CC BY
126
УДК 579.62:637.07
А. Р. Зайнуллина, Е. В. Петухова, Г. Ю. Яковлева СОЗДАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ЭКСПРЕСС - МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
АНТИБИОТИКОВ В МОЛОКЕ
Ключевые слова: антибактериальные препараты, микробиологические экспресс- тесты, антибиотики в молоке.
Проведены эксперименты по созданию микробиологического экспресс - метода определения антибактериальных препаратов в молоке, аналога зарубежного теста, с целью импортозамещения и снижения стоимости продукции. Показано, что необходимо подобрать концентрацию спор штамма Bacillus stearothermophilus для получения результатов за более короткий период инкубирования, чтобы в дальнейшем апробировать ее в опытах с антибиотиками.
Key words: antibacterial medicines, microbiological express - tests, antibiotics in milk.
Experiments are made on creation of a microbiological express- method of definition of antibacterial medicines in milk, an analog of the foreign test, for the purpose of import substitution and depreciation of value production. It is shown that it is necessary to pick up concentration of spores of the strain of Bacillus stearothermophilus for obtaining results for more short period of incubation further to approbation it in experiments with antibiotics.
Введение
Проблема обнаружения остаточных антибиотиков в молоке и молочных продуктах актуальна на сегодняшний день. Во время исследований динамики ферментации при изготовлении кисломолочных продуктов было выявлено замедление или полное отсутствие процессов сквашивания в образцах молока, содержащих антибиотики [1]. Антибактериальные препараты широко используются в животноводстве для борьбы и профилактики заболеваний, улучшения качества и сохранности кормов [2].
Чем же опасны молочные продукты, содержащие остаточные антибиотики? Несоблюдение ветеринарных требований по применению антибиотиков приводит к их накоплению в продуктах животноводства [3]. При регулярном потреблении таких продуктов происходит распространение устойчивых видов микроорганизмов в организме и возникает вероятность появления бактерий высокой вирулентности и патогенности. Антибактериальные препараты также могут оказывать токсичное воздействие на организм, вызывать аллергическую реакцию, изменять кишечную микрофлору, способствуя развитию дисбактериоза [4].
Из 70 антибиотиков, использующихся повсеместно в животноводческой отрасли, в России контролируется четыре базовые группы - левомицетин, стрептомицин, тетрациклин и пенициллин.
Согласно техническому регламенту «О безопасности молока и молочной продукции» содержание антибиотиков в молоке жестко контролируется [5]. С этой целью используются различные экспресс -методы выявления остаточных антибактериальных препаратов в молоке.
Иммуноферментный метод позволяет более точно и с высокой чувствительностью обнаружить антибиотики в анализируемой пробе. Сущность метода заключается в связывании антител с антибактериальными препаратами в молоке, вследствие которого будет происходить окрашивание продуктов биохимической реакции, которое можно детектировать визуально, либо с помощью считывающего
устройства. Одним из наиболее распространенных иммуноферментных методов является тест <^ешог», который позволяет одновременно определить антибиотики бета - лактамного типа, тетра-циклиновой группы, левомицетина и стрептомицина [6].
Существуют электрохимические методы; например, с помощью методики вольтамперометри-ческого определения в молоке возможно выявить стрептомицин на уровне наноконцентраций. Также метод капиллярного электрофореза с последующим спектрофотометрическим детектированием позволяет одновременно обнаружить спарфлоксацин, предел обнаружения которого 19,8 мг/кг, ципро-флоксацин (15,2 мг/кг), энрофлоксацин (13,3 мг/кг) и флумехин (15,9 мг/кг) [7]. Данные методы являются точными, обладают высокой чувствительностью, но для их проведения требуются специалисты и дорогостоящее оборудование [8]. Также недостатком является то, что в данном процессе в связи с необратимым окислением определяемых соединений и адсорбцией их побочных продуктов на поверхности электрода, постепенно ухудшаются метрологические параметры и результаты анализа [1].
