Создание и применение нового экспресс-метода оценки качества семенных дрожжей Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ"

УдК 66.663.45

Создание и применение нового экспресс-метода оценки качества семенных дрожжей

С. Г. Давыденко, канд. биол. наук ОАО «Пивоваренная компания «Балтика»

Ключевые слова: брожение; дрожжи;углекислый газ; физиологическая и технологическая активность. Keywords: fermentation;yeast; carbon dioxide; physiological and technological activity.

В условиях высокой конкуренции и больших масштабов современного производства пива на первый план выдвигаются проблемы стабильности и качества выпускаемой продукции. Уникальность производства пива заключается как в использовании натуральных зерновых продуктов, так и в применении природной способности дрожжей сбраживать сахара пивного сусла с образованием этанола и большого числа побочных продуктов, определяющих «букет» напитка — главнейшую характеристику пивного бренда. Таким образом, производители пива заинтересованы в максимальной стабильности технологического процесса, в основе которого лежит бродильная активность дрожжей, и лишены возможности вносить свои коррективы на стадии конечного продукта. Известно, что увеличение продолжительности брожения может привести к недостаточному снижению концентрации веществ, отрицательно влияющих на вкус и аромат пива, вызвать несбалансированную горечь и размножение посторонних микроорганизмов [1]. На стабильность процесса главного брожения и дображивания влияют состав и свойства сусла, параметры проведения производственных стадий, а также количество и свойства пивоваренных дрожжей.

Качественными считаются дрожжи, которые быстро сбраживают сусло, хорошо седиментируют, но при этом размножаются с умеренной скоростью и в результате сообщают пиву характерный вкус и аромат. Высокая восстановительная способность

дрожжей необходима для устранения нежелательных продуктов, возникающих при брожении, например диацетила. Концентрация дрожжей в начальном сусле во многом определяет ход процесса брожения. Для ее точного задания используют как классические методы (микроскопи-рование и подсчет концентрации клеток в камере Горяева, взвешивание и определение коэффициента съема дрожжевой биомассы), так и автоматические приборы, работающие преимущественно на оптическом или электрическом принципе [2]. Для обеспечения стабильного процесса брожения необходимо не только определенное количество дрожжей, но и их качество, выявляемое их физиологической, метаболической и технологической активностью. Таким образом, количество дрожжей, необходимое в начале брожения для обеспечения высокоэффективного технологического процесса, зависит от их активности. Способность клеток к размножению принято называть жизнеспособностью, тогда как физиологическое состояние дрожжей и активность их обмена веществ характеризует их жизненную силу. Ян Шавел подчеркивает необходимость введения термина «технологическая активность» — способность дрожжей выполнять технологические требования в процессе производства [2].

Цитологические исследования дрожжей затруднены в связи с тем, что дрожжевые клетки имеют небольшой размер и толстую оболочку. Однако жизненную силу дрожжей оценивают в процессе микроскопи-

ческого анализа по внешнему виду клеток, по содержанию вакуолей и т. д., применяя различные методы окрашивания, например, метилено-вым синим, метиленовым фиолетовым в сочетании с сафранином, красным Понсо и т. д. В качестве флуоресцентных красителей применяют акридиновый оранжевый, диацетат флуоресцеина, родамин, эритрозин, примулин, магниевую соль 1-анилин-8-нафталенсульфоновой кислоты и т. д. [2, 3].

Необходимую информацию о качестве используемых дрожжей дают метаболические тесты. Так, например, очень важно определение количества гликогена — энергетического депо клетки, так как при расщеплении он обеспечивает энергией метаболические пути синтеза стеролов и ненасыщенных жирных кислот, необходимых для формирования мембранных структур клетки и других соединений. Другой важный полисахарид — трегалоза действует как антистрессовый фактор [2]. Исследования в области физиологии дрожжей показали, что внутриклеточный рН играет существенную роль в регуляции процесса ферментации и делении дрожжевых клеток [4]. Очень популярен тест на окисление, основанный на измерении внеклеточного рН после смешения дрожжей с глюкозой [5].

