CC BY
537
БИОХИМИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО
УДК 573.6
Мл. науч. сотрудник Н.Е. Сороколетова, профессор Е.И. Кондратенко, доцент H.A. Ломтева, доцент Н.В. Нетипанова
(Астраханский гос. ун-т) кафедра молекулярной биологии, генетики и биохимии, тел. (8512) 52-49-94 E-mail: bios94@mail.ru
Junior Researcher N.E. Sorokoletova,
Professor E.I. Kondratenko, Associate Professor
N.A. Lomteva, Associate Professor N.V. Netipanova
(Astrakhan state university) chair of molecular biology, genetics and biochemistiy, tel. (8512) 52-49-94 E-mail: bios94@mail.ru
Современные аспекты использования генно-модифицированных компонентов в продуктах питания и методы их обнаружения
Modern aspects uses of gene-modified components in food and methods their detection
Реферат. Затрагиваются вопросы обеспечения продовольственной безопасности на территории Российской Федерации, связанной с трансгенными продуктами. Цель работы - исследование пищевых продуктов на присутствие генно-модифицированных организмов. Дан аналитический обзор по этой тематике, в котором рассматривается отношение к ГМО в мире и на территории нашей страны. Приводятся примеры трансгенных линий и компаний-производителей. Освещены регу-ляторные последовательности и гены трансгенных вставок линий, разрешенных для применения в пищевых продуктах и кормах на территории Российской Федерации. В ходе работы проводилось выделение ДНК из продуктов питания и обнаружение в геноме терминатора NOS - Eph с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Выделение ДНК и постановка ПЦР осуществлялись с помощью готовых комплектов реагентов. Детекцию результатов проводили методом электрофореза. Использовались наиболее популярные среди населения продукты. Мониторинг рынка сбыта продовольственной продукции проводился самостоятельно на территории Астрахани. Объектами исследования были: замороженные и консервированные овощи - кукуруза, зелёный горох, картофель, фасоль стручковая, томатная паста и соусы, колбасные изделия (ветчина, колбаса 2 видов), сыпучие продукты (пюре и супы быстрого приготовления), кондитерские изделия (шоколадные батончики, торты), продукты детского питания (пюре, каши, соки). При исследовании более 100 образцов, отнесенных к различным товарным группам, последовательность терминатора NOS-Eph обнаружена в семи образцах продуктов, содержавших в своем составе сою и картофель. При исследовании учитывалось наличие маркировки на товаре об отсутствии в продукте ГМО.
(Q Сороколетова Н.Е., Кондратенко Е.И., Ломтева H.A., Нетипанова Н.В., 2014
Summary. Work involves food security issues in the Russian Federation related to transgenic products. Article is devoted by research of foodstuff on existence genno - the modified organisms. To be provided the state-of-the-art review on this subject in which the relation to GMO in the world and in the territory of our country is considered. Provides examples transgenic lines and manufacturers. Are lit regulatory sequences and genes of transgene inserts of the lines allowed for application in foodstuff and sterns in the territory of the Russian Federation are covered. In the course of was carried out DNA extraction from food and detection of genomic NOS - terminator Ephs by polymerase - chain reaction (PCR). Isolation and PCR was carried out with the help of ready-made kits of reagents. Detection of results was carried out by an electrophoresis method. The most popular were used, among the population, brand of producers. Monitoring of a sales market of production, was conducted independently, in the territory of Astrakhan. The objects of our study were: frozen and canned vegetables -(corn, green peas, potatoes, green beans), tomato paste and sauces, meat products (ham, sausage 2 species), bulk foods (mashed potatoes and instant soups), confectionery (chocolate bars, cakes), baby food (mashed potatoes, cereals, juices). At research more than 100 samples carried to various commodity groups the sequence terminator of NOS-Eph is found in seven samples of the products containing soy and potatoes in the structure. At research existence of marking on goods about absence in GMO product was considered.
Ключевые слова: генно-модифицированные организмы (ГМО), по-лимеразная цепная реакция (ПЦР), трансгенные растения, терминатор NOS-Eph.
Keywords: gene-modified organisms (GMO), polimerazny chain reaction (PCR), transgene plants, terminator of NOS-Eph.
Генетически модифицированные (трансгенные) организмы можно определить как организмы, генетический материал которых (ДНК) изменён способом, недостижимым естественным путём в ходе внутривидовых скрещиваний. Для получения ГМО используется технология рекомбинантных молекул [6].