Известны хроматографические методы определения остаточных антибиотиков в молоке. Жидкостная хроматография в сочетании с масс - спектрометрией является методом с высокой чувствительностью и селективным определением антибактериальных препаратов хинолонового ряда в коровьем молоке [7]. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в свою очередь позволяет определить в - лактамную группу антибиотиков, которая часто используется в ветеринарной медицине, особенно для лечения и профилактики бактериальных инфекций у крупнорогатого скота [4]. Хлорамфениколы, в свою очередь, можно определить с помощью метода тонкослойной хроматографии с УФ - детектированием, при этом предел обнаружения составляет 1 мг/кг. Данную методику применяют как альтернативный вариант ВЭЖХ [9]. Однако недостатком хроматографических методов является проведение анализа высокого уровня ква-
лифицированным персоналом в лаборатории, оснащенной дорогостоящим оборудованием, что ограничивает возможность их широкого применения на предприятиях молочной промышленности.
Примером микробиологического метода определения антибиотиков является классический микробиологический анализ - чашечный метод, который является более доступным и характеризуется низкой стоимостью. Согласно ГОСТ 31502 - 2012 в качестве тест - культуры используется Bacillus stea-rothermophilus [10]. Метод основывается на способности антибактериальных препаратов, присутствующих в молоке, диффундировать в питательную агаризованную среду со спорами тестового микроорганизма и задерживать его рост, который визуализируют по прозрачным зонам после инкубирования в течение 4 часов. О присутствии антибиотиков в анализируемой пробе судят по диаметру зоны 12 мм и более.
Однако анализу подвергаются только те пробы молока, которые предварительно дали положительный результат с использованием индикатора резазу-рина или метиленового синего [11] и отрицательный - после проведения анализа на присутствие соды, аммиака и перекиси водорода [12,13,14].
В таблице 1 представлены наименьшие пределы определяемых антибиотиков в молоке чашечным методом.
Таблица 1 - Показатели наименьшего предела микробиологического определения антибиотиков чашечным методом
Наименование антибиотика Наименьший предел определения (мкг/г)
Бензилпенициллин 0,005
Мономицин 0,25
Неомицин 0,25
Окситетрациклин 0,1
Олеандомицин 2,5
Стрептомицин 0,5 - 1,0
Тетрациклин 0,1
Хлорамфеникол (левомице-тин) 2,5
Хлортетрациклин 0,05
Эритромицин 0,05
Альтернативой классическому методу определения антибактериальных препаратов в молоке являются микробиологические экспресс - тесты, нашедшие широкое применение на молочных пред-
приятиях. В питательную среду вносятся споры тест - культур и различные индикаторы. Принцип обнаружения заключается в изменении окраски питательной среды при отсутствии антибиотиков в анализируемой пробе. Наиболее распространенными среди микробиологических экспресс - методов являются BRT Inhbitor Test (Brilliant Black Reduction Test) и Delvotest SP.
Тест BRT Inhbitor Test (Brilliant Black Reduction Test) включает в себя герметично укупоренные пробирки или пластины с агаровой питательной средой, содержащей споры Bacillus stearothe-rmophilus various calodolactis и индикатор бриллиантовый черный; самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с пенициллином G массовой концентрацией 0,004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков. Чтение результатов пластин может быть осуществлено с помощью спектрофотометра при длине волны измерения в 450 нм и базовой длине волны в 620 нм [10].
Delvotest SP - тест включает в себя 4 блока ампул по 25 штук каждый, в которых содержится твердая агаровая среда со стандартизированным количеством спор Bacillus stearothermophilus var. сalidolactis C953, шприц - дозатор и 100 штук одноразовых наконечников для отбора проб молока, специальный инкубатор, предназначенный для инкубации тестов (выдержки при температуре 64 °С).
Для выявления остаточных антибиотиков с помощью шприца вводят анализируемое молоко в количестве 0,1мл ±10 % в соответствующую ампулу непосредственно на агаровую среду. Затем ампулы помещают в инкубатор с температурой 64 °С на 3 часа. Определяют результаты теста по изменению цвета среды в нижней (2/3) части ампулы) (рис. 1). При отсутствии в молоке (и в контрольной пробе) ингибирующих веществ содержимое ампулы будет иметь желтый цвет. При наличии в молоке ингиби-рующих веществ - содержимое ампулы будет иметь фиолетовый цвет. Фиолетовое кольцо на поверхности среды в ампуле не считают [10].
Рис. 2 - Результаты теста
В таблице 2 представлены выявляемые концентрации антибиотиков в сыром коровьем молоке при использовании метода Delvotest SP [10].
