CC BY
147
ТОМ 1
НОМЕР 2
АПРЕЛЬ - ИЮНЬ 2008
КЛИНИЧЕСКАЯ
О Н КОгематология
РЕДКИЕ И СЛОЖНЫЕ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ
Difficulties in differential diagnosis of TCRyd precursor T-leukaemia/lym-phoma from plasmacytoid dendritic cell lymphoma (a case report)
N. N. Tupitsyn, A. M. Kovrigina, D. S. Osmanov,
E. N. Sholokhova, N. A. Kupryshina, O. Yu. Baranova,
M. A. Frenkel, M. N. Sinitsyna
Summary:
Multiple skin lesions were the primary manifestations of disease in 23-year old patient. He received treatment during about 1 year for peripheral T-cell lymphoma and then was admitted to Cancer Research Center. Cutaneous tumor, lymph nodes and bone marrow (hyper cellular, 91.2 % blasts) were studied both morphologically and immunologically. Cutaneous tumor (paraffin sections) demonstrated phenotype of blastic NK/plasmacytoid dendritic cell lymphoma (CD4+CD56+TCL-1+CD3£-TCIR3-TdT+/-). Bone marrow flow cytometry revealed CD3/TdT co-expression as well as TCRyd on blastic cells. Immunomorphological study of lymph node (cryostat sections, fluorescent method) was more in line with T-cell precursor tumor (CD7+, weak CD5 and CD3). The particular feature of the case was the expression of one from three CD3 epitopes studied. It was concluded that the final diagnosis is precursor TCRyd T-cell leukaemia/lymphoma.
Keywords:
blastic NK/plasmacytoid dendritic cell lymphoma, cutaneous tumor, TCRyd T-cell leukaemia/lymphoma.
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow Контакты: enshell@mail.ru
Принято в печать: 18 апреля 2008 г.
Сложности дифференциальной диагностики лимфомы/лейкоза из TCRyd Т-клеточных предшественников и лимфомы из плазмоцитоидных дендритных клеток (описание случая)
Н. Н. Тупицын, А. М. Ковригина, Д. Ш. Османов, Е. Н. Шолохова, Н. А. Купрышина, О. Ю. Баранова, М. А. Френкель, М. Н. Синицына
РЕФЕРАТ
Пациент, 23 лет, с дебютом заболевания в виде множественного поражения кожи, с предварительным диагнозом периферическая Т-клеточная лимфома. Проведено комплексное обследование, включавшее гистологический, иммуногистохимический, иммуноморфологический, морфоцитохимический методы, а также метод проточной цитометрии с использованием трехцветной флюоресцентной метки. Бластные клетки были гемопоэтической природы (экспрессировали CD45), мономорфно экспрессировали антигены CD56, CD4, TdT. С учетом данных литературы и полученных результатов — обнаружение маркеров CD7, CD5, CD3 и мембранных рецепторов TCRyd на TdT-позитивных бластных клетках — описанный случай был расценен как лейкоз/лимфома из предшественников yd-Т-лимфоцитов ^D7+CD3+TdT+CD5+/-) с коэкспрессией антигенов NK-клеток (CD56 и CD16) и миелоидного антигена CD33.
Ключевые слова
лимфома из плазмоцитоидных дендритных клеток, лимфома кожи, лимфома/лейкоз из TCRyd Т-клеточных предшественников.
ВВЕДЕНИЕ
Поводом для написания данной статьи явились сложности в дифференциальной диагностике у молодого пациента с поражением кожи. При проведении комплексного обследования с применением современных морфологических и иммунологических методов при значительной схожести полученных результатов были выявлены некоторые противоречия в определении линейной принадлежности опухолевых клеток. Надеемся, что наш опыт еще раз убедительно продемонстрирует целесообразность одномоментного применения широкого спектра морфоиммунологических методов, что дает возможность для более тонкого подхода при установлении диагноза.
В последние годы, уже после опубликования классификации ВОЗ 2001 г. [1], в литературе появились описания новой нозологической единицы — опухоли из плазмоцитоидных дендритных
клеток (ПДК). В классификации ВОЗ эти опухоли не выделялись в отдельную нозологическую единицу, и лимфомы с подобным фенотипом входили в раздел лимфом из естественных киллерных клеток (NK-бластных лимфом).
Первоначально неопухолевый нормальный эквивалент — ПДК — для ряда NK-бластных опухолей был установлен методами проточной цитометрии и функциональными тестами [1—4], однако в дальнейшем появились описания иммуногистохимической диагностики лимфом из ПДК [5]. Опухоли из ПДК часто характеризуются поражением кожи, что и обусловило одно из их названий — гематодермическая опухоль. Помимо классификации ВОЗ для опухолей гемопоэтической природы существует классификация ВОЗ для лимфом кожи [6, 7], включающая подкожные лимфомы, лимфомы из NK-клеток, NK/T-клеточные лимфомы и прочие лимфомы из цитотоксических Т-клеток.
