CC BY
39
По результатам проведенных исследований следует, что поведенческие показатели двигательной активности самок значительно превосходят таковые у самцов,
уровень исследовательской активности так же выше у самок, исходя из чего, можно заключить, что самки менее подвержены действию нового производного тетрагидро-хинолина по сравнению с крысами-самцами.
Ы
■ стресс-устойчивые ■ стресс-чувствительные
Рисунок 6 - Суммарная длительность реакций замирания, ## - достоверное отличие (р<0,05) от стресс-устойчивых самцов, !! - достоверное отличие (р<0,05) от стресс-устойчивых самцов
Список литературы
1. Епишина В. В. Сравнительное изучение психотропной активности гетероциклических производных гаммааминомаслянной и глутаминовой кислот: автореф... канд. мед. наук / ВолгГМУ. - Волгоград, 2006. - 31 с.
2. Платонова А. Ю. Дизайн новых биологически активных препаратов на основе тетрагидрохино-линов: этап 4 [Электронный ресурс] // 2012. URL: http://elar.urfu.ru/bitstream/10995/21949/1/Platomva _A..pdf (дата обращения: 11.04.2015).
3. Моржерин Ю. Ю., Платонова А. Ю. Синтез конденсированных гетероциклических систем на основе хиназолинов и тетрагидрохинолинов: заключительный отчет о НИР / Урал. федер. ун-т им. первого
Президента России Б. Н. Ельцина. - Екатеринбург, 2013. - 18 с.
4. Малкова Т. Л., Котегов В. П., Мащенко П. С., Булатов И. П., Андреев А. И. Методические рекомендации по процедуре отнесения психоактивных веществ к аналогам наркотических средств и психотропных веществ. - Пермь: Изд-во ПГФА, 2012. - 45 с.
5. Пермяков А. А., Елисеева Е. В., Юдицкий А. Д., Исакова Л. С. Поведенческие реакции у экспериментальных животных с различной прогностической устойчивостью к стрессу в тесте «открытое поле // Вестник Удмуртского университета. - 2013. - № 63. - С. 83-90.
6. Коплик Е. В. Метод определения критерия устойчивости крыс к эмоциональному стрессу // Вестн. новых медицинских технологий. - 2002. - Т. 9, № 1. - С. 16-18.
СОЗДАНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО БИНАРНОГО ВЕКТОРА ДЛЯ АГРОБАКТЕРИ-АЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ РЕМОНТАНТНОЙ МАЛИНЫ
Мытницкая Юлия Федоровна
Апирантка 3 года обучения Брянского государственного университета им. Акад. И. Г. Петровского;
Заякин Владимир Васильевич, Нам Ирина Ян-Гуковна
Доктора биол. наук, профессоры кафедры биологии Брянского государственного университета им. Акад.
И. Г. Петровского;
АННОТАЦИЯ
Одним из наиболее эффективных способов борьбы с вирусными инфекциями малины является получение устойчивых трансгенных растений методом агробактериальной трансформации. Для этого целевые нуклеотидные последовательности вводят в клетки A. tumefaciens с помощью бинарных векторов, способных экспрессироваться в прока-риотических и эукариотических клетках. Такой бинарный вектор был получен на основе плазмиды pBin19.
Ключевые слова: трансгенные растения, агробактериальная трансформация, бинарный вектор, генетические конструкции, промотор
ABCTRACT
Creation of the resistant transgenic plants of raspberry by Agrobacterium-mediated transformation is one of the most effective ways to control of viral infections. For this specific sequences introduced into the cells of A. tumefaciens by binary vectors. These vectors capable of being expressed in prokaryotic and eukaryotic cells. Such binary vector was derived from the plasmid pBin19.
Keywords: transgenic plants, Agrobacterium-mediated transformation, binary vector, genetic constructs, promoter
Бактерия Agrobacterium tumefaciens находит широкое применение в генной инженерии растений благодаря способности переносить свою ДНК в клетки пораженных растений, встраивать ее в геном растения-хозяина, индуцируя стабильную трансформацию клеток собственными генами [1, с. 208-211]. Вирулентные штаммы агробакте-рий несут Ti-плазмиды, размер которых превышает 200 т.п.о. [2, с. 109-127]. При заражении данным патогеном область Ti-плазмиды длиной 12-25 т.п.н. (Т-ДНК) случайным образом интегрируется в геном пораженного растения, а встроенные гены начинают экспрессироваться. Т-область содержит шесть генов, кодирующих ферментные системы биосинтеза фитогормонов ауксина и цитокинина, их экспрессия приводит к пролиферации клеток и росту опухолевых образований (корончатых галлов) [3, с. 154].
