине. Дополнительные макросы использовали для идентификации генетических областей, в которых были обнаружены мотивы, и идентификации гомологичных мотивов, обнаруженных в разных последовательностях сравнения. Платформа Excel обеспечивала фильтрацию и сортировку полученных данных, что значительно облегчало их финальную обработку.
В качестве референс-последовательности использовали последовательность Chlamydia trachomatis NC_010287.1. В качестве последовательностей сравнения использовали последовательности C. muridarum NC_002620.2, C. abortus NC_004552.2, C. ca-viae NC_003361.3, C. felis NC_007899.1, C. pecorum NC_015408.1, С. pneumoniae NC_005043.1 и С. psittaci CP002549.1. Нотация генов приведена по последовательности Chlamydia trachomatis NC_010287.1.
Сравнение найденных мотивов со всеми последовательностями, хранящимися в базе GenBank, проводили с помощью сетевого сервиса BLAST [http://www.ncbi.nml.nih.gov/blast/] с последующей обработкой с использованием инструментов Excel, как описано ранее [1].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Результаты и обсуждение
В исследование было взято по одной полногеномной последовательности от каждого представителя восьми видов Chlamydiaceae. В выборку не вошел полногеномный сиквенс C. suis ввиду его отсутствия в базе GenBank на момент исследования. Сравнение генома C. trachomatis с представителями других видов семейства Chlamydiaceae (за исключением вида C. suis) позволило выявить в общей сложности 2891 парный (т. е. между C. trachomatis и одним из исследованных видов Chlamydiaceae) консенсусный мотив протяженностью от 25 (минимальный размер, установленный условиями поиска) до 574 оснований. Для трех видов и более было выявлено 305 консенсусных последовательностей, из них только 41 мотив был общим для всех восьми включенных в исследование видов хла-мидий. Общие для восьми видов хламидий последовательности далее будем называть октаконсенсусными, так как отсутствие данных по C. suis не позволяет пока заявить их как семействоспецифичные. Как и ожидалось, наибольшее количество октаконсенсусных мотивов было обнаружено в генах рибосомальных РНК, а также тРНК. На эти же гены приходились и наиболее протяженные октаконсенсусные мотивы. Самые большие октаконсенсусные мотивы были выявлены в гене 23S рРНК: их размер составлял 274 и 129 оснований. Поскольку задачей нашего исследования был поиск новых мишеней, внимание было обращено на другие генетические локусы. Помимо генов рРНК и тРНК, октаконсенсусные мотивы были выявлены в пяти генах и 6 межгенных участках (см. таблицу).
Следует заметить, что генетические локусы, содержащие октаконсенсусные мотивы, были распределены по геному C. trachomatis относительно равномерно.
Генетические локусы, в которых были выявлены консервативные октаконсенсусные мотивы
Генетический локус Продукт гена Длина консен-сусного участка (основания)
CTL0299 Предположительно шаперон системы секреции III типа 33
CTL0800 Гипотетический белок 25
dagA №(+)сцепленная D-аланин глицин пермеаза 40
hctA Гистон-Ш-подобный белок развития 30
tufA Фактор элонгации Tu 29
Межгенная область CTL0273_CTL0274 - 52
Межгенная область CTL0292 CTL0293 - 76
Межгенная область 37
CTL0655_CTL0656
Межгенная область 30
hctA_CTL0113
Межгенная область 27
rpsA_trxB
Межгенная область 33
rpsM_secY
Определенный интерес представляли консенсус-ные мотивы, которые встречались не у всех исследованных видов, а только у семи, т. е. за исключением одного из видов (гептаконсенсусные мотивы). Геп-таконсенсусные мотивы были выявлены в группах за исключением C. pneumoniae (в локусах Intergene region lplA_clpC | clpC, rplB, rpmA), за исключением C. pecorum (в генах CTL0321, omcB, rpsR, fusA, rplP | Intergene region rpsC) и один мотив в гене фоА - в группе за исключением C. caviae. Как видно, C. pecorum и C. pneumoniae наиболее часто оказываются среди видов, которые не имеют общих для семейства консенсусных участков в пределах определенных генетических элементов, что, видимо, отражает их особое эволюционное развитие.