Мнения ученых о безопасности и вреде генетически модифицированных организмов не однозначны и по сей день. Встраивание в геном организма хозяина новых конструкций нацелено на получение нового признака, недостижимого для данного организма путем селекции или требующего нескольких лет работы селекционеров. Но вместе с приобретением такого признака организм приобретает и целый набор новых качеств, опосредованных как плейотропным действием нового белка, так и свойствами самой встроенной конструкции, в том числе ее нестабильностью и регуляторным действием на соседние гены [11].
В последнее десятилетие благодаря разработке новых и совершенствованию имеющихся методов молекулярно-генетического изучения геномов живых организмов идет активное развитие сельскохозяйственной биотехнологии. Одним из результатов этой активности является производство и широкое внедрение в сельское хозяйство новых генно-модифицированных сортов растений [10]. Использование трансгенных растений в биотехнологии позволяет значительно ускорить процесс получения нового сорта, снизить его себестоимость и получить хорошо прогнозируемый эффект по признаку, определяемому встроенной конструкцией. Но вместе с данным признаком организм приобретает целый набор новых качеств [6].
В 2010 году исполнилось 15 лет со дня выхода коммерческих ГМ культур на мировой рынок, и к настоящему времени общая суммарная площадь пахотных
земель, занятых ГМ сельскохозяйственными культурами, составила более 1 млрд га [10].
Примерно 95 % территорий, занятых ГМ-сортами сельскохозяйственных культур, расположены в пяти странах: США, Канаде, Бразилии, Аргентине и Китае [6]. Другая же пятерка стран - Австрия, Венесуэла, Греция, Польша и Швейцария являются зонами свободными от ГМО (ЗСГМО). Очевидно, что вопрос о создании таких зон достаточно остро стоит и в Российской Федерации. Наибольшая активность в плане создания ЗСГМО наблюдается в Белгородской области и Москве. Также вопросы о создании таких зон поднимаются в Волгоградской, Костромской, Мурманской, Рязанской, Свердловской и Ульяновской областях и Краснодарском крае [5].
На территории Российской Федерации на сегодняшний день ГМО выращивается только на опытных участках. Легализован ввоз некоторых сортов кукурузы, картофеля, сои, риса и сахарной свеклы. С 1 сентября 2007 года в России ужесточился контроль над продуктами питания, содержащими генетически модифицированные организмы. Если в состав изделия входит ГМ соя, это должно быть указано на упаковке. Маркировка обязательна для тех продуктов питания, где наличие ГМО превышает 0,9 % от массы содержащего их ингредиента. До этого момента нижний порог в нашей стране был 5 % процентов. В соответствии с постановлением правительства № 839, подписанным премьером Д.А. Медведевым, в России разрешили засевать поля генно-модифицированными культурами. Известно, что поставщиками семян будут транснациональные корпорации Syngenta, Monsanto, KWS, Pioneer. В этой связи в Минздраве создается специализированный реестр ГМО и продукции с ее использованием [1].
По сведениям Минздрава в 2003 году России зарегистрированы 59 пищевых ГМ продуктов (в том числе 11 напитков и коктейлей, 4 специализированных продукта для спортсменов, 22 пищевые добавки, 3 вида мороженого, 3 вида вегетарианских бургеров, 16 других белковых продуктов) [8]. Список сельскохозяйственных культур, генно-инженерные сорта которых официально допущены к использованию во всех странах мира, включает 20 наименований: соя, кукуруза, рапс, хлопчатник, томаты, картофель, рис, сахарная свекла, лен, турнепс, кабачки, дыни, табак, папайя, цикорий, пшеница, гвоздика, полевица, люцерна, слива. Однако не все они выращиваются в промышленных масштабах. Ряд генетически модифицированных культур, таких, как картофель кабачки, папайя и томаты, относительно массово выращивался лишь в отдельные годы [7].
В России массовое производство трансгенных растений пока не разрешено. По состоянию на 2011 году, в России разрешены к использованию 17 линий трансгенных растений (табл. 1).
