CC BY
48
УДК 573.088.1
СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ БИОРЕКТОРЫ - НОВОЕ ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА МЯСНОГО БЕЛКА
В.Ю. Сидорова, доктор сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник Е.Б. Петров, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. отделом
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт механизации животноводства E-mail: vniimzh@mail.ru
Аннотация. Культивирование стволовых клеток животных успешно осуществляется посредством применения различных технологических решений, одно из которых - кассетные культуральныеустройства. Технология получения искусственного мяса использует для своего осуществления параметры живого организма: температура 37 °С, рН=7,0 (нейтральная), содержание углекислого газа СО2 - 5%. Это абсолютно простые биохимические режимы, протекающие в неагрессивных средах при практически комнатной температуре, что способствует удешевлению стоимости полученного урожая. Процесс выращивания стволовых клеток является периодическим, объемно-доливочным. По существу он разделяется на два процесса - смешивание питательной среды для культивирования и выращивание в ней биомассы клеток. Исследования показали, что выращивание биомассы возможно без перемешивания, в культуральной среде до ее питательного истощения. Преимущества выращивания стволовых клеток «in vitro» с помощью кассетных технологий заключаются в том, что, в отличие от системы выращивания в культураль-ном сосуде, они позволяют увеличить объем культивирования в п раз, где п - число кассет; сохранить большую часть урожая при неудачном заселении клеток; рассчитать необходимые объемы выращивания; изолировать от контаминации и любого другого вредного воздействия; использовать одновременно способ выращивания как на микроносителях, так и на матрасах. Приведена классификация устройств для других технологий культивирования.
Ключевые слова: стволовые клетки животных, неагрессивная среда, биомасса, устройства для культивирования.
Введение. Биотехнологические направления занимают все более устойчивое и весомое место среди других современных технологий. Их использование уже не заканчивается применением в медицине, ветеринарии, биохимии и фармакологии, но охватывает новые проблемы, зачастую специфически отличающиеся от вышеназванных, которые в настоящее время могут рассматриваться уже как классические, исследованные в 70-80-х годах прошлого века различными авторами [1,3,4,20-22]. Одним из новых биотехнологических направлений является, в частности, получение мясного белка высокого качества для пищевых целей при выращивании стволовых клеток животных по технологии «in vitro» [5-10,14-16].
Широкое развитие и углубление специализации выращивания клеток и тканей животных возможно только в искусственной
среде, для создания которой необходимы специализированное оборудование и технологии, позволяющие такое оборудование успешно применять для получения промышленного количества биотехнологической продукции высокого качества в заранее определенные сроки. То есть должна быть твердая уверенность в получении необходимого объема результатов культивирования к заданному числу.
При культивировании стволовых клеток животных для выращивания пищевого мясного белка перед учеными и исследователями стоит задача не только получить необходимые объемы урожая клеточных культур, но и снизить их стоимость до уровня, приемлемого для широкого потребления.
До настоящего времени культивирование клеток и тканей животных, в том числе для пищевых целей, осуществлялось в основном
в СО2-инкубаторах на различных модификациях чашек Петри. Выращивание биомассы в биореакторах имеет преимущества перед таким культивированием, так как процесс может регулироваться, программироваться и визуально наблюдаться. Особенностью биореактора является именно то, что там возможно создание условий постоянного или регулярного культивирования на различных стадиях роста и дифференцировки, и контроля выращивания клеток на различных носителях [2,11,12,18].
Следует напомнить, что впервые искусственное мясо из стволовых клеток для первой котлеты М. Пост (2013 г.) вырастил именно в СО2-инкубаторе, следовательно, такая технология развития биомассы считается уже опробованной на практике. Технология получения искусственного мяса использует для своего осуществления параметры живого организма: температура 37°С, рН=7,0 (нейтральная), содержание углекислого газа СО2 - 5%. Это простые биохимические режимы, протекающие в неагрессивных средах при комнатной температуре, что дает возможность удешевления урожая стволовых клеток за счет применения для изготовления культуральных устройств стандартных технических материалов. Требуемые режимы культивирования можно создать и в СО2-инкубаторе, и в биореакторе.