Чтобы проверить сохранность консервативных свойств консенсусных участков у других имеющихся в базе данных штаммов хламидий, а также учесть наличие возможной гомологии с генетическим материалом других организмов, был проведен поиск гомологичных октаконсенсусным мотивам последовательностей по всей базе GenBank с использованием программы BLAST [http://blast.ncbi.nlm.nih.gov]. Результаты такого исследования показали, что консен-сусные мотивы сохраняют свою консервативность у всех штаммов хламидий, для которых известны соответствующие последовательности, однако кон-сенсусные мотивы в межгенных областях имели, как правило, значительный уровень гомологии и с другими, в том числе и филогенетически отдаленными, микроорганизмами, тогда как консенсусные мотивы, обнаруженные в кодирующих областях, демонстрировали достаточно высокую специфичность в отношении представителей семейства Chlamydiaceae. Исключением был консенсусный мотив в гене tufA, который имел определенный уровень гомологии с представителями родов Parachlamydia, Simkania, Waddlia), а также с некоторыми другими генетически отдаленными бактериями. Таким образом, выявленные в настоящем исследовании консенсусные мотивы в генах CTL0299, CTL0800, dagA, hctA могут рассматриваться как кандидатные маркерные области для идентификации видов семейства Chlamydiaceae. Интересно, что ни один из указанных генетических локусов, насколько нам известно, не использовался ранее в качестве мишени в системах идентификации или генотипирования хламидий методами амплификации или гибридизации нуклеиновых кислот.
Предложенный в настоящей работе подход может использоваться для поиска подходящих генетических мишеней в геномных последовательностях любых групп бактерий.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов Министерства образования и науки РФ №№ 2011-1.2-512-006-102 и 2011-1.2-512-022-032 и Российского фонда фундаментальных исследований № 11-04-01763-а.
Сведения об авторах:
Демкин Владимир Витальевич - канд. мед. наук, зав. лаб. молекулярной диагностики, ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН; зам. генерального директора ООО "НаноДиагностика", e-mail:[email protected];
Кириллова Наталья Владимировна - аспирант, ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН; e-mail:[email protected]
ЛИТЕРАТУРА
1. Демкин В. В. // Молекул. генетика. - 2010. - № 3. - С. 40-41.
2. CorsaroD., ValassinaM., VendittiD. // Crit. Rev. Microbiol. - 2003. - Vol. 29. - P. 37-78.
3. Demkin V. V., Zimin A. L. // Arch. Microbiol. - 2005. - Vol. 183, N 3. - P. 169-175.
4. Everett K., Bush R., Andersen A. // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1999. -Vol. 49. - P. 415-440.
5. Hartley J. C., Kaye S., Stevenson S. et al. // J. Clin. Microbiol. -2001. - Vol. 39. - P. 3072-3079.
6. Herrmann B., Peterson B., Everett K. D. et al. // J. Syst. Evol. Microbiol. - 2000. - Vol. 50, N 1. - P. 149-158.
7. HornM. // Ann. Rev. Microbiol. - 2008. - Vol. 62. - P. 113-131.
8. Laroucau K., Souriau A., Rodolakis A. // Vet. Microbiol. - 2001. -Vol. 82, N 2. - P. 155-164.
9. Pedersen L. N., Herrmann B., Moller J. K. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2009. - Vol. 55. - P. 120-130.
Поступила 27.03.12
SPECIFIC MOTIFS IN THE GENOMES OF THE FAMILY CHLAMYDIACEAE
V. V. Demkin and N. V. Kirillova
Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
Specific motifs in the genomes of the family Chlamydiaceae were discussed. The search for genetic markers of bacteria identification and typing is an urgent problem. The progress in sequencing technology resulted in compilation of the database of genomic nucleotide sequences of bacteria. This raised the problem of the search and selection of genetic targets for identification and typing in bacterial genes based on comparative analysis of complete genomic sequences. The goal of this work was to implement comparative genetic analysis of different species of the family Chlamydiaceae. This analysis was focused to detection of specific motifs capable of serving as genetic marker of this family. The consensus domains were detected using the Visual Basic for Application software for MS Excel. Complete coincidence of segments 25 nucleotide long was used as the test for consensus domain selection. One complete genomic sequence for each of 8 bacterial species was taken for the experiment. The experimental sample did not contain complete sequence of C. suis, because at the moment of this research this species was absence in the database GenBank. Comparative assay of the sequences of the C. trachomatis and other representatives of the family Chlamydiaceae revealed 41 common motifs for 8 Chlamydiaceae species tested in this work. The maximal number of consensus motifs was observed in genes of ribosomal RNA and t-RNA. In addition to genes of r-RNA and t-RNA consensus motifs were observed in 5 genes and 6 intergene segments. The gene CTL0299, CTL0800, dagA, and hctA consensus motifs detected in this work can be regarded as identification domains of the family Chlamydiaceae.
