CC BY
2575
УДК 543:535.243
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
О. Н. Сорокина, Е. Г. Сумина*, А. В. Петракова*, С. В. Барышева*
Саратовский государственный аграрный университет E-mail: Sorokina-O-N@yandex.ru *Саратовский государственный университет E-mail: SuminaEG@yandex.ru **Энгельсский технологический институт (филиал)
Саратовского государственного технического университета
Спектрофотометрическим методом проведено определение суммарного содержания флавоноидов в лекарственных препаратах растительного происхождения. Выбраны оптимальные условия пробоподготовки и спектрофотометрирования.
Ключевые слова: спектрофотометрия, флавоноиды, рутин, кверцетин.
Spectrophotometric Analysis of the Total Contents of Flavonoids in Medical Phytopreparations
O. N. Sorokina, E. G. Sumina,
A. V. Petrakova, S. V. Barysheva
The total contents of flavonoids in medical phytopreparations were estimated spectrophotometrically. Optimal conditions of sampling and spectrophotometry were chosen.
Key words: spectrophotometry, flavonoids, rutin, quercetin.
Введение
Флавоноиды - полифенольные соединения, присутствующие в ряде растений. Их называют натуральными биологическими модификаторами реакции из-за способности изменять реакцию организма на аллергены, вирусы и канцерогены. Об этом говорят их противовоспалительные, антиаллергические, антивирусные и антиканцерогенные свойства. По антиоксидантной активности флавоноиды превосходят витамины С, Е и каротиноиды [1-3].
В растительных и фармацевтических объектах флавоноидные соединения в основном содержатся в виде смесей различных гликозидов, относящихся к разным классам полифенолов, что затрудняет выбор метода их определения и требует проведения системных исследований.
Анализ литературных данных показал, что с этой целью используют разнообразные хроматографические [4-8], электрохимические [8, 9], электрофоретические [4, 8] методы анализа. Наиболее простым и доступным является метод молекулярной абсорбционной спектроскопии в
УФ - и видимой областях спектра, позволяющий определять суммарное содержание флавоноидов в исследуемых объектах [8, 10-12].
В связи с этим настоящая работа посвящена разработке спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в некоторых лекарственных препаратах растительного происхождения.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования выбраны водно-спиртовые извлечения из следующих препаратов, содержащих флавоноиды: прополис - в виде водно-спиртовой настойки и сухого вещества, софора японская, шелуха лука. Пробопод-готовка объектов осуществлялась согласно [11].
В качестве стандартов выбраны кверцетин и рутин (ч.д.а.), наиболее часто встречающиеся в растительных объектах. Стандартные растворы исследуемых флавоноидов в 95%-м этиловом спирте с концентрацией 1 мг/мл готовили по точной навеске. Рабочие спиртовые растворы готовили разбавлением стандартных и хранили в холодильнике не более 7 дней.
Исследования проводили методом спектро-фотометрии на спектрофотометре «8Ышаё2и», Япония (кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 1 см) и на фотоколориметре КФК-2 МП (стеклянные кюветы с толщиной слоя 1 см).
Результаты и их обсуждение
С целью выбора аналитической длины волны предварительно были получены УФ-спектры спиртовых растворов исследуемых экстрактов, а также стандартных образцов рутина и кверцетина в индивидуальном состоянии и с добавлением хлорида алюминия, вступающего в реакции комплексообразования с исследуемыми соединениями [10]. Спектры поглощения представлены на рис. 1, 2.
© Сорокина О. Н., Сумина Е. Г., Петракова А. В., Барышева С. В., 2G13
Длина волны, нм
Рис. 1. УФ-спектры поглощения флавоноидов (раствор сравнения - дистиллированная вода): 1 - рутин, 2 - кверцетин; Ск=50 мкг/мл
Длина волны, им
Рис. 2. УФ-спектры поглощения комплексов флавоноидов с хлоридом алюминия (раствор сравнения - водно-спиртовой раствор хлорида алюминия): 1 - хлорид алюминия, 5%-ный; 2 - комплексы рутина с Al (III); 3 - комплексы кверцетина с Al (III); CR=25 мкг/мл
Анализ спектров показывает, что отсутствие поглощения AICI3 в области максимумов поглощения его комплексов с кверцетином и рутином позволяет использовать в качестве раствора сравнения дистиллированную воду.
