CC BY
79
УДК: 636.018: 636.4: 575.162
скрининг российской популяции крупного рогатого скота на наличие мутации в ЛРЛ¥1, ассоциированной с гАПЛОТиПОм фертильности Ыш*
о.в. РОМАНЕНКОВА, аспирант Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, руководитель лаборатории
О.В. КОСТЮНИНА, кандидат биологических наук, руководитель отдела
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, доктор биологических наук, академик РАН, директор (e-mail: n_zinovieva@mail.ru)
Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства имени академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация
Резюме. Рецессивные генетические дефекты, ассоциированные с эмбриональной смертностью, рассматривают сегодня в качестве одной из важных причин снижения воспроизводительной способности коров. Исследования проводили с целью разработки молекулярно-генетической тест-системы для скрининга нонсенс-мутации C^T в гене апоптотического протеаза-активирующего фактора 1, APAF1, приводящей к замене QX в позиции 579 аминокислотной последовательности, ассоциированной с гаплотипом фертильности голштинского скота HH1, и определения возможности ее использования для оценки распространения HH1 среди племенного голштинского скота в России. Методом прямого анализа последовательности ДНК в области исследуемой мутации создана серия референтных образцов с известными генотипами по APAF1 (n=80), в том числе 66 образцов с генотипом QQ (не носитель HH1) и 14 - с генотипом QX (скрытый носитель HH1). Предложенная тест-система предусматриваетПЦРамплификацию фрагмента APAF1, содержащего исследуемую мутацию, с последующим гидролизом образующихся фрагментов эндонуклеазой BstC8I. Для исключения неспецифического сайта рестрикции BstC8I, расположенного на расстоянии 10 bp «down-stream» от места мутации, в обратный праймер введена нуклеотидная замена. Анализ референтных образцов с использованием разработанной тест-системы показал совпадение результатов генотипи-рования. Исследование 593 быков-производителей и 270 коров выявило наличие 39 скрытых носителей HH1, в том числе 23 быков и 16 коров, что соответствует частотам встречаемости соответственно 3,9 и 5,9%. С целью контроля за распространением скрытых носителей HH1 в российской популяции голштинского и голштинизированного скота рекомендуем использование разработанной тест-системы диагностики полиморфизма APAF1. Ключевые слова: крупный рогатый скот, рецессивные генетические дефекты, гаплотипы фертильности, ДНК-диагностика. Для цитирования: Скрининг российской популяции крупного рогатого скота на наличие мутации в APAF1, ассоциированной с гаплотипом фертильности HH1 / О.В. Романенкова, Е.А. Гладырь, О.В. Костюнина, Н.А. Зиновьева //Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 2. С. 94-97.
Рецессивные генетические дефекты, ассоциированные с эмбриональной смертностью, рассматривают сегодня в качестве одной из важных причин снижения воспроизводительной способности коров [1, 2]. Большой прогресс в их идентификации был достигнут благодаря разработке и использованию нового подхода, получившего название «картирования гомозиготности» [3]. Он основан на генотипировании десятков или сотен тысяч SNP с помощью ДНК-чипов средней и высокой плотности, и последующей идентификации регионов хромосом, характеризующихся отсутствием одного
из гомозиготных генотипов, что позволяет рассматривать соответствующие регионы в качестве кандидатов локализации генов, ответственных за проявление летальных генетических дефектов. Такой метод позволяет идентифицировать летальные генетические дефекты в течение очень короткого периода времени и при наличии ограниченного числа случаев их проявляется. Для обозначения выявленных этим способом дефектов был предложен термин «гаплотипы фертильности».
С использованием картирования гомозиготности удалось идентифицировать рецессивные генетические дефекты, ассоциированные с эмбриональной смертностью, практически во всех основных породах молочного скота. Так, по крайней мере, пять таких гаплотипов (HH1-HH5) выявлено в голштинской породе [4, 5, 6], два (JH1, JH2) - в джерсейской [4, 7], два (BH1, BH2) - в бурой швицкой [4, 6], два (MH1, MH2) - в монбельярдской [5], один (AH1) - в айрширской породе [6] и четыре гаплотипа (FH1-FH4) - у немецкого симментальского скота [8].