Однако трансформация клеток непосредственно с помощью Ti-плазмиды приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Поэтому для введения генов используют векторные молекулы на основе Ti-плазмиды с удаленными онкогенами. Вместо онкогенов в вектор по сайтам рестрикции клонируют последовательности целевых генов [4, с. 5965; 5, с. 289-296]. Так, бинарные векторы используют для переноса генетических конструкций, содержащих целевые гены в клетки растений, поскольку в их состав входят соответствующие регуляторные элементы, позволяющие
fco Ш Крп ! $tr,3 \ Sa¡г, HS Xbs I Sa! 1 НШ1П
^^ iiSiliStfJWiXQpl
LB
проводить клонирование в E. coli и трансформировать растения с помощью A. tumefaciens. Так, бинарный вектор pBin19 содержит Т-область, фланкированную левой и правой границей (LB и RB), которая в процессе трансформации переносится в геном растения. В Т-ДНК данного вектора расположен также селективный ген npt II, кодирующий последовательность неомицинфосфотранс-феразы II и придающий трансформированным клеткам устойчивость к антибиотику канамицину. Npt II находится под контролем промотора и терминатора гена нопалин-синтазы (nos), позволяющих экспрессировать данный ген в эукариотических клетках. Для клонирования целевых генов в векторе pBin19 имеется полилинкер, расположенный внутри гена lacZ. Но около полилинкера отсутствует промотор эукариотического типа, поэтому данный вектор не является экспрессирующим для растений. Чтобы клонированные в данном векторе гены могли экспрессиро-ваться, требуется ввести дополнительный промотор, способный функционировать в составе растительного генома.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для создания модифицированного экспрессирую-щего вектора использовалась плазмидная ДНК pBin19. Данная плазмида содержит ген npt II, придающий устойчивость к канамицину и находящийся под контролем промотора гена нопалинсинтазы (Pnos), а также полилинкер с множественными сайтами клонирования (рис 1).
Рисунок 1. Структура бинарного вектора pBin19. LB, RB - левая и правая границы, lac - а-комплементар-ная область lac оперона, Pnos - промотор гена нопалинсинтазы, npt II - кодирующая последовательность неоми-
цинфосфотрансферазы II из Tn5, noA - сайт полиаденилирования гена нопалинсинтазы; точками обозначены последовательности плазмиды pRK252, содержащие начало репикации из плазмиды RK2 с широким кругом хозяев.
Для модификации данного вектора использовали нуклеотидные последовательности плазмиды pFF19 (рис. 2).
Последовательность гена 35S-промотора длиной 994 bp была выделена из плазмидной ДНК pFF19 с помощью эндонуклеаз Hind III и EcoR I. Затем проводили ли-гирование Т4-лигазой промотора и вектора pBin19 (молярное соотношение вектор/вставка = 1:3) по сайтам рестрикции Hind III и EcoR I с использованием стандартных методик, предложенных фирмой-производителем (СибЭнзим, Новосибирск).
Генетические конструкции на основе вектора pBin19 вводились в клетки E. coli штамма JM 109 методом электропорации с помощью прибора производства Biorad (Bio-Rad Laboratories, США).
Z017!WCDJiU)TJinZ
Рис. 2. Карта плазмиды pFF19. (35S enh - энхансер, 35S prom - 35S-np0M0T0p вируса мозаики цветной капусты, 35S polyA - сайт полиаденилирования)
Рестрикционный анализ полученных клонов также проводился по стандартным методикам. Результаты анализов визуализировали с помощью электрофореза и обрабатывали с использованием системы гель-документирования GelDoc и программного обеспечения Bio-Rad (BioRad Laboratories, США). В качестве калибровочных маркеров использовали 100 bp +1.5 Kb DNA Ladder (СибЭнзим, Новосибирск).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Одним из основных регуляторных элементов бинарных векторов является промотор [6, с. 142]. «Сила» промотора, а, соответственно, возможность его использования в генной инженерии, определяется легкостью связывания с промотором фермента РНК-полимеразы и образования открытого комплекса, необходимого для
инициации транскрипции [1, с. 108]. Одним из наиболее широко используемых является конститутивный 35S-про-мотор вируса мозаики цветной капусты (СаМУ) [7, с. 285], который активен во всех тканях растения на протяжении всего цикла развития. Так, количественные исследования уровней транскрипции в трансгенных растениях табака показали, что 35S-промотор СаМУ, по меньшей мере, в 30 раз сильнее NOS-промотора нопалинсинтазы [8, с. 184].
Последовательность гена 35S-np0M0T0pa длиной 994 bp была встроена нуклеотидную послеловательность вектора по сайтам рестрикции Hind III и EcoR I (рис. 4 А, Б). На рис. 4 (Б) представлена полученная в результате ли-гирования конструкция Т-области модифицированного вектора (pBin19mod35S).
Рис. 3. Схема получения модифицированного бинарного вектора pBin19mod35S LB, RB - левая и правая границы Т-области, Nos-pro - промотор гена нопалинсинтазы, Npt II - кодирующая последовательность неомицинфосфотрансферазы II из Tn5, Nos-ter - сайт полиаденилирования гена нопалинсинтазы; 35S-pro - промотор CaMV, 35S-polyA - сайт полиаденилирования CaMV;
Полученным вектором pBin19mod35S трансформировали клетки E. coli штамма JM109. Рестрикционный анализ полученных клонов на наличие вставки 35S-про-мотора вируса мозаики цветной капусты проводился по сайтам рестрикции Hind III и EcoR I (рис.4).