Материалы и методы исследований. Материалом исследований являлось изучение особенностей культивирования мульти-потентных мезенхимных стволовых клеток крупного рогатого скота ММСК КРС по технологии «in vitro» в биотехнологических устройствах для получения искусственного мяса. Среди методов исследования преобладали анализ литературных данных, перспективное планирование научного эксперимента, структурное моделирование, а также теоретические и экспериментальные методы по выращиванию клеточной массы in vitro с заданными параметрами культивирования и использованием математических методов планирования эксперимента, анализа и обработки экспериментальных и литературных данных, рекомендованные Волковой И.М.,
Роговым И.А., Самуйленко В.И., Савченко-вой И. П., Тепляшиным А.С. и др.
Результаты исследований. Все из перечисленных биореакторов по способу культивирования могут быть открытыми или закрытыми. В закрытых биореакторах осуществляют периодическое культивирование, которое еще называют накопительным культивированием. Система считается закрытой в том случае, если после начала культивирования ни один из компонентов, участвующих в процессе, не вводится и не выводится из биореактора. В процессе роста все параметры непрерывно изменяются, и после накопления конечного продукта реактор разгружается, собирается полученная продукция, и культивирование повторяется. Непрерывное культивирование не может производиться в течение длительного времени, так как достаточно быстро происходит истощение среды. В открытые системы постоянно и равномерно вводят компоненты питательной среды или используемой культуры так, чтобы их концентрация оставалась постоянной, при этом постоянным сохраняется и объем питательной среды. Такие типы реакторов могут работать по принципу хемостата или турбо-дистата. В хемостатах поддерживается постоянная концентрация компонентов среды (рН-статы, оксистаты и т.д.), постоянный подвод клеток не обязателен; регулируя концентрацию субстрата, можно поддерживать концентрацию биомассы на необходимом уровне, что удобно для культивирования стволовых клеток. В турбодистатах поддерживают постоянную концентрацию клеток, регулируя скорость протока среды. При достижении определенной максимальной концентрации клеток подача среды может быть автоматически прекращена, и процесс протекает некоторое время в периодических условиях.
Процесс выращивания стволовых клеток является периодическим, объемно-доливоч-ным. По существу, он разделяется на два процесса - смешивание питательной среды для культивирования и выращивание в ней биомассы клеток. Исследования показали, что выращивание биомассы возможно без
перемешивания, в культуральной среде до ее питательного истощения. Такое культивирование биомассы успешно осуществляется посредством применения различных технологических решений, одно из которых - кассетные (секционные) культуральные устройства (рис. 1).
Рис. 1. Принцип организации секционного биореактора
Периодическое перемешивание при культивировании способствует увеличению продолжительности культивирования, что необходимо для формирования структуры волокна из стволовых клеток ММСК КРС. Важным вопросом при культивировании «in vitro», в том числе с привлечением секционных технологий для кассетного биореактора, является ориентация положения секций (кассет), которая бывает продольной или поперечной. Преимущества выращивания стволовых клеток «in vitro» с помощью кассетных технологий заключаются в том, что в отличие от системы выращивания в культу-ральном сосуде они позволяют увеличить объем культивирования в п раз, где п - число кассет; сохранить большую часть урожая при неудачном заселении клеток; рассчитать и сформировать различные объемы выращивания; изолировать от контаминации и любого другого вредного воздействия; использовать одновременно способ выращивания как на микроносителях, так и на матрасах. Ориентация кассет зависит от материала изготовления носителей и вязкости культу-ральной среды, которая может быть сывороточной и бессывороточной. Наиболее желательный вариант культивирования - их рав-
номерное распределение по объему без соприкосновения, так как любое соприкосновение травмирует чувствительные мембраны животной клетки (рис. 2). Особенность эффективного культивирования стволовых клеток для пищевых целей - в его зависимости от материала носителей (матрикса), который должен быть не только эластичным, пористым, слабо деградируемым, но и пригодным для пищи. Известно, что клетки в питательной среде при доступе атмосферного кислорода и подаче углекислого газа СО2 нормально адгезируют, растут и пролифери-руют без перемешивания. Перемешивание необходимо для смешивания питательной среды в лабораторных условиях, что значительно удешевляет процесс культивирования с использованием готовых сред.