Таблица 1
Регуляторные последовательности и гены трансгенных вставок линий, разрешенных для применения в пищевых продуктах и кормах на территории Российской Федерации
Растения Линия Производитель Промотор Ген Термина
Соя GTS4032 Monsanto, США CaMV E35S CP4 EPSPS NOS
А2704-12 BayerCropScience, Германия CaMV 35S Pat CaMV 35S
А5547-127 Bayer Crop-Science, Германия CaMV 35S Pat CaMV 35S
MON89788 Monsanto, США Р-FMV/ TSF1 CP4 EPEPS T-E9
Окончание табл. 1
Растения Линия Производитель Промотор Ген Термина
Кукуруза MON81C) Monsanto, США CaMV E35S CiylAb -
MON863, Monsanto, США 4ASl,CaMV E35S Ciy3Bbl, nptll tahspl7, NOS
NK603 Monsanto, США CaMV35S,ract CP4 EPEPS NOS
MON88017 Monsanto, США CaMV35S, ract CP4 EPEPS, Ciy3Bbl NOS, tahsp 17
GA21 Monsanto, США ract mEPSPS NOS
ВТ11 Syngenta Crop Protection AG, Швейцария CaMV35S CiylAb, pat NOS
Т25 BayerCropScience, Германия CaMV 35S pat CaMV 35S
3272 mpi Syngenta Seeds Inc, США GZein ZmUbilnttaa, CaMV 35S, NOS
Картофель Луговской 1210 amk Центр Биоинженерии РАН P-FMV Ciy3A E9 NOS
Елизавета 2904/1 kgs Центр Биоинженерии РАН P-FMV Ciy3A E9 NOS
Рис LLRICE62 Bayer CropScience, Германия CaMV 35S bar CaMV 35S
Сахарная свекла Н7-1 Р- Monsanto, США FMV CP4EPSPS rbcS E9
Продовольственная безопасность - стабильное производство основных продуктов питания и их доступность населению - является одним из условий устойчивости системы экономических, социальных и экологических параметров, определяющих качество жизни населения и являющихся, по своей сути, показателями эффективности государственного управления. Обеспечение продовольственной безопасности - исключительно сложная и многоуровневая проблема, комплексное решение которой требует сосредоточения усилий специалистов различных областей науки, техники, государственных и муниципальных органов управления, а также предприятий и правоохранительных структур [7]. Возникает вопрос: насколько соответствуют технологии производства продуктов питания установленным требованиям на территории Российской Федерации.
В связи с этим возрастает актуальность проведения исследований по идентификации ГМО в составе того или иного продукта. Цель работы - проведение скрининга продуктов питания на выявление генетически модифицированных источни-
Одним из наиболее эффективных методов является проведение полимеразной цепной реакции (PCR или ПЦР). Метод ПЦР заключается в выявлении рекомби-нантной ДНК, использующейся для создания трансгенных растений «кассет экспрессии». Однако существуют альтернативные способы обнаружения ГМО в продуктах питания. К примеру, алтайскими учеными был изобретен прибор, не имеющий аналогов в мире, позволяющий выявлять модифицированную последовательность в продуктах в течение как минимум 5 мин.
Объектами исследования были: замороженные и консервированные овощи (кукуруза, зелёный горох, картофель, фасоль стручковая), томатная паста и соусы, колбасные изделия (ветчина, колбаса 2 видов), сыпучие продукты (пюре и супы быстрого приготовления), кондитерские изделия (шоколадные батончики, торты),
продукты детского питания (пюре, каши, соки). Мониторинг рынка сбыта продовольственной продукции проводился самостоятельно на территории Астрахани.
Работа включала в себя отбор и предподготовку проб, выделение ДНК, проведение ПЦР, детекцию результатов методом электрофореза.
Отбор и предподготовку проб проводили по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья и пищевых продуктов в соответствии с ГОСТР 52173-2003 и ГОСТР 52174 [3, 4].
Выделение ДНК включало следующие этапы:
- разрушение клеток;
- удаление мембранных липидов;
- удаление вторичных метаболитов и запасных веществ;
- удаление белков;
- удаление РНК;
- осаждение ДНК.
Экстракцию ДНК из продуктов питания проводили с использованием комплекта реагентов «Ампли Сенс ДНК-сорб-С» (Москва), предназначенного для выделения ДНК из клинического материала, продуктов питания и кормов для животных.
На следующем этапе проводили амплификацию, используя комплект реагентов «Ампли Сенс Терминатор NOS-Eph» вариант 100 R, предназначенный для амплификации ДНК терминатора NOS, содержащегося в генетически модифицированных организмах.