156
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Лимфома/лейкоз из TCR-Л Т-клеточных предшественников
Принципиальной диагностической особенностью лимфом из ПДК является отсутствие какой-либо линейной принадлежности злокачественных клеток (Т-, В-, миело-идной), экспрессия NK-клеточного маркера CD56 в сочетании с CD4, а также дополнительных признаков — TCL-1, рецептора IL-3 (CD123), BDCA-2 [8]. Наибольшие сложности представляет дифференциальная диагностика пре-Т-клеточных вариантов лимфом (лейкозов) и лимфом из ПДК. В случаях TCRa3 Т-клеточных лимфом эти вопросы в большинстве случаев можно решить на основе цитоплазматической экспрессии CD3 и а-, 3-цепей Т-клеточного рецептора [9]. Вместе с тем, как показывают зарубежные работы, при sCD3-позитивных Т-лимфобластных лимфомах и лейкозах очень часто (примерно */3 случаев) мишенью злокачественной трансформации являются уб-Т-клеточные предшественники [9—11]. Особенностью этих случаев является то, что они не содержат проторецептор pTCRa [12] и не имеют этапа цитоплазматической экспрессии у- и б-цепей TCR
[9]. Диагностика этих случаев предполагает обязательную оценку мембранного CD3 в сочетании с оценкой мембранной экспрессии TCRyA
Важной особенностью лимфом из ПДК, как, впрочем, и других лимфом из клеток-предшественников, является частая лейкемизация, т. е. выявление бластных клеток в костном мозге.
В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН иммуноморфологическая диагностика лимфом проводится по свежезамороженному (криостатные срезы, люминесцентная микроскопия) и фиксированному (парафиновые срезы, иммуногистохимия) биопсийному материалу первичной опухоли с обязательным морфоцитохимическим и иммунологическим (проточная цитометрия) исследованием костномозгового лейкемического компонента [13—15]. Описываемый нами случай иллюстрирует необходимость комплексного подхода для диагностики лимфом с использованием методов иммуногистохимии и проточной цитометрии.
Клинический случай
Больной К., 23 лет. Дебют заболевания в июле 2006 г., когда в области нижней трети голени слева появилось мягкотканное образование синюшного цвета, плотноэластической консистенции, безболезненное, до 2 см в диаметре. Отмечался его медленный рост. За медицинской помощью больной обратился в сентябре 2006 г. В онкологическом диспансере была выполнена эксцизионная биопсия образования, размер которого к этому времени достиг 8 см. При гистологическом исследовании убедительных данных за неопластический процесс не получено. В ноябре 2006 г. появились множественные образования на коже туловища синюшного цвета, с четкими ровными краями плотноэластической консистенции, от 0,5 до 2,0 см в диаметре. При пересмотре готовых гистологических препаратов по месту жительства в январе 2007 г. установлен диагноз Т-клеточной неходжкинской лимфомы. Исследование костного мозга на начальном этапе заболевания выполнено не было. С февраля 2007 г. больному проведено 8 курсов полихимиотерапии по схеме СНОР-14.
Полная регрессия кожных образований отмечалась уже после 1-го курса терапии. В августе 2007 г. проведена лучевая терапия на область нижней трети голени слева в СОД 40 Гр.
В сентябре 2007 г. отмечено прогрессирование заболевания в виде появления мягкотканного узлового образования в области верхней трети бедра слева размером до
5,1 X 4,7 см. Проведено 3 курса терапии по схеме СНОЕР с временным эффектом. В январе 2008 г. вновь отмечено уве-
личение узлового образования. Проведен 4-й курс химиотерапии в аналогичном режиме. В феврале 2008 г. больной обследован в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.
Данные обследования
Общее состояние больного относительно удовлетворительное. Активных жалоб нет. Кожные покровы обычной окраски, чистые. Отмечается увеличение практически всех групп периферических лимфатических узлов, их размеры варьируют от 1,5 до 3,0 см в диаметре. Печень, селезенка при пальпаторном исследовании не увеличены.
В гемограмме: лейкоциты 1 1,32 X 109/л (метамиелоциты 2 %, палочкоядерные 5 %, сегментоядерные 68 %, лимфоциты 22 %, моноциты 3 %), эритроциты 4,7 X 1012/л, уровень гемоглобина 135 г/л, тромбоциты 158 X 109/л. Активность ЛДГ — 305 ЕД.
При рентгенологическом исследовании грудной клетки патологических изменений не выявлено.
При УЗИ отмечается увеличение периферических лимфатических узлов (их размеры колеблются от 1,6 до 3,0 см) — околоушных, подчелюстных, шейно-надключичных, подключичных, подмышечных, паховых. В воротах печени — лимфатические узлы до 2 см. В левой подвздошной области — несколько лимфатических узлов до 4 см в диаметре. Парааортально и в правой подвздошной области увеличенные лимфоузлы не определяются. В правой грудной железе — узел до 1 см в диаметре. Печень, желчный пузырь, поджелудочная железа, селезенка, почки — без патологии.