Экономическая значимость летальных генетических дефектов обусловлена, прежде всего, влиянием на фертильность коров, чем собственно на гибель плода. Селекционное значение имеют те дефекты, носителями которых служат интенсивно используемые быки-производители, что приводит к постепенному росту частоты встречаемости скрытых носителей среди коров, а, следовательно, и к повышению вероятности спаривания двух скрытых носителей и, тем самым, появлению с 25%-ной вероятностью плодов, несущих гомозиготный по летальному аллелю генотип [9, 10].
С использованием данных о воспроизводительных качествах десятков тысяч животных североамериканской популяции голштинской породы, генотипированных с помощью Bovine SNP50 BeadChip (Illumina Inc., США), на хромосоме 5 в области 58-66 Mb (сборка генома UMD 3.0) был картирован гаплотип, ассоциированный с эмбриональной смертностью на различных сроках стельности, получивший название голштинского гаплотипа 1 - HH1 [4]. Его наличие и локализацию позже подтвердили Fritz с соавторами [5]. Было установлено, что причиной снижения фертильности, ассоциированной с HH1, служит нонсенс-мутация C^T в гене апоптотического протеаза-активирующего фактора 1, APAF1, приводящая к замене Q^X в позиции 579 аминокислотной последовательности [11]. Функциональный пептид APAF1 необходим для нормального эмбрионального развития. Мутация в APAF1 в случае спаривания быков - скрытых носителей с коровами - скрытыми носителями мутации приводит к спонтанным абортам и, как следствие, к снижению степени стельности. Было показано, что в североамериканской и французской популяциях голштинов снижение стельности составило соответственно 3,1 и 4,3-6,7% [4, 5].
Анализ происхождения выявленных скрытых носителей HH1 показал, что вероятный родоначальник мутаций -известный бык-производитель американской селекции
*Исследования выполнены при финансовой поддержке Минобрнауки России, уникальный идентификационный номер проекта RFMEFI60414X0062. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. Л.К. Эрнста.
USA1427381 Pawnee Farm Arlinda Chief (1962 г.р.). Распространению мутации в популяциях коров способствовали его потомки, активно использующиеся в системе искусственного осеменения голштинского и голштинизирован-ного скота: USA1773417Walkway Chief MARK (F1, 1978 г.р.), AN382748 A Townson LINDY (F3, 1984 г.р.), USA17378279 Ja-Bob JORDAN-RED (F4, 1997 г.р.), CAN 5279989 Shoremar MASON (F4, 1990 г.р.), USA 137332056 Glenn-Ann PALERMO (F6, 2006 г.р.). Частота встречаемости скрытых носителей HH1 среди быков-производителей в США составляет 1,9% [11]. Анализ родословных 560 быков-производителей, используемых в системе искусственного осеменения в России, показал, что в линиях предков 18-и из них присутствуют носители мутантного аллеля APAF1. Скрытые носители принадлежат к трем широко распространенным генеалогическим линиям - Рефлекшн Соверинга, Монтвик Чифтейна и Вис Бэк Айдиал.
Зачастую носители генетических дефектов - выдающиеся быки-производители, обладающие высоким генетическим потенциалом по продуктивным показателям, однако этот факт не следует рассматривать как причину для их незамедлительного исключения из воспроизводства. Основным инструментом в использовании быков - скрытых носителей должен стать подбор, исключающий их скрещивание с коровами и телками, потомками скрытых носителей аналогичного генетического дефекта, а также обязательная ДНК-диагностика коров быкопроизводящей группы и ремонтных бычков [1].
Исходя из изложенного, целью наших исследований стала разработка молекулярно-генетической тест-системы для диагностики причинной мутации в гене APAF1 и определение частоты встречаемости скрытых носителей HH1 среди быков-производителей, используемых в системе искусственного осеменения в России.