Для тестирования активности дрожжей во многих лабораториях измеряют выделение диоксида углерода, образовавшегося при сбраживании углеводов. Так, в трубке Дурхема интенсивность образования С02 оценивается по положению поплавка, а в трубке Эйнгорна — по величине образовавшегося газового пузыря. Для характеристики процессов, протекающих с выделением или поглощением газов (брожение, дыхание тканей животных и т. д.), используют аппарат Варбурга, где о количестве выделенного газа судят по показаниям манометра. Образование диоксида углерода можно также измерить по увеличению давления в закрытой емкости. По убыли массы бродильной емкости также можно рассчитать основные параметры пива, анализируемого на данный момент.

К физиологическим тестам также относятся электрохимическое измерение расхода растворенного кислорода и способность дрожжей

20 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2012

'ГЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

восстанавливать вещества сусла и молодого пива, например фурфурол и диацетил.

На производстве используют программированные датчики, при этом в реальном времени отслеживают легко измеряемые величины (например, температуру, видимый экстракт, скорость высвобождения диоксида углерода), а на основе модели рассчитывают другие показатели, и таким образом предсказывается реальный процесс главного брожения. Самый удобный метод — экспресс-измерение плотности бродящего пива. Наиболее просты датчики, измеряющие разницу давлений в двух или в трех местах бродильного чана, или тензометрическое измерение толщины поплавка. Технологическая активность измеряется в модельных тестах, которые имитируют процесс основного брожения. К ним прежде всего относится весовой анализ брожения. К сожалению, на результаты этих методов влияет геометрия бродильных емкостей, что снижает их точность. Кроме того, данные методы очень продолжительны.

Часто необходимо оценить качество дрожжей до начала процесса, сравнить их технологическую активность, рассчитать объем сусла, которое могут сбродить имеющиеся на производстве дрожжи. Эту информацию необходимо иметь заранее, чтобы спланировать работу варочного и бродильного отделений.

Известно, что бродильная способность дрожжей может быть оценена по объему диоксида углерода, выделяющегося в процессе брожения. Наиболее широко применяется метод определения зимазной (скорость сбраживания глюкозы или сахарозы) и мальтазной (а-глюкозидазной) активности (скорость сбраживания мальтозы). Мальтазную и зимазную активность выражают количеством времени (мин), необходимого для выделения 10 мл углекислого газа при сбраживании 5%-ного раствора мальтозы или глюкозы (сахарозы) 0,5 г дрожжей. Дрожжи помещают в колбу с притертой, соединенной с отградуированной и заполненной подкрашенным метиленовой синью

насыщенным раствором поваренной соли (36% NaCl) бюреткой, заливают 10 мл воды и размешивают до полного растворения.К полученной суспензии дрожжей добавляют 10 мл 10%-ного раствора сахара и закрывают колбу пробкой. Устанавливают уровень жидкости на отметку «0». Закрывают выход газа. Наблюдают за временем выделения 10 мл диоксида углерода, т. е. отмечают время, в течение которого из бюретки будет вытеснено 10 мл солевого раствора [6]. Дрожжи хорошего качества имеют зимазную активность 30-40 мин, мальтазную — 50-90 мин. Неудовлетворительные показатели качества дрожжей — зимазная активность больше 70 мин, мальтаз-ная — 100 мин.

Мы предлагаем более простой метод характеристики технологической активности дрожжей, также основанный на оценке интенсивности выделения диоксида углерода. Эксперимент был выполнен с использованием двух штаммов семенных пивоваренных дрожжей Н и С, широко применяемых в пивоварении. Семенные дрожжи H и C пятой и четвертой генераций центрифугировали 10 мин при 3000 мин-1. Дрожжи имели примерно одинаковую концентрацию — 240 и 300 г/л соответственно, влажность дрожжевого осадка 29%. Физиологическую активность оценивали с помощью классических методов окрашивания метиленовым синим (МС) и иодонитротетразоли-ум хлоридом (INS) [4]. Результаты представлены в таблице.