При исследовании спинномозговой жидкости количество клеточных элементов в 1 мм3 составило 85 клеток, из них 90 % — бластные клетки.
Гистологическое исследование. В готовом препарате 2007 г. (кусочек кожи) во всех отделах дермы массивный диффузный инфильтрат из клеток среднего размера с бластной структурой хроматина, с округло-овальными и неправильными ядрами без отчетливых ядрышек. Видны митозы (до 4 в поле зрения, X 400). Признаков эпидермотропизма не обнаружено (рис. 1).
Иммуногистохимическое исследование по парафиновым блокам. Материал — биоптат кожи 2007 г. Исследование проведено с использованием антител к CD 1а, CD3 (клон эпсилон), CD4, CD5, CD8, CD10, CD20, CD23, CD45, CD56, CD68 (PG-M1), лизоциму, MUM.1, перфори-ну, BCL-2, TCL-1, TdT, TCR (bF1), панцитокератину, миело-пероксидазе, TIA-1, Ki-67.
Рис. 1. В дерме диффузный инфильтрат из бластных клеток среднего размера, без признаков эпидермотропизма. Окраска гематоксилином и эозином. X 400
www.medprint.ru
157
Н. Н. Тупицын и соавт.
Рис. 2. Экспрессия опухолевыми клетками CD56 (интенсивная мембранная реакция, клетки реактивного микроокружения негативны). Иммуноферментный метод. х 400
Рис. 3. Экспрессия опухолевыми клетками TCL-1 (ядерная реакция, клетки реактивного микроокружения негативны). Иммуноферментный метод. х 400
Рис. 4. Реакция с антителом к CD3 (клон эпсилон). Позитивны Т-клетки реактивного микроокружения. Опухолевые клетки негативны. Иммуноферментный метод. х 100
Клетки опухолевого инфильтрата экспрессировали CD4 (интенсивно), CD45, CD56 (интенсивно) (рис. 2), TCL-1 (интенсивно) (рис. 3), BCL-2. Отсутствовала экспрессия TCR
Рис. 5. Реакция с антителом к /S-цепям Т-клеточного рецептора (bF1). Позитивны Т-клетки реактивного микроокружения. Опухолевые клетки негативны. Иммуноферментный метод. х 200
Рис. 6а. Морфоцитохимическая характеристика бластных клеток больного К. Окраска гематоксилином и эозином. х 100
Рис. 6б. Гранулярно и крупногранулярно расположенное PAS-положительное вещество в бластных клетках.х 100
(SF-1). Антиген Ki-67 обнаружен в 30—50 % клеток в различных полях зрения (х 400). TdT-позитивны до 10 % клеток опухолевого инфильтрата. С другими маркерами в опухолевых клетках реакции негативны.
Т-клетки CD3+ (рис. 4), CD5+, CD8+, bF1+ (рис. 5) расположены в виде очаговых скоплений. В-клетки крайне немногочисленны (CD20+).
158
Клиническая онкогематология
Лимфома/лейкоз из TCR-Л Т-клеточных предшественников
Заключение. Морфоиммуногистохимическая картина опухоли кожи соответствует бластной лимфоме из клеток естественных киллеров (NK) (гематодермическая опухоль).
Иммунофлюоресцентное исследование биопсийного материала опухоли (шейный лимфатический узел) по криостатным срезам. Исследование проведено методом непрямой иммунофлюоресценции, в качестве вторых антител использованы F(ab)2-фрагменты козьих антител к иммуноглобулинам мыши, меченные FITC. Антитела CD13, CD33, CD34, CD56 использованы в качестве прямых конъюгатов с фикоэритрином. Антитела к CD3 использованы как в непрямой РИФ, так и в качестве прямых конъюгатов с фикоэритрином.
Опухолевые клетки мономорфно экспрессировали общелейкоцитарный антиген CD45, молекулы HLA-DR, CD7, CD33 (тип реакции неяркий) и CD56, CD4, CD38 (выраженная экспрессия).
На большинстве опухолевых клеток отмечена слабая экспрессия CD5. Крайне слабая экспрессия CD3 в части опухолевых клеток выявлялась лишь при использовании антител LT-3, меченных фикоэритрином (но не при использовании моноклональных антител ICO-90 в непрямой реакции иммунофлюоресценции).
Опухолевые клетки не содержали CD10, CD23, CD21. Присутствовали небольшие группы и отдельные нормальные Т-лимфоциты (CD3+, CD8+, CD2+). Экспрессия CD1a отсутствовала. В опухолевой ткани имелись единичные В-лимфоциты (CD19+, CD20+), отдельные дискретно расположенные гистиоциты (CD163+, CD13+), отдельные плазмоциты (CD38+ + + ). Антиген CD34 экспрессирован только на эндотелии сосудов. Отсутствовали фолликулярные дендритные клетки, выявляемые на основании реакции на CD21, CD23.
