CC BY
83
УДК 636.082.12
Ключевые слова: крупный рогатый скот, мутации, наследственные заболевания, ПЦР, скрининг
Key words: cattle, mutations, hereditary diseases, PCR, screening
Терлецкий В. П., Буралхиев Б. А., Усенбеков Е. С., Елубаева М., Тыщенко В. И., Бейшова И. С.
скрининг на носительство МУТАЦИЙ, детерминирующих развитие наследственных заболеваний
У ПЛЕМЕННОГО КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
screening for mutations that determine the development
of hereditary diseases in breeding ca ttle
'Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных» Адрес: 196625, Россия, Санкт-Петербург-Пушкин, пос. Тярлево, Московское шоссе, 55-А
1 Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding, Federal Agency for Scientific Organizations Address: 196625, Russia, Saint-Petersburg-Pushkin, Tyarlevo, Moskovskoe shosse, 55-A 2Казахский национальный аграрный университет Адрес: 050010, Республика Казахстан, г. Алматы, пр. Абая, 8 2Kazakh National Agrarian University. Address: 050010, Republic of Kazakhstan, Almaty, Abay pr., 8 3Костанайский государственный университет им. А. Байтурсынова Адрес: 110000, Республика Казахстан, г. Костанай, ул. А. Байтурсынова, 47 3A. Baitursynov Kostanay State University Address: 110000, Republic of Kazakhstan, Kostanay, A. Baitursynov str., 47
Терлецкий Валерий Павлович, д. б. н., проф., вед. науч. сотрудник1
Terletskiy Valery P., Doctor of Biological Sciences, Professor, Leading Research Scientist1 Буралхиев Батырхан Азимханович, к. с.-х. н., проф., декан факультета2 Buralkhiyev Batyrkhan A., PhD in Agricultural Sciences, Professor, Faculty Dean2 Усенбеков Есенгали Серикович, к. б. н., доцент, зав. кафедрой2 Ussenbekov Yessengali S., PhD in Biological Sciences, Associate Professor, Department Head2 Елубаева Макпал, соискатель2 / Yelubayeva Makpal, PhD Student2
Тыщенко Валентина Ивановна, к. б. н., ст. науч. сотрудник1 Tyshchenko Valentina I., PhD in Biological Sciences, Senior Scientist1 Бейшова Индира Салтановна3 / Beyshova Indira S.3
Аннотация. Широкий обмен генетическим материалом между странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний, а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. К таким наследственным заболеваниям у крупного рогатого скота относятся BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency) и CVM (Complex Vertebral Malformation). В статье представлен материал по диагностике генетических мутаций BLAD и CVM методом Real-time PCR у племенного скота Аулиекольской и Казахской белоголовой пород. Данная методика позволяет выявить вышеуказанные мутации на ранних сроках для своевременной выбраковки животных, что снижает эмбриональную смертность у маточного поголовья, сокращает количество скрытых абортов у коров и повышает индекс осеменения. Summary. The wide exchange of genetic material between two countries is accompanied by the spread of various infectious diseases, and diseases caused by rare mutations arising from outstanding representatives of commercial breeds. In some cases, there is a high rate ofproliferation of such mutations. Such hereditary diseases in cattle are BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency) and CVM (Complex Vertebral Malformation). The article presents data on the diagnosis of genetic mutations BLAD and CVM by PCR in Real-time format in pedigree cattle of domestic breeding of Auliekol and Kazakh White-head breed. This technique allows identifying the above mentioned mutations at early stages, and as a result culling animals with genetic diseases leads to decrease of embryonic mortality in breeding stock, reducing the number of hidden abortions in cows and increasing insemination index.