Индикация трансгенных вставок осуществлялась по наличию в образцах специальных регуляторных последовательностей, обеспечивающих правильную экспрессию, внесенных человеком в клетки растений. Обнаружение этих последовательностей составляет основу первичного скрининга продовольственного сырья на наличие ГМО. Такая стратегия поиска оправдана тем обстоятельством, что подавляющее количество разрешенных к использованию на территории РФ линий трансгенных растений (см. табл. 1) имеет один или сразу два регуляторных элемента на основе 35s-npoMoropa и NOS-терминатора [9].
Терминатор NOS присутствует в геноме кукурузы линии GA-21, линий сои 403-2, картофеля, томатов и ряда других ГМО. Терминатор NOS отсутствует в геноме линий сои А-2704-12, А-5547-127 и кукурузы линий MON8IO, Т-25, ВТ-176, 1507.
После выделения ДНК проводилась амплификация полученных образцов по следующей программе: 95 °С - 5 мин, 1 цикл; 95 °С - 1 мин, 61 °С - 1 мин, 72 °С -
1 мин, 42 цикла; 72 °С - 1 мин, 1 цикл. Общее время амплификации составило
2 ч 30 мин.
После амплификации осуществляли детекцию результатов в агарозном геле. Использовался 2 %-ный гель, величина тока составляла 200 Вт, время фореза - 2025 мин. Учёт результатов ПЦР-анализа проводился по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК. Чувствительность была выше установленного правительством РФ порога (0,9 %).
Длина специфических полос амплифицированных фрагментов ДНК: терминатор NOS - 180 п.н. Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контроля амплификации и отрицательного контроля экстракции нуклеиновых кислот. Допустимо появление слабоокрашенных дополнительных фрагментов ПЦР выше 350 п.н., которые не следует учитывать при анализе результатов.
В качестве положительного контроля амплификации тест-набором предусмотрена ДНК сои (табл. 2).
Таблица 2
Результаты исследования рекомбинантной ДНК в продуктах растительного и животного происхождения
Наименование товаров Количество образцов Терминатор NOS-Eph
Обнаружено Не обнаружено
Замороженные овощи 35 0 35
Консервированные овощи 40 0 40
Томатная паста и соусы 11 4 7
Колбасные изделия 4 1 3
Сыпучие продукты 6 0 6
Кондитерские изделия 7 2 5
Продукты детского питания 6 0 6
В результате проведения скрининга продуктов питания на выявление генетически модифицированных источников исследовано более 100 образцов, отнесенных к различным товарным группам продовольствия. Последовательность терминатора NOS-Eph обнаружена в 7 образцах продуктов, содержавших в своем составе сою и картофель. Терминатор NOS-Eph содержался в некоторых соусах (майонез, кетчуп), колбасных и кондитерских изделиях. Все продукты не имели пометки «без ГМО». Следовательно, установленные требования по наличию генно-модифицированных продуктов на территории Российской Федерации не нарушены.
Информировать население о содержании в продуктах ГМО необходимо. Установленные в этом отношении нормы законодательства должны строго соблюдаться на всей территории Российской Федерации. В ином случае речь уже будет идти о фальсификации состава продукции. Фальсификация качественного состава пищевой продукции - нарушение Закона РФ «О защите прав потребителей». Информационная фальсификация является обманом потребителя с помощью неточной или искаженной информации о продукте. Этот вид фальсификации осуществляется путем искажения информации в товарно-сопроводительных документах, маркировке и рекламе [2]. Нами в этом отношении основных нарушений выявлено не было.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеев, Я.И. 35-Промотор вируса мозаики норичника (P-FMV) новая мишень для анализа на содержание генетически модифицированных организмов [Текст1 / Я.И. Алексеев, Т.В. Хотяинцева, C.B. Боровская, О.С. Колобова [и др.] // Известия ТСХА. - 2011. - № 6. - С. 156-161.
2. Горлов, И.Ф. Идентификация и мониторинговые исследования мясных продуктов на содержание ГМО и соответствие требованиям нормативно - технической документации [Текст] / И.Ф. Горлов, O.A. Шалимова, К.Ю. Зубарева [и др.] // Вестник Орловского государственного аграрного университета. - 2009. - № 4. С. 35-38.
3. ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения». -Москва: Изд-во стандартов, 2004. - 16 с.
4. ГОСТ Р 52174-2003 «Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа» (с Изменением № 2). Москва: Изд-во стандартов, 2004. - 16 с.
5. Иваненко, Т.А. Некоторые аспекты информированности граждан о продуктах, полученных из генно-модифицированных организмов [Текст] / Т.А Иваненко / / Вестник Адыгейского государственного университета. Серия 4: Естественно-математические и технические науки. - 2011.- № 4.- С 138-144.