Условия, материалы и методы. На первом этапе была создана серия референтных образцов с известными генотипами по HH1 (n=80). С этой целью из проб ткани (ушной выщип, n=40) и спермы (n=40) коров и быков голштинской и голштинизированной черно-пестрой породы выделяли ДНК: по 20 образцов каждого из видов биоматериала методом экстракции перхлоратом [12], по 10 образцов - с использованием магнитных частиц (ООО «Изоген», Россия) и по 10 образцов - с использованием колонок Nexttec (Nexttec Biotechnologie GmbH, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Референтные генотипы генерировали посредством прямого определения последовательности в области мутации методом пиросеквенирования. С этой целью проводили амплификацию фрагмента длиной 172 п.о., содержащего мутацию, с использованием праймеров APAF1_1Pyro и APAF1_2Pyro_Bio (мечен биотином) с последующим отжигом зонда APAF1_Zond и пиросеквенированием. Для пиросеквенирования использовали базовую последовательность AGC/TCAGCT, где C/T - мутируемый нуклеотид, A, С - контрольные нуклеотиды.
Анализ последовательности APAF1 в области мутации показал, что последняя приводит к исключению сайта рестрикции эндонуклеазы BstC8I (последовательность узнавания GCNINGC), поэтому в качестве базового метода для моделирования тест-системы определения полиморфизма APAF1 был выбран метод полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длин рестрицированных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Принимая во внимание наличие второго неспецифического сайта рестрикции этой эндонуклеазы на расстоянии 10 п.о. «down stream» от места мутации,
дизаин тест-системы предусматривал локализацию обратного праИмера в области неспецифического сайта рестрикции BstC8I и введение в него нуклеотидной замены, приводящей к исключению указанного сайта в амплифицированном фрагменте. Подбор прямого прай-мера осуществляли с использованием программного обеспечения Primer3web, v. 3.0.0 [13], учитывая следующие условия: минимальная, желаемая и максимальная температура отжига - +60, +62 и +67°С, соответственно; минимальное, желаемое и максимальное соотношение GC - 40, 50 и 55%, соответственно; длина фрагмента - 50-300 п.о. Амплификацию проводили в конечном объеме 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1хПЦР буфер (16,6 мМ (NH4)2SO4; 67,7 мМ Трис - HCl, pH=8,8; 0,1 (v/v) Tween 20), 1,5 мМ MgCl2, 200мкМ дНТФ, 20 пмоль каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы (Диалат Лтд., Россия) и 1 мкл тестируемой ДНК (50-
Рис. 1. Результаты генотипирования животных по APAF1 с использованием метода пиросеквенирования: а - теоретически смоделированные гистограммы в зависимости от генотипа по APAF1\ б, в - результирующие пикограммы последовательности APAF1 в области исследуемой мутации (на оси Y обозначены условные единицы силы люминесценции).
APAF1-1
I S
Аллель Q Аллель X
BstC8I _i_
123 п.о.
APAF1-2 33 п.о. -
156 п.о.
а)
б)
рис. 2. Теоретическая модель тест-системы определения полиморфизма APAF1 на основе ПЦР-ПДРФ (а) и результаты генотипирования референтных образцов (б): а - APAF1-1, APAF1 -2 -праймеры, фланкирующие фрагмент; * - локализация исследуемой мутации; б - дорожки 1, 2 - генотип QQ (неноситель НН1); дорожки 3, 4 - генотип QX (скрытый носитель НН1); 5 - маркер (длины «ступеней» маркера в парах оснований (п.о.) указаны справа от фотографии).
500 нг/мкл). По завершении ПЦР к реакционной смеси добавляли 0,2 мкл эндонуклеазы BstC8I (10 МЕ/мкл, ООО «СибЭнзим», Россия) и 1,5 мкл буфера W+BSA (ООО «СибЭнзим», Россия) и инкубировали при 37°С в течение 10-12 ч. Продукты ПЦР-ПДРФ разделяли посредством электрофореза в 2,5% агарозном геле с добавлением бромида димидия и визуализировали под ультрафиолетовым светом. Для идентификации длин фрагментов использовали молекулярный маркер длины 100 п.н. (500х2, ООО «Биосан», Россия).
Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.
С целью оценки распространения скрытых носителей НН1 среди племенного поголовья голштинского и голштинизированного черно-пестрого скота выполнили генотипирование 593 быков-производителей и 270 коров.
результаты и обсуждение. Анализ теоретически смоделированных гистограмм и результатов прямого определения последовательности APAF1 в области мутации посредством пиросеквенирования показал (рис. 1), что генотипу QQ соответствует наличие в по-
зиции 3 целевой последовательности пика С, равного по высоте контрольному пику
0 в позиции 2, и отсутствие пика Т в позиции 4. Генотипу QX соответствует наличие двух равных по высоте пиков в позициях 3 и 4 целевой последовательности. Созданная серия референтных образцов (п=80) включала 14 образцов с генотипом QX (скрытый носитель НН1) и 66 образцов с генотипом QQ (не носитель). Генотип XX летален, и поэтому не может быть выявлен среди взрослых животных.
Результаты генотипиро-вания референтных образцов показали, что генотипу QQ по APAF1 соответствует наличие двух фрагментов длиной 123 и 33 п.о. (рис. 2б), а генотипу QX - трех фрагментов длиной 156,
1 23 и 33 п.о. При этом фрагмент длиной 33 п.о. идентифицируется вместе с остатками праймеров и
димеров праймеров и не может быть определяющим при идентификации генотипа животных.
Генотипирование референтных образцов с использованием разработанной тест-системы показало полное совпадение генотипов животных. Исследование 593 быков-производителей и 270 коров выявило наличие 39 скрытых носителей НН1, в том числе 23 быков и 16 коров, что соответствует частотам встречаемости 3,9 и 5,9%. Анализ родословных выявленных носителей мутации в APAF1, ассоциированной с НН1, показал, что они принадлежали (по отцу) к линиям Вис Бэк Айдиал 1013415, Реф-лекшн Соверинг 198998, Монтвик Чифтейн 95679 и Пабст Говернер, а распределение по линиям диагностировано на уровне 66,7, 25,0, 4,2 и 4,1%, соответственно.
выводы. Предложенная тест-система позволяет диагностировать мутацию в гене APAF1, ассоциированную с летальным гаплотипом фертильности голштинского скота НН1. Принимая во внимание относительно высокую частоту встречаемости НН1 как среди быков-производителей, так и среди племенных коров, можно рекомендовать разработанную тест-систему для использования при проведении генетической экспертизы племенного скота в РФ.
Литература.
1. Моногенные наследственные дефекты и их роль в воспроизводстве / Н.А. Зиновьева, Н.И. Стрекозов, Г.В. Ескин, И.С. Турбина, И.Н. Янчуков, А.Н. Ермилов //Животноводство России. 2015. № 6. С. 30-31.
2. Разработка тест-системы для диагностики гаплотипа фертильности крупного рогатого скота HH3, ассоциированного с ранней эмбриональной смертностью / О.В. Романенкова, Е.А. Гладырь, О.В. Костюнина, Н.А. Зиновьева //Достижения науки и техники АПК. 2015. № 11. С. 91-94.
3. Highly effective SNP-based association mapping and management of recessive defects in livestock/ C. Charlier, W. Coppieters, F. Rollin, D. Desmecht, JS. Agerholm et al. //Nat Genet. 2008. 40. Рр. 449-454.
4. Harmful recessive effects on fertility detected by absence of homozygous haplotypes / P.M. VanRaden, K.M. Olson, D.J. Null, J.L. Hutchison // J. Dairy Sci. 2011. 94. Рp. 6153-6161.