Введение
В настоящее время животноводство является ведущей отраслью сельскохозяйственного производства, поставщиком ценных
продуктов питания для человека и сырья для промышленности. Вместе с тем, у животных все чаще проявляются признаки генетической эрозии - накопление груза вредных
рецессивных мутаций. При этом снижаются воспроизводительная способность и плодовитость, жизнеспособность новорожденных и молодняка, продолжительность хозяйственного использования животных, что отрицательно влияет на рентабельность производства. В отдельных случаях наблюдается высокая скорость распространения таких мутаций. Огромный экономический ущерб обусловливает необходимость строгого генетического контроля импортируемого генетического материала, а также изучение возможных механизмов распространения мутаций [1]. Своевременная диагностика данных мутаций и выбраковка животных и племенного материала, а также требования генетического паспорта при закупке скота, эмбрионов, семени и т. п. позволяют элиминировать болезни и направленно сформировать группы для воспроизводства животных и выведения их новых типов. В большинстве развитых стран Европы и Америки созданы специальные программы по снижению частоты встречаемости аллеля BLAD-синдрома в популяциях скота черно-пестрой породы. Выдающихся быков и ремонтный молодняк проверяют на носительство му-тантного гена, а результаты регулярно публикуют в каталогах по племенным быкам.
В последнее время сложилась следующая ситуация: при использовании быков-производителей для «улучшения» популяций скота в их генофонд одновременно с интродукцией полезных генов были введены рецессивные мутации, обусловливающие дефицит адгезии лейкоцитов (BLAD-синдром) и комплексное уродство позвоночника (CVM-синдром) [4]. Прежде всего, необходимо тестировать животных Голштинской породы, т. к. именно в этой породе впервые были выявлены мутации BLAD и CVM. Тем не менее крайне важным представляется периодическое тестирование и местного скота, чтобы исключить появление этих мутаций в популяциях.
По сравнению с классической ПЦР, Realtime PCR, т. е. ПЦР в реальном времени, является более точной. Ее отличительным свойством является подсчет количества ам-плифицированных ДНК по мере их накопления после каждого амплификационного цик-
ла, а не в конце постановки. Впервые данный подход в диагностике BLAD и CVM у быков-производителей использовался китайскими учеными для выявления мутации в 2012 г. [5].
Таким образом, в настоящее время использование современных молекулярно-генетических методов оценки генотипа племенных животных позволяет не только оценить структуру популяции в целом [2, 3], но и снизить частоту встречаемости конкретных рецессивных мутаций [1, 4]. В связи с этим перед нами поставлены две задачи: разработать Real-Time PCR диагностику наследственных болезней BLAD и CVM и определить наличие (или отсутствие) этих летальных аллелей у крупного рогатого скота двух местных пород. Разработка и внедрение в производство Real-Time PCR в сочетании с аллель-специфической полимеразной цепной реакцией позволяет ускорить диагностику и оздоровить племенные хозяйства от носителей мутации. Цель исследования заключалась в использовании Real-Time PCR подхода к выявлению носителей мутаций BLAD и CVM на большом поголовье скота двух пород республики Казахстан.
Материалы и методы
Исследования проводились на 300 племенных животных ТОО «Жанабек» Коста-найской области (Казахская белоголовая порода) и на 300 животных ТОО «Каркын» Костанайской области (Аулиекольская порода) в «Биотехнологической научно-образовательной лаборатории» инновационного научно-образовательного центра при КГУ им. А. Байтурсынова. В качестве заведомо известных носителей мутаций BLAD и CVM использовали ДНК нескольких ранее тестированных обычной ПЦР быков Голштинской породы. В качестве материала для исследования была использована кровь, взятая в стерильные вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА.
Геномную ДНК выделяли из крови коров, используя набор Diatom TMPrep 200 (лаборатория Изоген, Москва) согласно инструкции фирмы изготовителя и Pure Link Genomic DNA Kits также согласно инструкции, прилагаемой к набору.
Для диагностики на носительство мутаций BLAD и CVM с помощью Real-Time PCR SNPs использовали набор TaqMan® MGB probes, FAM™ and VIC® dye-labeled, предоставленный компанией Applied Biosystems. В состав данного набора входят следующие компоненты: TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (2X), 40X Assay Mix. Для проведения Real-Time PCR диагностики заказаны у компании Applied Biosystems следующие компонеты: праймер для секвениро-вания Sequence Detection Primer 80.0 nmol, фермент Taq DNA Polymerase Recombinant 500 U, набор для генотипирования, TaqMan Genotyping Master Mix, Mini Pack, прайме-ры для Реал Тайм ПЦР диагностики CVM и BLAD (CUST TQMN SNP ASSAYS NONHUMAN).