Для перемешивания применяются различные виды мешалок, причем не все из них удовлетворяют условиям культивирования. Мешалка должна не задевать клетки при перемешивании, не создавать условия для образования застойных зон и зон с различными температурными значениями, так это плохо отражается на развитии и жизнедеятельности стволовых клеток. Оболочка секции (кассеты), в отличие от других технологий культивирования, предохраняет стволовые клетки от негативного влияния перемешивания. Для возможно низкозатратного культивирования и энергопотребления важен выбор места расположения мешалки и ее тип. Наилучшим расположением механической мешалки является центральная часть устройства.
а Ь с
Рис. 2. Расположение носителей в сосуде биореактора: а - равномерное расположение в
горизонтально-ориентированном объеме; Ь - перемещенное к поверхности расположение в вертикально-ориентированном объеме; с - перемещенное ко дну расположение в горизонтально-ориентированном объеме
Это подтверждают многочисленные расчеты и экспериментальные запуски культу-ральных устройств многих авторов, среди которых Л.Н.Брагинский, В.М.Барабаш и др. [2,4,13,17]. Различные варианты культивирования можно моделировать. За основу моделирования взяты культуральные устройства, поддерживающие различные технологии выращивания биомассы (табл. 1.). В соответствии с ожидаемыми результатами выращивания биомассы можно выбрать механические, эрлифтные, барботажные или газовихревые устройства, полного перемешивания или полного вытеснения, однокамерные или многокамерные и т.д. Для выращивания биомассы стволовых клеток для пищевых целей можно выбрать одноразовое двухкамерное культуральное устройство, без перешивания, объемно-доливочное по способу массопере-носа, по способу культивирования - открытые хемостаты с комбинированным подводом энергии к газовой или жидкой фазе.
Физический механизм перемешивания жидких сред, методика инженерного расчета гидродинамики перемешивания, тепло- и массообмена, турбулентной диффузии и дру-
гие параметры показали, что перенесение различных видов перемешивающих устройств в угловые или диагональные направления способствует образованию более глубоких воронок, определяющих образование турбулентных и тепловых зон, способствует повышенному пенообразованию. Центральное положение механической мешалки, как и выбор конструкции перемешивающего устройства, в конечном варианте определяют согласно расчетам по методике с учетом мощности, затрачиваемой на перемешивание при турбулентном и ламинарном режимах [19].
Основой для практического вывода можно считать методику расчета конструктивных параметров механических перемешивающих устройств, использующую теорию перемешивания в жидких средах. Математический расчет помогает определить расположение привода мешалки - верхний или нижний. Положение других мешалок - например, электропневматических или электромагнитных, возможно и в других точках устройства, однако их применение там оказалось экономически нецелесообразно и негативно повлияло на стоимость урожая.