Совокупность наблюдаемых данных, полученных разными методами, не позволила увидеть существенную разницу в активности исследуемых дрожжей, что, соответственно, не позволяло и сделать вывод о преимуществе одних или других дрожжей.

Для решения этой задачи мы использовали максимально упрощенную модификацию аппарата Вар-бурга, в основе которой лежит тот же метод технологической оценки активности дрожжей по интенсивности выделения CO2. Однако мы учитывали не время, затраченное на образование 10 мл диоксида углеро-

Концентрация Среднее значение % клеток, % клеток,

Штамм Генерация биомассы высоты подъема окрашенных окрашенных

дрожжей, г/л поршня, см МС INS

Н 5 240 6,9 6,8 53

С 4 300 8,1 6,9 64

да, а количество диоксида углерода, выделенное изучаемыми дрожжами за 1 ч. Это существенно упрощает процедуру оценки активности дрожжей, так как позволяет использовать таймер для ведения отсчета времени. Длительность инкубации при необходимости можно сократить.

Основываясь на литературных данных по метаболизму пивоваренных дрожжей, мы создали условия для их интенсивного размножения.

Из дрожжевого сборника 1 мл исследуемых семенных дрожжей помещали в стеклянный стакан объемом 50 мл и добавляли 0,5 мл 40%-ной глюкозы или мальтозы, 0,25 мл восьмикратной среды YP (8x2% пептона, 8x2% дрожжевого экстракта) и 0,25 мл воды. Все тщательно перемешивали пипеткой и набирали в одноразовый медицинский шприц фирмы «ХЕЛЬМ Медикл ГмбХ» (Гамбург, ФРГ) объемом 10 мл, стараясь избежать образования пузырей воздуха. Выдавливали остатки воздуха из шприца и герметично запаивали его конец. Нагревали конец для иглы в пламени спиртовки и расплавившийся пластик сжимали металлическим пинцетом. Герметично запаянные шприцы оставляли в термостате при 30 °С на 1 ч. Через час замеряли высоту подъема поршня в шприце. По высоте подъема поршня определяли количество образовавшегося СО2 и, следовательно, оценивали бродильную активность семенных дрожжей (рис. 1).

5^2012

ПИВО и НАПИТКИ 21

я в и о

в

н И

в

Содержание спирта, об Л

Ж

"О я

% го

® в,

Я 3

" 5 ж о о , ч к

я ч

о о

05

ю

05

^ 05

Еа О о сг я о Я

05 Со 05

ч

сг

ф

Е са ж "■о о

СЛ 05 О - со Ч

о к го

05

Ж "О

к о » *

п * о ?

о Еа С4

в

<<

3

43 05

р °

о 04

О о Еа

Ж О4

ё в

о ф я

43 05

ж я ч

ж ж

О СИ

я I

Р о

Еа о

ег н

§ к ££

ж ^

2 *

5 ф

^ 2 2

н ^ Ч

О 43 ю

н 05 Ф

2 в к

а я ®

05 5

ж

Ж "О Ж 03

СО

ж ж ^ ж Ф ж

* ж

« 05

„ г сл

ф С/3 Еа Еа

05 тз -К

Й Ж М о4 о

ГО ' Ж

Е ю

Го * Я

о °>43

}э ^ Ж

ся Ф Ж Еа

05

4

С4

53 т ГО

Ж Е о го

2 О § °

Го тз

05

Со

а ж

ф о

Ч -

о л 1э ч о о

2 со

ж

05

л

ф

ж ж а

СЛ

Еа Я

Ж О

со Еа Я

Ж Л

Ф

Ж

ж Е

о Ж

я

о я

о о

о 1э

СЛ о

ж Л

Е ж

Я ч Е

я го

Еа 05

Ф Еа

Ч Ж

О

я Я

___ 43

— О

ж о К Ф Ж

ю ч

ж

й ф

*

ГО ж со

ж Ж

1э ф

со

Ж 43

ж

43

о *

* ф

Ж'