Заключение. Иммунофенотип опухолевых клеток соответствует лимфоме из предшественников Т-лимфоцитов с коэкспрессией NK-клеточных антигенов CD56 и миелоидных антигенов CD33.
Морфоцитохимическое исследование костного мозга. Пунктат богат клеточными элементами. Количество миелокариоцитов составляет 683 X 109/л. Мегакариоци-ты определяются в достаточном количестве. Основную массу клеток (91,2 %) составляют бласты. Резко угнетены нормальные ростки гемопоэза.
Бласты представлены мономорфной популяцией клеток преимущественно среднего размера (97 %), макроформы составляют 3 %. Очертания клеток правильные, округлые. Ядра неправильной формы, складчатые, с выемкой. Цитоплазма слабо базофильная, не содержит включений. Ядерно-цитоплазматическое отношение высокое (рис. 6а).
При цитохимическом исследовании бластов реакция на миелоперокисидазу, липиды с суданом черным В и на неспецифическую эстеразу — отрицательны. PAS-положительное вещество определяется в 100 % бластов в значительном количестве в форме гранул и лакун (рис. 6б). При просмотре препаратов видны фигуры митозов с частотой 2 %.
Иммунологическое исследование бластных клеток костного мозга (проточная цитометрия). Исследование проведено с использованием трехцветной флюоресцентной метки. Бластные клетки идентифицировали на основании слабой в сравнении с лимфоцитами экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45 и низких показателей бокового рассеяния света лазерного луча (SSC — side
scattering в терминах проточной цитометрии), отражающих отсутствие зернистости в клетках. Этот принцип широко используется в иммунофенотипировании острых лейкозов и лимфом из клеток-предшественников [15, 16]. Этот подход полностью оправдал себя в данном случае, т. к. опухолевые клетки идентифицировались как предшественники, слабо экспрессирующие CD45 (рис. 7, а). Это очень важно, т. к. позволило раздельно оценить и сравнить уровень экспрессии CD3, TdT, TCR в опухолевых клетках и нормальных Т-лимфоцитах. Иммунофенотип бластов представлен в табл. 1.
Таблица 1. Иммунофенотип бластных клеток больного К. по данным проточной цитометрии
Маркер Процент антиген-позитивных бластов (CD45 ± SSC low)
В-клеточные антигены
CD19 0,5
CD20 1,9
T/NK-клеточные антигены
CD7 90,0
CD5 63,2w
CD3 (LT3) 66,5*
TCRa/S (эпитоп CD3, WT-31) 63,0 (рис. 7, е)
TCRyd 44,6 (рис. 7, ж)
CD1a 0,5
CD56 84,3 (рис. 7, г)
CD16 67,1
CD2 14,4
CD4 98,3
CD8 0,4
Миелоидные антигены
CD13 3,8
CD33 93,7
Моноцитарные антигены
CD64 1,8
Маркеры клеток-предшественников
CD34 0,2
TdT+, cCD3(LT3)+ 82,2 (рис. 7, д)
Прочие
HLA-DR 97,8
CD38 96,3
Примечания: w — weak, слабая экспрессия; cCD3 — цитоплазматичекая экспрессия CD3.
* Положительная мембранная экспрессия CD3 выявлялась только с фикоэритриновым конъюгатом антител LT3 и была одинакова по уровню флюоресценции с Т-лимфоцитами (рис. 7, б); экспрессия CD3 FITC, выявляемых моноклональными антителами ICO-90, на бластах отсутствовала и была яркой на лимфоцитах (рис. 7, в).
Заключение. На основании данных морфоцитохимических и иммунологических исследований бластных клеток костного мозга сделано заключение о наличии острого лимфобластного лейкоза/лимфомы из Т-линейных предшественников уд-Т-лимфоцитов
(CD7+CD3+TdT+CD5+/—) с коэкспрессией антигенов NK-клеток (CD56 и CD16) и миелоидного антигена CD33.
Проведена полихимиотерапия по схеме LOP Выполнены три люмбальные пункции с интратекальным введением метотрексата в дозе 12 мг, цитозара 30 мг, дексаметазона 4 мг. Лечение сопровождалось выраженным противоопухолевым эффектом. Отмечено уменьшение размеров всех групп периферических лимфатических узлов на 50 %, отсутствие бластных клеток в ликворе.
В миелограмме от 06.03.08 г. бластные клетки составили 2,5 % при низкой клеточности костного мозга.
www.medprint.ru
159
Н. Н. Тупицын и соавт.