5. Detection of Haplotypes Associated with Prenatal Death in Dairy Cattle and Identification of Deleterious Mutations in GART, SHBG and SLC37A2/ S. Fritz, A. Capitan, A. Djari, S.C. Rodriguez, A. Barbat et al.// PLoS ONE, 2013, 8 (6): e65550. doi:10.1371/ journal.pone.0065550
6. Genomic evaluation of Ayrshire dairy cattle and new haplotypes affecting fertility and stillbirth in Holstein, Brown Swiss and Ayrshire breeds/ T.A. Cooper, G.R. Wiggans, P.M. VanRaden, J.L. Hutchison, J.B. Cole, D.J. Null// JAM, 2013, T206.
7. Identification of a nonsense mutation in CWC15 associated with decreased reproductive efficiency in Jersey cattle/ T.S. Sonstegard, J.B. Cole, P.M. VanRaden, C.P. Van Tassell, D.J. Null, S.G. Schroeder, D. Bickhart, M.C. McClure//PLoS. 2013. ONE8: e54872.
8. Homozygous haplotype deficiency reveals deleterious mutations compromising reproductive and rearing success in cattle / H. Pausch, H. Schwarzenbacher, J. Burgstaller, K. Flisikowski, C. Wurmser, S. Jansen, S. Jung, A. Schnieke, T. Wittek, R. Fries//BMC Genomics. 2015. 16:312. DOI: 10.1186/s12864-015-1483-7.
9. Молекулярные методы в диагностике заболеваний и наследственных дефектов сельскохозяйственных животных / Е.А. Гладырь, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст, О.В. Костюнина, А.С. Быкова, А.Д. Банникова, Е.П. Кудина, Г. Брем//Зоотехния. 2009. № 8. С. 26-27.
10. Роль ДНК-диагностики в контроле и элиминации рецессивных наследственных аномалий сельскохозяйственных животных/Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь, В.Р. Харзинова, О.В. Костюнина, М.В. Покровская, Н.Г. Друшляк, Я.А. Кабицкая// Достижения науки и техники АПК. 2012. № 11. С. 37-40.
11. Identification of a nonsense mutation in APAF1 that is causal for a decrease in reproductive efficiency in dairy cattle / H.A. Adams, T. Sonstegard, P.M. VanRaden, D.J. Null, C. Van Tassell, H. Lewin. //Proc. PlantAnim. GenomeXXConf., abstr. 2012. P0555.
12. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных / Н.А. Зиновьева, Е.А. Гладырь, Л.К. Эрнст, Г. Брем. Дубровицы: ВИЖ, 2002. 112 с.
13. Rosen S., Untergasser A., Skaletsky H. Программное обеспечение Primer3web, v. 3.0.0// Whitehead Institute for Biomedical Research, 2012. URL: http://biotools.umassmed.edu/primer3/primer3web_input.htm (дата обращения: 28.10.2015).
SCREENING OF CATTLE IN RuSSIA FOR THE PRESENCE OF MuTATION IN APAF1 GENE, WHICH IS ASSOCIATED WITH FERTILITY HAPLOTYPE HH1
O.V. Romanenkova, E.A. Gladyr, O.V. Kostjunina, N.A. Zinovieva
L.K. Ernst Institute for Animal Husbandry, Dubrovitzy, 60, Podolskiy r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation Summary. Recessive genetic disorders, which are associated with embryonic mortality, are seen as one of the significant causes of reduced cow fertility. The aim of this work was to develop a molecular genetic test system for screening of nonsense mutation with substitution of C by T in APAF1 gene coding for apoptotic protease activating factor 1 and causing substitution of Q by X in 579 position of amino acid sequence, which is associated with fertility haplotype HH1, and to apply it for screening of Russian Holstein cattle for HH1. Using direct DNA sequence analysis by parasequencing of the region of localization of causative mutation, we created the set of reference samples with known genotypes for APAF1 (n = 80), including 66 samples with QQ genotype (non-carrier of HH1) and 14 samples with QX genotype (HH1 carrier). The proposed test system is based on PCR amplification of APAF1 fragment containing mutation with the subsequent hydrolysis of PCR products by restriction enzyme BstC8I. To exclude the non-specific restriction site for BstC8I which is located 10 bp down-stream of mutation, we incorporated the nucleotide substitution in reverse primer. Analysis of reference samples using the developed test system showed full concordance of results of genotyping. Thirty-nine carriers of HH1 including 23 sires and 16 cows were identified among 593 tested sires and 270 cows, which corresponds to the carriers' frequencies of 3.9 and 5.9%, respectively. To control the spread of HH1 carriers among Russian breeding population of Holstein cattle and cattle carrying the Holstein blood we recommend the application of developed test system for diagnostics of APAF1 polymorphism. Key words: cattle, recessive genetic disorders, fertility haplotypes, DNA diagnostics.