Целью работы являлось создание отечественного аналога зарубежного микробиологического экспресс - теста Delvotest SP для определения антибиотиков в молоке и молочных продуктах.
Таблица 2 - Пределы обнаружения антибиотиков в молоке с помощью микробиологического экспресс - теста Delvotest SP
Антибиотики Уровень определения антибиотиков после 3 часов (x10-3) мкг/г Антибиотики Уровень определения антибиотиков после 3 часов (x10-3) мкг/г
Группа ß - лактамы Макролиды
Пенициллин 2 - 3 Тилозин 50
Ампенициллин 6 - 7 Спирамицин 800 - 1000
Амоксициллин 3 - 5 Эритромицин 200
Цефтифур 50 - 100 Аминоглицоциды
Цефапирин 6 - 8 Гентамицин 200
Клоксациллин 20 - 30 Неомицин 300 - 600
Дикло ксациллин 10 - 20 Другие
Оксациллин 10 Триметоприм 200 - 300
Сульфамиды Тетрациклины
Сульфадиазин 100 - 150 Тетрациклин 800
Сульфаметазин 100 - 250 Окситетрациклин 800
Экспериментальная часть
В работе использовали штамм Bacillus stearothermophilus (ВКПМ В - 5816) Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов. Вид Bacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus) представляет собой палочковидные, грам - положительные бактерии, относится к отделу Firmicutes. Является термофилом, его температурный диапазон составляет от 30 до 75°С [15].
Приготовление сред и культивирование штамма Bacillus stearothermophilus проводили согласно паспорту штамма, выдаваемого из коллекции.
Для суспендирования лиофильно-высушенной культуры использовали мясо-пептонный бульон (МПБ) [16]. Затем микроорганизмы высевали на плотную питательную среду - мясо-пептонный агар (МПА) [16] и инкубировали при температуре 50-60°С в течение 18-20 часов.
Для восстановления полной жизнеспособности культуры требовалось 2 пассажа на МПА.
Для получения споровой культуры Bacillus stearothermophilus использовали среду согласно ГОСТ 31502 [10]. Питательную среду засевали культурой, помещали в термостат и выдерживали при температуре (55±1)°С в течение 3 суток. После окончания инкубации из культуральной жидкости отбирали пробы для приготовления мазков, которые окрашивали спиртовым раствором основного фуксина [16] и проводили микроскопирование.
При наличии в культуральной жидкости 90-95% свободных сформировавшихся спор посевы выдерживали при температуре 0-12°С в течение 16-18 часов для осаждения спор (рис. 2).
Рис. 2 - Препарат спор, окрашенных спиртовым раствором фуксина
Образовавшую надосадочную жидкость из колб сливали, а оставшийся осадок распределяли по стерильным центрифужным пробиркам и прогревали в термостате при температуре (67±2)°С в течение (30±1) мин. После этого пробирки помещали на центрифугу с частотой вращения 3000 мин-1 и разделяющим фактором 750 м/с2 и центрифугировали в течение 20-30 мин. Полученный осадок в каждой пробирке промывали стерильной дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной надосадочной жидкости.
Взвесь спор повторно нагревали при температуре (67±2)°С в течение (30±1) мин и переносили в пробирки [10].
В 100 мл питательной среды Кундрата [17], охлажденной до температуры (60±2)°С, вносили 4 см3 спор конечной концентрации и 2,5 см3 40 %-ной глюкозы [10]. Далее подготовленную среду вместе со споровым материалом разливали по 1 мл в эп-пендорфы в трех повторностях и инкубировали при температуре 64 °С в течение 3 часов согласно ГОСТ [10].
Результаты и их обсуждение
Метод основывается на способности антибактериальных препаратов, присутствующих в молоке, диффундировать в питательную агаризованную среду со спорами тестового микроорганизма и задерживать рост микроорганизмов. Вследствие выделения кислот, являющихся продуктами метаболизма тест - культур, происходит изменение цвета индикатора с фиолетового на желтый, что, в свою очередь, будет означать отрицательный результат анализа (рис. 3, б). В присутствии ингибирующих веществ метаболическая активность, следовательно, и рост микроорганизмов прекращается или замедляется, что влечет за собой отсутствие изменения фиолетового цвета, либо частичное изменение. Это будет означать положительный результат анализа.