CD 3 FITC (3) vs SSC-Height (2)
Рис. 7. Экспрессия на бластных клетках молекул CD45, CD3, TdT, CD56 и TCR. Проточная цитометрия на приборе FACScan: а — CD45 as SSC: бластные клетки (окрашены красным) более слабо экспрессируют CD45 в сравнении с лимфоцитами (окрашены зеленым); б — по оси ординат уровни экспрессии мембранного CD3-PE (LT-3) одинаковы на бластах (красные) и лимфоцитах (зеленые), по оси абсцисс — экспрессия CD16; в — экспрессия детерминанты CD3 (ICO-90-FITC) отсутствует на бластах (красные) и яркая на лимфоцитах (зеленые); г — выраженная экспрессия CD56 на бластных клетках; д — коэкспрес-сия TdT (FITC) и CD3 (LT-3, FITC) бластными клетками; е — экспрессия CD3 (WT-31) более выраженная на лимфоцитах (зеленая кривая), чем на бластах (красная кривая); ж — выраженная экспрессия TCRyd на небольшой пропорции лимфоцитов (TCRyd-T-лимфоциты), отсутствие на большинстве лимфоцитов (зеленая кривая), слабая экспрессия TCRyd на бластах (красная кривая)
160
Клиническая онкогематология
Лимфома/лейкоз из TCRyd Т-клеточных предшественников
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты морфологических и иммунологических исследований, полученные разными методами, были во многом сходны, в чем-то дополняли друг друга, а в отдельных позициях были явно противоречивыми.
Сходство состояло в том, что бластные клетки были гемопоэтической природы (экспрессировали CD45) и были мономорфно-положительными в реакциях на CD56 и CD4, экспрессировали TdT. Хотя процент TdT-позитивных клеток в проточной цитометрии и при иммуногистохимическом исследовании существенно различался (82 и 10 % соответственно), обнаружение терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы явилось дополнительным аргументом отнесения опухоли к лимфоме/лей-козу из клеток-предшественников. Сходство результатов, полученных различными методами, состояло также в отсутствии в бластах миелопероксидазы, Т-клеточных маркеров (CD8, CD2, CD 1a), В-клеточных (CD20, CD 19) миелоидных и гистиоцитарно-макрофагальных (CD 13, CD64, CD68, CD163, CD64, лизоцима), CD10, а также маркеров фолликулярных дендритных клеток CD21 и CD23.
Методом иммуногистохимии по парафиновым блокам показано отсутствие в клетках перфорина и панцитокератинов. Отмечалась достаточно высокая пролиферативная активность (30—50 % КІ-67+), экспрессия BCL-2 и, что особенно важно в контексте обсуждаемой проблемы, TCL-1. Экспрессия TCL-1 является весьма важным диагностическим маркером ПДК, но не специфичным и выявляется при пре-Т-ОЛЛ/лимфомах [17, 18].
Дополнительная информация, полученная при исследованиях по криостатным срезам, а также при морфоцитохимическом и иммунологическом исследованиях костного мозга, состояла в том, что опухоль являлась цитохимически негативной с особым характером расположения гликогена, мономорфно экспрессировала CD7, CD38, HLA-DR, а также панмиелоидный антиген CD33.
Явные противоречия получены при оценке Т-линейной принадлежности бластных клеток по таким маркерам, как
CD3, CD5, TCR.
Отмечено совпадение реакций по CD5 в проточной цитометрии и иммунофлюоресцентном исследовании по криостатным срезам — слабая экспрессия на большинстве бластов. Иммуногистохимически опухоль была CD5-негативной.
Очень сложна интерпретация данных по CD3. Мембранный маркер CD3 выявлялся только при использовании антител LT-3 к CD3, меченных фикоэритрином (РЕ), но не при использовании флюоресцентно меченных моноклональных антител ICO-90. На криостатных срезах опухоли CD3 выявлялся также только с РЕ-меченными антителами LT-3 ( крайне слабая экспрессия). Рассмотрим более подробно клоны антител и, соответственно, выявляемые ими эпитопы или цепи молекулы (табл. 2).
Не менее сложной является интерпретация данных по TCR (табл. 3).
Таблица 3. Антитела к TCR и цепи рецептора, изученные в работе
Метод исследования Клон Цепь CD3 Эпитоп
Иммуногистохимия /3F1 (Endogen) 3 Каркас /3-цепи
Проточная цитометрия TCR«3-FITC (BD*, США) WT-31 Конформационный эпитоп TCR/CD3o"
TCRyd-FITC (BD, США) 11F2 д1
* BD — Becton Dickinson.
** Конформационный эпитоп молекулы CD3e. Образуется при связывании у-, д- или «/31-цепей TCR с CD3e.
Согласно данным фирмы-производителя (Becton Dickinson, США), моноклональные антитела WT-31 распознают конформационный эпитоп, образующийся при взаимодействии молекулы CD3 с Т-клеточным рецептором, преимущественно это TCRa3 Т-клетки. Вместе с тем доказано, что МКА WT-31 распознают эпитоп молекулы CD3, который не экспрессирован на CD3 в отсутствие мембранных молекул TCR (COS-клетки, трансфецированные геном CD3
[22]). В норме эпитоп преимущественно экспрессирован на TCRa3 Т-клетках. Вместе с тем антитела реагируют и с TCRyd-клетками [23], а также с COS-клетками, экспрессирующими у- и d-цепи TCR [22].