Acknowledgments: The studies were performed under financial support of the Russian Ministry of Education and Science (unique project identification number RFMEFI60414X0062)
Author Details: O.V. Romanenkova, post-graduate student; E.A. Gladyr, Cand. Sc. (Biol.), head of laboratory; O.V. Kostjunina, Cand. Sc. (Biol.), head of division; N.A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), member of the RAS, director (e-mail: n_zinovieva@mail.ru). For citation: Romanenkova O.V, Gladyr E.A., Kostjunina O.V., Zinovieva N.A. Screening of Cattle in Russia for the Presence of Mutation in APAF1 Gene, which Is Associated with Fertility Haplotype HH1. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2016. V.30. No 2. Pp. 94-97 (In Russ.).
Требования к оформлению статей в журнале «достижения науки и техники АПк»
В статье должно быть кратко изложено состояние дел по изучаемой проблеме со ссылками на публикации (желательно не менее трех ссылок). Затем указаны цели, задачи, условия и методы исследований. Подробно представлены результаты экспериментов и их анализ. Сделаны выводы и даны предложения производству. В статье следует по возможности выделять следующие блоки: введение; цель и задачи исследований; условия, материалы и методы исследований; результаты исследований; выводы.
Вместе со статьей должны быть представлены перевод названия на английский язык; аннотация (200-250 слов) на русском и английском языках; ключевые слова на русском и английском языках; полные почтовые адреса всех учреждений, в которых работают авторы, на русском и английском языке; ученые степени и должности авторов на русском и английском языке код УДК; библиографический список.
В тексте ссылка на источник отмечается соответствующей цифрой в квадратных скобках в порядке цитирования. В списке литературы приводятся только те источники, на которые есть ссылка в тексте. Использование цитат без указания источника информации запрещается.
Материал для подачи в журнал набирается в текстовом редакторе Word версия не ниже 97 файл с расширением *.rtf.
Объем публикации 12-16 стр. машинописного текста набранного шрифтом Times New Roman, размер кегля 14 с полуторным интервалом. На 2,5 страницы текста допускается не более 1 рисунка или таблицы.
Статьи необходимо направлять с сопроводительным письмом с указанием сведений об авторах (фамилия, имя, отчество -полностью, ученая степень, место работы и занимаемая должность) на русском и английском языке, контактных телефонов и адреса электронной почты для обратной связи.
На публикацию представляемых материалов необходимо письменное разрешение и рекомендация руководства организации, на средства которой проводились исследования. Его вместе с одним экземпляром рукописи, подписанным авторами, и статьей в электронном виде нужно отправлять по адресу: 101000, г. Москва, Моспочтамт, а/я 166, ООО «Редакция журнала «Достижения науки и техники АПК». Для ускорения выхода в свет материалы в электронном виде можно направлять по адресу: agroapk@mail.ru.
Плата с аспирантов за публикацию рукописей не взимается.
Несоответствие статьи по одному из перечисленных пунктов может служить основанием для отказа в публикации.
Все рукописи, содержащие сведения о результатах научных исследований, рецензируются, по итогам рецензирования принимается решение о целесообразности опубликования материалов.