а б
Рис. 3 - Изменение окраски среды в результате развития микроорганизмов: а - среда Кундрата, б - изменение цвета среды при развитии микроорганизмов
Задачей исследований являлся подбор такой концентрации спорового материала, которая бы обеспечила изменение окраски среды в контрольных вариантах (без антибиотиков) за 3 часа инкубирования.
В ходе нескольких экспериментов использовали споровый материал Bacillus stearothermophilus с
2 3 3 7
концентрацией от 5,010 - 5,010 в см до 9,010 в см3 (КОЕ/см3). Изменение окраски с фиолетового на желтый цвет было достигнуто за 4 часа в контрольных вариантах (рис.3 б) при концентрации спор 9,0107 в см3.
Заключение
Таким образом, в ходе экспериментов было выяснено, что необходимо подобрать концентрацию спор, при котором при отсутствии антибиотиков питательная среда будет менять окраску за более короткое время инкубирования (3 часа) при необходимой температуре. В дальнейших исследованиях
© А. Р. Зайнуллина - магистрант каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, aigul.zainullina@bk.ru; Е. В. Петухова - к.б.н., доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, petel07@yandex.ru; Г. Ю. Яковлева - к.б.н., доц. каф. микробиологии КПФУ, ya-kovleva_galina@mail.ru
© A. R. Zainullina - master student at the Depatment of Food biotechnolody, KNRTU; E. V. Petuhova - RhD in Biological sciences, Associate Professor at the Depatment of Food biotechnolody, KNRTU, petel07@yandex.ru; G. Y. Yakovleva - RhD in Biological sciences, Associate Professor at the Depatment of Microbiology, KFU
планируется подобранную концентрацию спор
апробировать в опытах с антибиотиками.
Литература
1. M. Carmen Beltrán, R. L. Althaus, A.Molina, M. I. Ber-ruga, M. P. Molina, Spanish Journal of Agricultural Research, 13, 9, (2015).
2. А. Доротова, E. Хрущева, Молочная промышленность, 46-48 (2009).
3. M. Claußen, D. Bahmann, S. Schmidt, FORMATEX, 359366 (2013).
4. Milk drug residue sampling survey. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.pdf-pages.com/d/MILK-DRUG-RESIDUE-SAMPLING-SURVEY-fda-gov.pdf.
5. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 033/2013. О безопасности молока и молочной продукции, 2013.
6. ГОСТ 32219 - 2013. Молоко и молочные продукты. Иммуноферментные методы определения наличия антибиотиков. M.: Стандартинформ, 2014.
7. A.L. Capriotti, C. Cavaliere, A. Cavazzini, P. Foglia, A. Laganà, S. Piovesana, R. Samperi, J. Chromatogr A., 1319, 72-79.
8. W. Reybroeck, Recent developments in antibiotics screening tests. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.afsca.be/laboratories/labinfo/_documents/2013-07_labinfo 10-p21 _en .pdf.
9. С. Бельтюкова, Е. Ливенцова, Методы и объекты химического анализа, 1, 4-13 (2013).
10. ГОСТ 31502 - 2012. Молоко и молочные продукты. Микробиологические методы определения наличия антибиотиков. M.: Стандартинформ, 2013.
11. ГОСТ 23454 - 79. Молоко. Методы определения ингибирующих веществ. M.: Стандартинформ, 1980.
12. ГОСТ 24065 - 80. Молоко. Методы определения соды. M.: Стандартинформ, 1981.
13. ГОСТ 24066 - 80. Молоко. Метод определения аммиака. M.: Стандартинформ, 1981.
14. ГОСТ 24067 - 80. Молоко. Метод определения перекиси водорода. M.: Стандартинформ, 1981.
15. A. Coorevits, AE. Dinsdale, G. Halket, L. Lebbe, P. De Vos, A. Van Landschoot, N.A. Logan, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62, 1470 -1485 (2012).
16. ГОСТ Р 53912 - 2010. Продукты пищевые. Экспресс-метод определения антибиотиков. M.: Стандартинформ, 2011.
17. ГОСТ Р 55481 - 2013. Мясо и мясные продукты. Качественный метод определения остаточных количеств антибиотиков и других антимикробных химиотера-певтических веществ. M.: Стандартинформ, 2014.