Иными словами, реакция с антителами WT-31 свидетельствует о мембранной экспрессии на клетках £-цепей CD3 в ассоциации с полипептидными цепями TCR, но не об экспрессии («3-цепей TCR. Таким образом, подтверждена мембранная экспрессия CD3, установленная с помощью МКА LT-3. В данном случае TCR относится к варианту уд, что подтверждено антителами 11F2, специфичными к д1-цепям TCR. Экспрессия этих цепей указывает на то, что реаранжировки генов a-цепей TCR не произошло, т. к. не делетирован ген д-цепей, расположенный в пределах локуса a-гена. Эти данные полностью согласуются с отсутствием экспрессии a^-цепей TCR на основе реакции с антителами 3F1 в иммуногистохимическом исследовании по парафиновым блокам. Таким образом, речь идет о бластных клетках, экспрессирующих на мембране TCRyd в комплексе с молекулами CD3. Это клетки-предшественники, т. к. CD3 экспрессирован на TdT-позитивных клетках.
В нашем наблюдении определение Т-клеточной кло-нальности проведено по костному мозгу после начала лечения и ответа на терапию — содержание бластов 2,5 %. В результате ПЦР-анализа клональности по реаранжировке генов у-цепи Т-клеточного рецептора не выявлено, что может быть обусловлено низким бластозом.
Экспрессия молекул TCR в классификации Т-клеточных лейкозов/лимфом из Т-предшественников позволяет идентифицировать дискретные стадии дифференцировки этих опухолей и классифицировать эти неоплазии на основе уникальных признаков с использованием моноклональных антител (табл. 4) [9]. Эти антитела реагируют исключительно с CD3-позитивными ОЛЛ и не окрашивают В-линейные и
Таблица 2. Антитела к CD3, использованные в работе
Метод исследования Клон Цепь CD3 Эпитоп
Иммуногистохимия F7.2.38 (Dako)*** £-цепь Цитоплазматический
Люминесцентная микроскопия по криостатным срезам ICO-90 (немеченый), F(ab)2-FITC CD3* Мембранный
LT3-PE CD3** Мембранный
Проточная цитометрия ICO-90-FITC CD3* Мембранный
LT3-PE CD3** Мембранный
* Использованы антитела к CD3 [4] производства НПЦ «Медбиоспектр» (Москва), стандартизованные на V Международном рабочем совещании по лейкоцитарным антигенам [19]. Цепь CD3 неизвестна.
** Использованы антитела к CD3, полученные А. В. Филатовым, производства ООО «Сорбент» (Москва), стандартизованные на VI Международном рабочем совещании по лейкоцитарным антигенам CD3 [20]. Цепь CD3 неизвестна.
*** L. Alibaud и соавт., 2000 [21].
www.medprint.ru 161
Н. Н. Тупицын и соавт.
миелоидные клетки. На основании использования комплекса моноклональных антител, D. Campana и соавт. [9] удалось выделить пять стадий дифференцировки Т-клеточного лей-коза/лимфомы из предшественников Т-клеток (табл. 5).
Таблица 4. Моноклональные антитела, использованные в работе D. Campana и соавт. [9]
3F1* Общая детерминанта 3-цепей TCR
aF1* a-цепи TCR
WT-31 Мембранные TCRa3. Антитела реагируют с эпитопом CD3e, доступным только после того, как полностью собранный комплекс CD3/TCRa3 встроен в клеточную мембрану. Хотя антитела WT31 также слабо реагируют с тау5-клетками, условно их можно считать реагентом против TCRa3, т. к. эти клетки метятся со значительно большей интенсивностью
TCRy-1 Все TCRy5, несущие Т-клетки
yTCS-1 Подкласс ТОу5-клеток, использующих V51-J51
* Эпитопы отсутствуют на мембране интактных клеток и проявляются после фиксации.
Таблица 5. Стадии дифференцировки Т-клеточного лейкоза/лимфомы из клеток-предшественников [9]
Группа mTCR cTCR Кол-во
I — — 17
II — 3F1+, aFl- 9
III — aFl+, 3Fl- 1
IV — aF1+, 3F1 + 2
Va TCRa3+ — 9
Vb* TCRy-1+, yTCS-1 — 2
* Оба случая sCD3+TCR 51+TdT+. Анализ реаранжировки генов TCR. 1-й случай: /31 — D/R,/32 — G/G; у1 — D/R, у2 — R/G; <51 — R/R (один аллель V<51-J<51, другой — D<52-J<51); 52 — G/G. 2-й случай: 31 — R/G,32 — G/G; у1 — R/R, у2 — G/G; 51 — R/R (один аллель V51-J51, другой — V52-J 51); 52 — G/G.