6. Кузнецов, В.В. Генетически модифицированные организмы: наука и жизнь. [Электронный ресурс] / В.В. Кузнецов, А.С. Баранов, В. Лебедев // Электрон, журн.
- Наука и жизнь. Москва, 2008. -№ 6. - режим доступа: http: / /www.nkj.ru свободный
7. Михалко, Е. Р. Методические аспекты оценки риска возможных неблагоприятных эффектов ГМО для здоровья человека и их влияние на продовольственную безопасность государства [Текст] / Е. Р. Михалко // Наука о человеке: гуманитарные исследования. - 2010. - № 5.- С. 89-95.
8. Моностырский, О.А. Продовольственная безопасность России: вчера, сегодня, завтра / О. А. Монастырский // ЭКОСинформ. - 2004. - № 4.- С. 5-64.
9. Рогов, И.А. Особенности определения и количественной оценки ГМО [Текст] / И.А. Рогов, В.В. Колотвин, Н.В. Нефедова // Методы оценки соответствия. - 2009.
- № 2.- С. 21-23.
10. Чесноков, Ю.В. ГМО и генетические ресурсы растений: экологическая и агротехническая безопасность [Текст1 /Ю.В. Чесноков / / Вавиловский журнал генетики и селекции.- 2011. Том 15, -№ 4. - С. 818-827.
11. Цыдендамбаев, В.Д. ГМО: Фундаментальные основы возможных экологических рисков [Текст] / В.Д. Цыдендамбаев / / Методы оценки соответствия. -2008. - № 2. - С. 14-18.
REFERENCE
1. Alekseev, Y.I. 35-figwort mosaic virus promoter (P-FMV) a new target for analysis of genetically modified organisms [Textl / Y. Alekseev, Т. V., Hotyaintseva, S.V. Bo-rovskaya [and othersl / / Proceedings of the TAA, - 2011. - № 6. - P. 156-161.
2. Gorlov, I.F. Identification and monitoring studies of meat products for GMO content, and conformity with regulatory - technical documentation [Textl / I-F. Gorlov, O.A. Shalimova, K.Y. Zubarev [and others] / / Bulletin of the Oryol State Agrarian University. - 2009. - № 4.- P. 35-38.
3. GOST R 52173-2003 «Raw material and products. Method of identification of genetically modified (GMO) plant». - Moscow: Publishing House of Standards, 2004.
- 16 p.
4. GOST R 52174-2003 «Biosecurity. Raw materials and food. Method of identification of genetically modified (GMO) plant using biological microchip» (with a change in № 2). Moscow: Publishing House of Standards, 2004. - 16 p.
5. Ivanenko, T.A. Some aspects of the citizens' awareness of products derived from genetically modified organisms [Textl / T.A. Ivanenko / / Bulletin of Adyghe State University. Series 4: natural and mathematical and engineering sciences. - 2011.- № 4.
- P. 138-144.
6. Kuznetsov, V.V. Genetically modified organisms: science and life. [Electronic resource] / V.V. Kuznetsov, A.S. Baranov, V. Lebedev / / Electron. Zh. - Science and Life. Moscow, 2008. -№ 6. - Mode of access: http://www.nki.ru free
7. Mihalko, E.R. Methodological aspects of risk assessment of possible adverse effects of GMOs on human health and their impact on food security of the state [Text] / E.R. Mikhalko // The Science of Man: Studies in the Humanities. - 2010. - № 5.
- P. 89-95.
8. Monostyrsky, O.A. Food safety of Russia: yesterday, today and tomorrow [Text] /
0.A. Monastic // EKO Sinform. - 2004. - № 4.- P. 5-64.
9. Rogov, I.A. Features of the definition and quantification of GMOs [Textl /
1.A. Rogov, V.V. Kolotvin, N.V. Nefedov / / Methods of conformity assessment. - 2009. -№ 2.- P. 21-23.
10. Chesnokov, Y.V. GMOs and plant genetic resources: environmental and agronomic security [Textl /Y.V. Chesnokov / / Vavilov Journal of Genetics and selektsii.-2011. Volume 15, -№ 4. - P. 818-827.
11. Tsydendambaev, V.D. GMO: Fundamentals of possible environmental risks [Textl / V.D. Tsydendambaev // Methods of conformity assessment. - 2008. - № 2.
- P. 14-18.