Таблица 1. Классификация культуральных устройств для выращивания биомассы
Основные конструктивные типы биореакторов для культивирования клеточных культур По способу использования Одноразовые Х
Многоразовые
По количеству культуральных сосудов Однокамерные
Многокамерные
По способу перемешивания Без перемешивания Х
С перемешиванием Эрлифтные С внутренней циркуляцией
С внешней циркуляцией
Барботажные
Газо-вихревые
Механические Пневматические
Циркулярные Х
По способу массо- и энергообмена клеток со средой Глубинные Полного перемешивания Непрерывные
Полунепрерывные или объемно -до ливочные Х
Периодические
Многоциклические
Полного вытеснения Турбулярные
Поверхностные
По способу культивирования Закрытые (накопительное культивирование)
Открытые Турбодистаты
Хемостаты Х
По способу подвода энергии К газовой фазе
К жидкой фазе
Комбинированные Х
Примерная стоимость урожая стволовых клеток (200 г) была рассчитана, на основе полученных в ходе одного цикла культивирования в однокамерном биореакторе данных. Себестоимость 1 кг (1000 г) культу-рального мяса слагается из следующих величин: 7280:200-1000=36400 руб., где 7280 руб. - это стоимость питательной среды ДМЕМ (200 г), клеточных линий, матрикса желатинового.
На основе примерной стоимости урожая была определена окупаемость экспериментального образца биореактора, которая при производстве 200 г белка в течение 1 месяца оказалась равна: 42050 (стоимость биореактора): 36400 (стоимость месячного цикла выращивания): 12 = 0,1 год без учета заработной платы лаборанта по культивированию.
Выводы. Проведенные исследования показали, что основными особенностями культивирования мультипотентных мезенхимных клеток животных с привлечением различных технологий, среди которых метод секционного культивирования, являются:
- возможность структурного моделирования устройств;
- увеличение объема культивирования кассетным методом по сравнению с культивированием в общем объеме сосуда в п раз, где п - число кассет;
- использование технологий микроносителей и матрасов одновременно;
- более низкая травмируемость клеток в результате разреженности твердой фазы культуральной среды.
Литература:
1. Применение аппаратов с перемешивающими устройствами для перемешивания высококонцентрированных суспензий / В.М. Барабаш и др. // Теоретические основы химической технологии. 1990. Т. 24, №1. С. 63-68.
2. Гунин М.А., Рубан Е.А., Соловьев Б.В. Гипотетическая теория гибели клеток в биореакторе // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. Щелково, 2000. С. 299-300.
3. Вихревой биореактор «Биок» / Кислых В.И. и др. // Биотехнология. 2000. №4. С. 72-79.
4. Петров Е.Б. Разработка биореактора для производства культурального мяса, выращивания клеток нервной ткани и других клеток // Перспективы использования достижений наук о сознании и ВНД в меди-
цине, ветеринарии и для создания сельхозмашин нового поколения. М., 2015.
5. Перспективы использования стволовых клеток с.-х. животных в АПК / Рогов И.А. и др. // Биотехнология. Взгляд в будущее. Казань, 2014. Т. 2. С. 72-76.
6. Рубан Е.А. Биотехнология производства препаратов для защиты животных // Вестник РАСХН. 1999. №1.
7. Самуйленко А.Я. Перспективы научно-технического развития производства биологических препаратов // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биопрепаратов. М., 1991. С. 6-7.
8. Иванов Ю.А. Новые технологии в животноводстве // Техника и оборудование для села. 2010. № 1. С. 36.
9. Иванов Ю.А. Направления технической модернизации при производстве продукции животноводства // Вестник ВНИИМЖ. 2015. №1(17). С. 3-8.
10. Сидорова В.Ю. Использование различных видов матриксов для культивации стволовых клеток КРС как альтернативного источника получения пищевого белка // Сельское, лесное, рыбное хозяйство. Воронеж, 2015.
11. Сидорова В.Ю. Принципы взаимосвязи с.-х. механизации и биотехнологии, или от Техно- к Мини-Эко-, Био- и Нано- агронаправлениям // Вестник ВНИИМЖ. 2014. №4(16).
12. Сидорова В.Ю. Классификация устройств для культивации стволовых клеток с.-х. животных ММСК КРС // Новое слово в науке и практике. Новосибирск, 2015.