Конфигурация генов TCR3, -у и -5 проанализирована в работе D. Campana и соавт. [9] в 23 случаях T-ОЛЛ. Отсутствие экспрессии белка TCR было обусловлено отсутствием перестроек гена TCR лишь в 1 из 9 случаев. Во всех 5 случаях TCR3+, TCRa— гены TCRa были в зародышевой конфигурации (не обнаружено делеции гена TCR5). В 7 из 8 случаев делеции гена TCR5 были экспрессированы белки TCRa, в то время как лишь в 12 из 20 T-ОЛЛ с перестроенным геном TCR3 имел место синтез соответствующего белка. Лишь в 2 из 16 случаев с перестроенными TCR5-генами были экспрессированы 5-цепи TCR. По данным литературы, мембранный TCRy5 более часто, чем TCRa3, экспрессирован при Т-ОЛЛ [10]. Важно подчеркнуть, что TCR специфичны для Т-клеток и не экспрессируются на предшественниках В-лимфоцитов и миелоидных клеток. Это контрастирует с частым обнаружением начальных перестроек генов TCR, наблюдаемых при В-линейных ОЛЛ. Интересно отметить, что TCR5 в отличие от TCR3 отсутствует в цитоплазме клеток, последовательные стадии (цитоплазматическая и мембранная) для этого антигена (5-цепь) не определены.
Таким образом, установлено, что группы Т-ОЛЛ, выделяемые с помощью антител к TCR, не имеют дополнительных специфических иммунофенотипических характеристик и могут более точно соответствовать нормальным стадиям Т-клеточной дифференцировки, чем группы, выделяемые на основании экспрессии дифференцировочных антигенов [9]. Вообще, TCRy5 Т-клеточные лейкозы/лимфомы из клеток-предшественников с экспрессией мембранного CD3 не являются редкостью. V Asnafi и соавт. [12] при анализе 114 случаев Т-ОЛЛ у 23 пациентов выявили TCRy5 Т-ОЛЛ с экспрессией мембранного CD3. К сожалению, экспрессию мембранного TCRy5 не определяли и принадлежность к этой линии устанавливали на основании ПЦР-анализа. Исследование пре-TCR (рТа) позволило разделить эти лейкозы на две категории: рТа+ и рТа—. Теоретически случаи рТа+ могут соответствовать лейкозам из клеток-предшественников а3- и у5-Т-лимфоцитов. Среди sCD3+ TCRy5 Т-ОЛЛ преобладали рТа-негативные варианты (62 %), которые можно рассматривать как лейкозы из истинных предшественников TCRy5 Т-клеток. Бластные клетки этих больных имеют ряд особенностей: редко экспрессированы антигены CD34 (17 %), CD2 (53 %), миелоидные антигены CD13/CD33 (8 %), TdT (50 % в сравнении со 100 % в группе рТа+), CD56 (0 %), CD1a (15 vs 38 %), CD10 (30 vs 75 %). В 100 % случаев экспрессирован CD5, в 53 % — CD4. Экспрессия CD56 была более характерна для Т-ОЛЛ из незрелых предшественников (IMy5) TCRу5-клеток, не экспрессирующих sCD3 и cTCR3, в этих случаях частота выявления антигена достигала 50 %.
С учетом данных литературы и полученных результатов описанный случай был расценен как лейкоз/лимфома из предшественников у5-Т-лимфоцитов. Основанием для этого явилось обнаружение CD7, CD5, CD3 и мембранных TCRy5 на ТdТ-позитивных бластных клетках. По-видимому, для верификации данного варианта лейкоза в иммуногистохимическом методе необходимо использование моноклональных антител к TCRy5 для диагностических целей, однако в настоящее время подобные антитела отсутствуют. Вместе с тем ряд вопросов, в частности различия в реакциях с моноклональными антителами к CD3 при данном варианте лейкоза/ лимфомы из у5-Т-предшественников, остается без ответа. Учитывая клинические данные (длительность заболевания от манифестации до начала лечения), выраженную экспрессию опухолевыми клетками CD4, CD56, нельзя исключить билинейный Т/NK-клеточный лейкоз с наличием общей коммитированной тимической клетки-предшественницы. Для решения данного вопроса необходимы дальнейшие исследования, в частности молекулярно-генетическое исследование наличия или отсутствия A-траскрипта CD94, химерного транскрипта AF10-CALM [24].
ЛИТЕРАТУРА
1. Jaffe E. S., Harris L. N., Stein H., Vard-iman J. W. (eds.) Tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. — Lyon: IACR Press, 2001. — 351 p.
2. Chaperot L., Bendris N, Manches O. et al. Identification of a leukemic counterpart of the plas-macytoid dendritic cells. Blood 2001; 97: 3210-7.