о п

ф ч

* £

£ О

ж а

Зн Со

о

о ф

ж

л

^ 05

05 2

я а ж е

го ">

05 О

Еа «С

Ж О > Я

> г п т

ж

сг

^ I

43 м ф 43 СО Ж <С О Еа '

04 ю

н я

05 _Я Ч ^ сг Ж

~ го — ф

3 я

э Е

ф

ж ° ф "О

ж

I

ш

1 га

"О Ф

О X

3= ^

<< ф

ш го н х

си О

X п § ^

0\ о

I *

I ф

II

О о н (Ь

о- Е

х х

п о

£ ф ф

Действительная степень сбраживания %

ф

п -1-

£ "

05 ГО

ж

ж

ч

ф

Еа С4

0\ <~1 I

ш 1 го

X X

ь ^

ф ф

° £ х 3=1

си За =1 "Й О §

& 5=

ф ф

а

I

о §

X

о ф

~го 1

о 5

го X -а о ф го 3 Е » 3 а\п

Ф 3

Нежизнеспособные клетки,

Окрашенные клетки, %

Лучший рецепт в индустрии напитков!

исполнения и необходимостью наличия соответствующей аппаратуры.

Совокупность вышеизложенных фактов свидетельствует о целесообразности применения нового экспресс-метода для прогнозирования технологического процесса пивоварения, поскольку предлагаемый нами метод оценки по сравнению с существующими имеет ряд преимуществ: быстрота, информативность, простота исполнения, возможность количественного сравнения, эффективность, воспроизводимость, замена более сложного и дорогостоящего оборудования.

В практике пивоварения различные производители пива используют разные штаммы дрожжей для создания уникальных напитков. Применяя новый метод, можно построить кривые технологической активности индивидуально для определенных штаммов и заданных технологических параметров. Особенно это актуально для небольших пивоварен, закупающих сухие дрожжи. С помощью нового метода можно оценить технологическую активность сухих дрожжей и рассчитать время разбраживания. Эти данные могут быть использованы для стабилизации и стандартизации технологического процесса, а следовательно, для улучшения качества продукции, а также при поисках причин нарушения главного брожения и появления нежелательных изменений вкуса и аромата пива.

ЛИТЕРАТУРА

1. Нарцисс, Л. Краткий курс пивоварения/Л. Нарцисс при участии В. Бака; пер. с нем. А. А. Куреленкова. — СПб.: Профессия, 2007. — 640 с.

2. http : //www.propivo .ru/prof/technology /22/ izmerenie. htm.

3. Давыденко, С. Г. Применение методов окраски дрожжей для оценки их физиологического состояния/С. Г. Давыденко [и др.] // Пиво и напитки. — 2011. — № 5. — С. 8-11.

4. Imai, T. Development of a new method for evaluation of yeast vitality by measuring intracellular pH/T. Imai, I. Nakajima, T. Ohnj // J. Am. Soc. Brew. Chem. — 1994. — 52. — № 1. — P. 5-8.

5. Kara, B. V. Prediction of the fermentation performance of brewing yeast with the acidification power test / B. V. Kara, W. J. Simpson, J. R. M. Hammond // J. Inst. Brew. — 1988. — 94. — P. 153-158.

6. Ленинджер, А. Основы биохимии/А. Ле-нинджер. — М., 1985. — 367 с. &

Теперь со вторника по четверг!

Нюрнберг, Германия

13 -15.11.2012

BrauBeviale2012

Raw Materials - Technologies - Logistics - Marketing

/

\

w

Ûp га h и эдтор

tiL^t-iroMesH GndH uiirorwrMifPipnumiDf rqiriHîi' ds Информация

ООО » Лрофе ссиоиалин ые выставка HytL'PT AlMH'iop Тел -T.j 9S I je ■ÏJKC 1-7.-1 3S.1 2Î-1S 71

■ "1ùLÏ-|ÏIOÎH'4h Ljf.HliJ" \ tu

brau-beviale.de

NÜR

wv

МйЕйй MESSE