13. Культивирование клеток линии ПТ-80 в ферментере с автоматизированной системой управления технологическим процессом / Соловьев Б.В. и др. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. М., 1987.
14. Толоконников Г.К. Стволовые клетки, их диффе-ренцировка в нейроны и моделирование неокортекса // Перспективы использования достижений наук о сознании и высшей нервной деятельности в медицине, ветеринарии и для создания сельхозмашин нового поколения. М., 2015.
15. Frame K.K., Hu W.S. Composison of growth Kinetic of producing and nonproducing hybridoma cells in batch culture // Eny. Microb. Technoll. 1995. №13. Р. 690-696.
16. Frame K.K. Kinetic study of hybridoma cell growth in continiaus culture // Biotechn. Bioeng. 1994. №38.
17. Golstein P., Ojcius D., Yong J. Cell death mechanisms in the immune system // Immunol. Rev. 1993. №121.
18. Henzler H., Kouling D. Oxygenation of cell cultures // Bioproc. Eng. 1993. №9.
19. Hiller G. A kinetic analysis of hybridoma growth and metabolism in suspension culture on serum free medium // Biotechnol. Bioeng. 1995. №23. Р. 167-182.
20. Lu G., Thompson B. Physical modeling of animal cell in suspension culture // Biotechn. Bioeng. 1996. №40.
21. MacLeod A. Develop // Biol.Standard. 1982. №50.
22. Papoustsaks E. Fluid mechanical damage of animal cells in bioreactors // Tib Tech. 1996. №9. Р. 427-373.
Literatura:
1. Primenenie apparatov s peremeshivayushchimi ustroj-stvami dlya peremeshivaniya vysokokoncentrirovannyh suspenzij / V.M. Barabash i dr. // Teoreticheskie osnovy himicheskoj tekhnologii. 1990. T. 24, №1. S. 63-68.
2. Gunin M.A., Ruban E.A., Solov'ev B.V. Gipotetiches-kaya teoriya gibeli kletok v bioreaktore // Nauchnye os-novy proizvodstva veterinarnyh biologicheskih prepara-tov. SHCHelkovo, 2000. S. 299-300.
3. Vihrevoj bioreaktor «Biok» / Kislyh V.I. i dr. // Biotek-hnologiya. 2000. №4. S. 72-79.
4. Petrov E.B. Razrabotka bioreaktora dlya proizvodstva kul'tural'nogo myasa, vyrashchivaniya kletok nervnoj tka-ni i drugih kletok // Perspektivy ispol'zovaniya dostizhenij nauk o soznanii i VND v medicine, veterinarii i dlya soz-daniya sel'hozmashin novogo pokoleniya. M., 2015.
5. Perspektivy ispol'zovaniya stvolovyh kletok sel's.-h. zhivotnyh v APK / Rogov I.A. i dr. // Biotekhnologiya. Vzglyad v budushchee. Kazan', 2014. T. 2. S. 72-76.
6. Ruban E.A. Biotekhnologiya proizvodstva preparatov dlya zashchity zhivotnyh // Vestnik RASKHN. 1999. №1.
7. Samujlenko A.YA. Perspektivy nauchno-tekhnichesko-go razvitiya proizvodstva biologicheskih preparatov // Nauchnye osnovy tekhnologii promyshlennogo proizvodstva veterinarnyh biopreparatov. M., 1991. S. 6-7.
8. Ivanov YU.A. Novye tekhnologii v zhivotnovodstve // Tekhnika i oborudovanie dlya sela. 2010. № 1. S. 36.
9. Ivanov YU.A. Napravleniya tekhnicheskoj moderniza-cii pri proizvodstve produkcii zhivotnovodstva // Vestnik VNIIMZH. 2015. №1(17). S. 3-8.
10. Sidorova V.YU. Ispol'zovanie razlichnyh vidov ma-triksov dlya kul'tivacii stvolovyh kletok KRS kak al'terna-tivnogo istochnika polucheniya pishchevogo belka // Sel'skoe, lesnoe, rybnoe hozyajstvo. Voronezh, 2015.