3. Chaperot L., Perrot I., Jackob M. C. et al. Leukemic plasmacytoid dendritic cells share phenotypic and functional features with their normal counterparts. Eur. J. Immunol. 2004; 34: 418-26.
4. Барышников А. Ю., Тоневицкий А. Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. — М.: Типография ВНТИЦ, 1997. — С. 14-21.
5. Reichard K. K., Burks E. J., Foucar K. et al. CD4(+) CD56(+) lineage-negative malignancies are rare tumors of plasmacytoid dendritic cells. Am. J. Surg. Pathol. 2005; 29(10): 1274-83.
6. World Health Organization. Skin Tumors. — Lyon, 2006. — P. 165-228.
7. Massone C., Chott A., Metze D. et al. Subcutaneous, blastic natural killer (NK), NK/T-cell, and other cytotoxic lymphomas of the skin (a morphologic, immunophenotypic, and molecular study of 50 patients. Am. J. Surg. Pathol. 2004; 28(6): 719-35.
8. Jaye D. L., Geigerman C. M., Herling M. et al. Expression of the plasmacytoid dendritic cell marker BDCA-2 supports a spectrum of maturation among CD4+ CD56+ hematodermic neoplasm. Mod. Pathol. 2006; 19: 1555-62.
9. Campana D., van Dongen J. J. M., Metha A. et al. Stages of T-cell receptor protein expression in T-cell acute lymphoblastic leukaemia. Blood 1991; 77(7): 1546-54.
10. Gouttefangeas C., Bensussan A, Boumsell L. Study of the CD3-associated T-cell receptors reveals further differences between T-cell acute lymphoblastic lymphoma and leukemia. Blood 1990; 75: 931.
11. Van Dongen J. J. M., Comans-Bitter W. M., Wolvers-Tetter I. L. M., Borst J. Development of human T lymphocytes and their thymus-dependency. Thymus 1990; 16: 207.
12. Asnafi V., Beldjord K., Boulanger E. et al. Analysis of TCR, pTa, and RAG-1 in T-acute lymphoblastic leukemias improves understanding of early T-lymphoid lineage commitment. Blood 2003; 101(7): 2693-703.
162
Клиническая онкогематология
Лимфома/лейкоз из TCR-Л Т-клеточных предшественников
13. Ковригина А. М., Пробатова Н. А. Лимфома Ходжкина и крупноклеточные лимфомы. — М.: МИА, 2007.
14. Туп ицын Н. Н. Иммунодиагностика острых лейкозов и неходжкинских лимфом. В кн.: Клиническая онкогематология, 2-е изд. / Под ред. М. А. Волковой. — М.: Медицина, 2007. — С. 338-70.
15. Туп ицын Н. Н, Кадагидзе З. Г., Шати-нина Н. Н. и др. Иммунодиагностика гемобла-стозов человека: Пособие для врачей. — М., 2003.
16. Луговская С. А., Почтарь М. Е., Тупи-цын Н. Н. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов. — М.: Триада, 2005.
17. Fu T.-B, Virgillio L., Narducci M. G. et al. Characterization and localization of the
TCL-1 oncogene product. Cancer Res. 1994; 54: 6297-301.
18. Herling M., Teitell M. A., Shen R. R. et al. TCL1 expression in plasmacytoid dendritic cells (DC2s) and the related CD4+ CD56+ blastic tumors of skin. Blood 2003; 101(12): 5007-9.
19. Schlossman S. F., BoumsellL., Gilks W. et al. (eds.) Leucocyte Typing V. White cell differentiating antigens. — Oxford: Oxford University Press, 1995. — Vol. 1. — P. 262.
20. Ki shimoto T., Kikutani H, Von dem Borne A. E. G. K. et al. (eds.). Leucocyte Typing V. White cell differentiating antigens. — New York, London: Garland Publishing Inc., 1997. — P. 27
21. Alibaud L., Llobera R., Al Saati T. et al. A new monoclonal antibody reactive on paraffin
sections. J. Histochem. Cytochem. 2000; 48(12): 1609-16.
22. Salmeron A., Sanchez-Madrid F.,
Ursa M. A. et al. A conformational epitope expressed upon association of CD3-epsilon with either CD3-delta or CD3-gamma is the main target for recognition by anti-CD3 monoclonal antibodies. J. Immunol. 1991; 147(9): 3047-52.
23. Van de Griend R. J., Borst J., Tax W. J. et al. Functional reactivity of WT31 monoclonal antibody with T cell receptor-gamma expressing CD3+4-8-T cells. J. Immunol. 1988; 140(4): 1107-10.
24. Chung-Wu Lin, Ting-Yun Liu, Shee-Uan Chen et al. CD94 1A transcripts characterize lymphoblastic lymphoma/leukemia of immature natural killer cell origin with distink clinical features. Blood 2005; 106(10): 3567-74.
www.medprint.ru
163