Из представленных данных также видно, что взаимодействие кверцетина и рутина с ионами алюминия приводит к батохромному смещению на 66-67 нм максимумов поглощения исходных реагентов. Поскольку максимумы спектров поглощения кверцетина и рутина находятся в области 370 и 356 нм соответственно, а их комплексов с ионами алюминия при 437 и 422 нм - раздельное определение кверцетина и рутина невозможно. В связи с этим спектрофотометрический метод был использован для суммарного определения флаво-ноидов в пересчете на кверцетин или рутин. Вы-
бор стандартного вещества для количественного определения флавоноидов осуществляли с учетом близости спектров поглощения комплексов рутина и кверцетина с А1 (III) и спектров поглощения ком -плексов флавоноидов, извлеченных из объектов. Такой подход, на наш взгляд, позволяет снизить погрешность определения при пересчете.
Исходные водно-спиртовые извлечения из растительных объектов в отсутствие хлорида алюминия не поглощают в области 400-450 нм, следовательно, не вносят погрешность в определение (рис. 3).
£
с
у
<
Длина волны, нм
Рис. 3. УФ-спектры поглощения флавоноидов из растительного сырья (раствор сравнения - дистиллированная вода): 1 - нронолис, 2 - шелуха лука, 3 - софора японская
Анализ данных на рис. 4 показывает, что максимумы спектров поглощения комплексов флаво-ноидов с Al (III) из водно-спиртовых экстрактов находятся при 4l3,5 нм для софоры японской; при 4^,5 нм - для шелухи лука; при 43G нм - для прополиса. Следовательно, для нересчета содержания флавоноидов в первых двух объектах в качестве стандартного вещества использовали рутин, в последнем - кверцетин.
Длина волны, нм
Рис. 4. УФ-спектры поглощения флавоноидов с А1 (III) (раствор сравнения - дистиллированная вода): 1 - настойка прополиса, 2 - шелуха лука, 3 - софора японская, 4 - прополис (сухое вещество)
Химия
з
При выбранных оптимальных длинах волн для кверцетина (440 нм) и рутина (400 нм) были построены градуировочные графики, которые представлены на рис. 5, 6. Для рутина оптимальная длина волны 400 нм была выбрана вследствие того, что угол наклона градуировочного графика (характеризует чувствительность определения) при данной длине волны выше по сравнению с длиной волны, равной 440 нм.
л
с
у
<
Концентрация кверцетина, мкг/мл
Рис. 5. Градуировочный график на кверцетин. Л = 440 нм. Раствор сравнения: водно-спиртовой раствор хлорида алюминия
Концентрация рутина, мкг/мл
Рис. 6. Градуировочные графики на рутин: 1 - Л = 440 нм, 2 - Л = 400 нм. Раствор сравнения: водно-спиртовой раствор хлорида алюминия
Полученные зависимости линейны в интервале определяемых содержаний кверцетина 12,5-150 мкг/мл, рутина - 25-300 мкг/мл.
Контроль правильности проводили методом «введено-найдено» (табл. 1, 2). Значения Sr при определении кверцетина не превышают 0,017, рутина - 0,008; значения абсолютной погрешности измерения имеют как отрицательное, так и положительное отклонение от среднего значения, а значения относительной погрешности определения не превышают 4% для кверцетина и 2% - для рутина. Полученные результаты позволяют использовать данный метод для количественного определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на рутин или кверцетин.
Таблица 1
Результаты определения кверцетина методом «введено-найдено» (n = 3, р = 0.95, tpf = 4.13)
Введено кверцетина, мкг Найдено кверцетина, мкг Метрологические характеристики
Sr Дх Дх/х , %
30 29,2 і 0,9 0,012 +0,8 3
40 41,5 і 1,7 0,017 -1,5 4
б0 58,5 і 2,3 0,01б +1,5 4
90 89,3 і 0,б 0,002 +0,7 1
Таблица 2
Результаты определения рутина методом «введено-найдено» (n = 3, р = 0.95, tpf = 4.13)
Введено рутина, мкг Найдено рутина, мкг Метрологические характеристики
Sr Дх %
90 88,9 і 1,8 0,007 +1,1 2
120 122 і 2,9 0,008 -2 2
180 178,б і 2,2 0,004 +1,4 1
Количественное определение содержания суммы флавоноидов в исследуемом сырье проводили по одному из градуировочных графиков. Для контроля правильности использовали метод добавок. Результаты представлены в табл. 3 и 4.