Keywords: chlamydia, Chlamydiaceae, conservative sequences, consensus motifs, comparative genomic
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 578.833.41:578.5].083.3:615:371
Г. В. Дмитриев, Т. К. Борисова, Е. Б. Файзулоев, Ю. И. Забияка, Р. Г. Десятскова, В. В. Зверев
изучение молекулярных механизмов аттенуации вируса краснухи НА примере отечественного штамма 077
Лаборатория экспериментальной иммунологии отдела вирусологии им. О. Г. Анджапаридзе НИИВС им. И. И. Мечникова
РАМН, Москва
Для иммунизации населения против краснухи используют живую аттенуированную вакцину. Для большинства вакцинных штаммов вируса краснухи характерно наличие термочувствительного фенотипа. Приобретение термочувствительного фенотипа во время холодовой адаптации всегда сопровождается аттенуацией дикого вируса. Тем не менее молекулярные механизмы аттенуации вируса краснухи изучены не полностью. Поэтому по-прежнему актуальны изучение механизмов ослабления диких вариантов вируса, поиск ключевых мутаций, ведущих к аттенуации, а также выявление характерных фенотипических проявлений, которые могут служить маркерами аттенуации и использоваться наряду с секвенированием для контроля генетической стабильности вакцинных штаммов. В данном исследовании проведено полное секвенирование генома дикого и холодоадаптированного (са) вариантов штамма С-77 вируса краснухи, выделенного в России, и выявлены вероятные генетические детерминанты аттенуации. В результате сравнения геномов вариантов и са штамма С-77 обнаружено 13 нуклеотидных отличий, 6 из которых приводили к заменам аминокислот. 4 отличия из 6, ведущих к таким заменам, практически не встречаются у диких штаммов вируса краснухи. Особого внимания заслуживает замена Туг на Cys в позиции 1042 в протеазном домене штамма С-77, по всей вероятности, играющая ключевую роль в приобретении холодоадаптированного фенотипа штамма С-77.
Ключевые слова: вирус краснухи, аттенуированные штаммы, детерминанты аттенуации, температурная чувствительность
Краснуха - острое вирусное заболевание, характеризующееся пятнисто-папулезными высыпаниями на коже, слабовыраженными катаральными явлениями со стороны дыхательных путей и увеличенными пе-
риферическими лимфатическими узлами, особенно затылочными. Заболевание широко распространено как у детей, так и у взрослых. Актуальность и социальная значимость этой проблемы определяются серьезными тератогенными последствиями краснухи у женщин во время I триместра беременности. По данным разных авторов, риск развития врожденных пороков органов зрения, слуха, сердечно-сосудистой системы и др. составляет 10% от общего количества врожденных аномалий [2].
Заболевание у взрослых людей характеризуется более тяжелым течением, чем у детей, и нередко протекает с длительной лихорадкой, суставным синдромом, а также развитием органной патологии. Среди возможных осложнений встречаются краснушные энцефалиты, серозный менингит, полиневриты, тром-боцитопении и др.
Несмотря на все более широкое применение вакцины против краснухи, среди женщин детородного возраста сохраняется значительная неиммунная прослойка, что и создает угрозу развития синдрома врожденной краснухи.
Вакцинация является наиболее экономичным и доступным средством борьбы с краснухой. В настоящее время в Российской Федерации для иммунизации населения против краснухи используют вакцину зарубежного производства, созданную на основе штамма