11. Sidorova V.YU. Principy vzaimosvyazi s.-h. mekhani-zacii i biotekhnologii, ili ot Tekhno- k Mini- Ehko-, Bio- i Nano- agronapravleniyam // Vestnik VNIIMZH. 2014. №4(16).
12. Sidorova V.YU. Klassifikaciya ustrojstv dlya kul'tivacii stvolovyh kletok s.-h. zhivotnyh MMSK KRS // No-voe slovo v nauke i prak-tike. Novosibirsk, 2015.
13. Kul'tivirovanie kletok linii PT-80 v fermentere s avto-matizirovannoj sistemoj upravleniya tekhnologicheskim processom / Solov'ev B.V. i dr. // Nauchnye osnovy tekh-nologii promyshlennogo proizvodstva veterinarnyh bio-logicheskih prepara-tov. M., 1987.
14. Tolokonnikov G.K. Stvolovye kletki, ih differencirov-ka v nejrony i modelirovanie neokorteksa // Perspektivy ispol'zovaniya dostizhenij nauk o soznanii i vysshej nervnoj deyatel'nosti v medicine, veterinarii i dlya soz-daniya sel'hozmashin novogo pokoleniya. M., 2015.
15. Frame K.K., Hu W.S. Composison of growth Kinetic of producing and nonproducing hybridoma cells in batch culture // Eny. Microb. Technoll. 1995. №13. R. 690-696.
16. Frame K.K. Kinetic study of hybridoma cell growth in continiaus culture // Biotechn. Bioeng. 1994. №38.
17. Golstein P., Ojcius D., Yong J. Cell death mechanisms in the immune system // Immunol. Rev. 1993. №121.
18. Henzler H., Kouling D. Oxygenation of cell cultures // Bioproc. Eng. 1993. №9.
19. Hiller G. A kinetic analysis of hybridoma growth and metabolism in suspension culture on serum free medium // Biotechnol. Bioeng. 1995. №23. R. 167-182.
20. Lu G., Thompson B. Physical modeling of animal cell in suspension culture // Biotechn. Bioeng. 1996. №40.
21. MacLeod A. Develop // Biol.Standard. 1982. №50.
22. Papoustsaks E. Fluid mechanical damage of animal cells in bioreactors // Tib Tech. 1996. №9. R. 427-373.
SPECIALIZED CULTURE BIOREACTORS ARE THE NEW EQUIPMENT FOR THE MEAT PROTEIN
PRODUCTION
V.Y. Sidorova, doctor of agricultural sciences, leading research worker E.B. Petrov, candidate of agricultural sciences, department head FGBNY All-Russian research Institute animal husbandry mechanization
Abstract. The animals stem cells cultivation is implemented successfully by applying of different technological solutions, one of which is cassette culture device. The artificial meat producing technology uses for its implementation the living organism parameters: 370C temperature, pH 7,0 (neutral), 5% CO2 (carbon dioxide). This is absolutely simple biochemical regimes occurring in non-aggressive media at virtually room temperature, contributing to the harvest cost cheapening. The stem cells growing process is periodic, space-filling. Basically it is divided into two processes - the nutrient medium mixing for the cultivation and cells biomass growing. Studies have shown that biomass cultivating is possible made without stirring, in a culture medium till nutrient exhaustion. The stem cells «in vitro» growing benefits by cassette technology is unlike one in a culture vessel growing, they allow to increase the cultivation in n- times, where n - is the number of cassettes; save most of the failed crop when the population of cells is poorly populated; calculate the required volumes of production, and to isolate from contamination and either other harmful effects; use together so a method of growing on the bead, as mattresses-growing one. Classification of devices for other technologies is done.
Keywords: animals stem cells, non-aggressive media, the biomass, the cultivation device.