Статистическая обработка результатов определения флавоноидов в растительных объектах (n = 3, р = 0.95, p = 4.13)
Таблица З
Анализируемый образец Найдено флавоноидов в пересчете на рутин, мкг/мл Лр і ^ Найдено флавоноидов в нересчете на кверцетин, мкг/мл Хср і ^ Sr Дх/х % ср Процентное содержание в сырье, %
Софора японская 12б,б і 5,9 - 0,01б 5 4
Шелуха лука 90,3 і 4,8 - 0,018 5 2,8
Прополис (сухое вещество) - 47,5 і 2,б 0,019 б 1,5
Прополис (настойка) - 31,4 і 0,4 0,003 1 0,8
1G
Научный отдел
Правильность результатов анализа. Проверка методом стандартной добавки
Таблица 4
Анализируемый объект Найдено флавоноидов в пробе в пересчете на рутин, мкг Добавка рутина, мкг Бг
Введено Найдено
Софора японская 158,3 ± 7,4 30 27,8 ± 2,9 0,036
Заключение
На основании полученных результатов разработана методика спектрофотометрического определения суммарного содержания флавоно-идов в пересчете их содержания на рутин или кверцетин. Установлено, что в софоре японской содержание суммы флавоноидов (в пересчете на рутин) составляет 126,6±5,9 мкг/мл, в шелухе лука - 90,3±4,8 мкг/мл, в прополисе (сухое вещество) - 47,5±2,6 мкг/мл (в пересчете на кверцетин), в прополисе (настойка) - 31,4±0,4. Правильность определения контролировали методом стандартной добавки. Относительное стандартное отклонение не превышает 0,04.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 12-03-00450а).
Список литературы
1. Запрометов М. Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 203 с.
2. Федосеева А. А., Лебедкова О. С., Каниболоц-кая Л. В. Антиоксидантная активность настоев чая // Химия растительного сырья. 2008. № 3. С. 123-127.
3. Коноплева М. М. Фармакогнозия : природные биологически активные вещества. Витебск, 2007. 273 с.
4. Карцова Л. А., Алексеева А. В. Хроматографические и электрофоретические методы определения поли-фенольных соединений // Журн. аналит. химии. 2008. Т. 63, № 11. С. 1126-1136.
5. Ванидзе М. Р., Каландия А. Г., Шалашвили А. Г. Флавоноидные соединения плодов фейхоа // Химия растительного сырья. 2009. № 3. С. 103-108.
6. Маркарян А. А., Абрамов А. А. Хроматографическое изучение фенольного состава сухого экстракта «Нефрофит» // Вестн. Моск. ун-та. Химия. 2003. Т. 44, № 5. С. 356-360.
7. Темердашев З. А., Фролова Н. А., Колычев И. А. Определение фенольных соединений в лекарственных растениях методом обращенно-фазовой ВЭЖХ // Журн. аналит. химии. 2011. Т. 66, № 4. С. 417-424.
8. Дмитриенко В. А., Кудринская В.А., Апяри В. В. Методы выделения, конденсирования и определения кверцетина // Журн. аналит. химии. 2012. Т. 67, № 4. С. 340-353.
9. Зиятдинова Г. К., Будников Г. К. Определение флавонолов в фармпрепаратах методом вольтам-перометрии // Хим.-фарм. журн. 2005. Т. 39, № 10. С. 54-56.
10. Бекетов Е. В., Абрамов А. А., Нестерова О. В. Идентификация и количественная оценка флавоноидов в плодах черемухи обыкновенной // Вестн. Моск. ун-та. Химия. 2005. Т. 46, № 4 С. 259-262.
11. Бубенчиков Р. А., Дроздова И. Л. Флавоноиды фиалки трехцветной // Фармацевтическая химия и фармакогнозия. 2004. № 2. С. 11-12.
12. Жукова О. Л., Абрамов А. А., Даргаева Т. Д. Изучение фенольного состава подземных органов сабельника болотного // Вестн. Моск. ун-та. Химия. 2006. Т. 47, № 5. С. 342-345.
Химия
11