Из данной электрофореграммы следует, что в одном из клонов вставка промотора прошла успешно, что
подтверждается наличием на треке №6 полосы длиной 994 Ьр, соответствующей длине последовательности 35S-про-мотора СаМУ. Таким образом, нами был получен экспрес-сирующий бинарный вектор pBin19mod35S, который можно использовать для клонирования целевых генов, их интеграции в геном растений и эффективной экспрессии в растительных клетках.
Рис. 4. Электрофореграмма продуктов рестрикционного анализа клонов, полученных в результате трансформации.
Треки 1-5 - нерестрицированная плазмидная ДНК клонов, 6-10 - плазмидная ДНК клонов, обработанная ре-стриктазами Hind III и EcoR I.
Полученный бинарный вектор был успешно использован для создания генетических конструкций с фрагментами генов транспортного белка и белка оболочки вируса кустистой карликовости малины. Так, фрагменты длиной 503 и 383 bp, соответственно, были клонированы по сайтам рестрикции Bam HI и Sal I вектора (рис. 5).
На рисунке 5 представлен вариант получения генетической конструкции на основе фрагмента гена транспортного белка ВККМ. Нами было получено несколько вариантов генетических конструкций. Так, часть кон-
струкций была получена в результате лигирования по одному сайту рестрикции (Bam HI или Sal I). Для этого вектор был обработан только одним из ферментов. В результате встраивалось несколько копий целевого фрагмента, что подтверждается результатами рестрикционного и ПЦР-анализа (рис. 6). Из данных рисунка видно, что в результате ПЦР были синтезированы как фрагменты длиной около 503 bp, соответствующие длине целевого фрагмента гена транспортного белка ВККМ, так и фрагменты превышающие длину фрагмента в 4 раза. Также были получены конструкции. Несущие единичные копии целевой последовательности, клонированной по двум сайтам рестрикции.
Рис. 5. Схема получения генетической конструкции с фрагментом гена транспортного белка ВККМ
Рис. 6. Электрофореграмма продуктов ПЦР-анализа клонов, несущих фрагмент гена транспортного белка ВККМ
Полученный модифицированный бинарный вектор и созданные на его основе генетические конструкции планируется использовать в дальнейшей работе по получению трансгенных растений малины, устойчивых к вирусу кустистой карликовости малины.
Список использованной литературы
1. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. Т.1. Генная и белковая инженерия. М.: Наука, 2004. - 530 с.
2. Zaenen I., Van Larebeke N., Van Montagu M., Schell J. Supercoiled circular DNA in crown-gall inducing Agrobacterium strains. J Mol Biol., V. 86, № 1, 1974. - P. 109-127.
3. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. Санкт-Петербург: СПбГУ, 2003. - 243 стр.
4. Wahlfors J., loimas S., Pasanen T., Hakkarainen T. Green fluorescent protein (GFP)fusion constructs in
gene therapy research. Histochem Cell Biol., 2001. Vol. 115. N 1. - P. 59-65.
5. Verkhusha V. V., Lukyanov K. A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat Biotechnol., Vol. 22. N3, 2004. - P. 289-296.
6. Carter B. T., Lin h., Cornish V. W. Yeast n-hybrid system for molecular evolution. Directed evolution of proteins, or how to improve enzymes for biocatalysis. N.Y. Wiley., 2002. - P. 127-158.
7. Frank A., Guilley H., Jonard G. Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA. Cell. V. 21., 1980. - P. 285-294.
8. Harpster, M.H., Townsend, J.A., Jones, J.D.G., Bedbrook, J. Dunsmuir, P. Relative strengths of the 35S cauliflower mosaic virus, 1', 2' and nopaline synthase promoters in transformed tobacco, sugarbeet and oilseed rape callus tissue. // Mol. Genet. Vol, 212., 1988. - P. 182-190.
РОЛЬ МАКРОФИТНОГО БАРЬЕРА В ПРОЦЕССЕ САМООЧИЩЕНИЯ ЭВТРОФИРАН-НЫХ ПРЕСНОВОДНЫХ ВОДОЕМОВ ОСОБО ОХРАНЯЕМЫХ ПРИРОДНЫХ
ТЕРРИТОРИЙ ГОРОДА МОСКВЫ
Наход Кирилл Викторович, Наход Валерия Игоревна Золотарев Константин Владимирович, Михайлов Антон Николаевич
Научный сотрудник, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский
институт биомедицинской химии имени В.Н Ореховича» (ИБМХ), г. Москва
АННОТАЦИЯ
Изучаемые водоемы расположены на территории природно-исторического комплекса (ПИП) «Кузьминки-Люб-лино», которому присвоен статус особо охраняемой природной территории (ООПТ) регионального значения. Мишкин пруд имеет площадь водного зеркала равное 2,34 га, Круглое озеро - 2,23 га.