Для выявления точечной мутации BLAD использовали аллель-специфические олиго-нуклеотиды, комплементарные для кодирующей части гена СД18 у крупного рогатого скота в положениях 383 A/G, для CVM - оли-гонуклеотиды, специфичные для точечной мутации в гене SLC35A3 в позиции 559 G/T.
В нашей работе для Real-Time PCR SNPs диагностики точечной мутации CVM использовали немеченые праймеры:
F-5'-AGCTGGCACAATTTGTAGGT-3' R-5'-CTCAAAGTAAACCCCAGCAAAGC-3' и меченые праймеры: F-VIC-5'-TCATGGCAGTTCTCA-3' R-FAM-5'-TCATGGCATTTCTCA-3'. Для Real-Time PCR SNPs диагностики точечной мутации BLAD использовали немеченые праймеры:
F-5'-CAGTTGCGTTCAATGTGACCTT-3' R-5'-GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTA-3' и меченые праймеры: F-VIC-5'-CCCCATCGACCTGTAC-3' R-FAM-5'-CCCATCGGCCTGTAC-3'. Немеченые праймеры для генотипирова-ния и меченые праймеры, включившие красители VIC и FAM, были синтезированы компанией Applied Biosystems (США). В первую очередь нормализовали концентрацию образцов ДНК путем разбавления ТЕ буфером до конечной концентрации 20-40 нг/мкл.
Real-Time PCR диагностику проводили с помощью амплификатора Real Time
Vdunc Dj'ir
» И. жо-с
Pre-Reao Stage Hold Suga PCRSnji Posl-flead Sta^E
95.0'C gtOX
io.oo ИО l'.iv» «Kl s ÛOID i
1.6'C/i
60.0'С 60.0-с
№30 ÖO 01 oo Ëi$m li'O. 00 M öo
ist»
Stcpl SI4>I Щ SKp! Stapl
iMi*Bii(CfclB; !*l Hj
Ö »¿taLoïecucpnan Q Dilfl Dafcctionuff 0 Айгнпс^ Sefliigi
Рис. 1. Графическое изображение проведения Realtime PCR диагностики точечных мутаций.
StepOnePlus, объемом реакционной смеси 50 мкл. Условия проведения ПЦР показаны на рисунке 1. В пробирку вносим компоненты реакционной смеси, имеющей состав: TaqMan Genotyping Master Mix, праймеры и бидистиллированная вода. Затем смесь перемешиваем на вортексе, переносим реакционную смесь в стрипы и добавляем ДНК с концентрацией 20-40 нг/мкл.
Результаты исследований
Аллельное распознавание может осуществляться путем анализа графиков амплификации в режиме реального времени. Зонды VIC типа будут комплементарны только «дикому типу» (нормальные животные, не носители) и формируют стандартный график амплификации, в то время как FAM зонды комплементарны только мутантным аллелям и формируют собой другой график амплификации. Таким образом, генотип может быть точно определен посредством сравнения графиков усиления флуоресцентного сигнала. На рисунке, начиная с 20-22 цикла по 32, наблюдается тенденция увеличения сигнала в результате накопления продуктов амплификации, у гетерозиготных животных обе кривые почти параллельные (рис. 2). У гомозиготных здоровых животных на дисплее появляются две кривые, но продукты
Рис. 2. Графическое изображение результатов Realtime PCR диагностики точечной мутации гена CD 18 (BLAD) (амплификация с FAM зондом, праймер для мутации, и с VIC зондом, праймер «дикого типа»).
амплификации с VIC и FAM накапливаются с разной интенсивностью. Так, более интенсивно накапливается продукт с VIC зондом (с wild-type аллели гена CD 18).
Результаты проведения реакции на выявление мутации CVM представлены на рисунке 3. Необходимо отметить, что использование обычного метода ПЦР-ПДРФ для детекции носителей генетического дефекта CVM является сложным и трудоемким способом, т. к. нет соответствующей рестрик-тазы для выявления точечной мутации. Поэтому нами был выбран метод Real-time PCR диагностики носителей генетического дефекта CVM. Метод позволяет в течение двух часов точно определить здоровых гомозиготных животных и гетерозиготных носителей мутации (рис. 3 и 4, соответственно). У гетерозиготных носителей мутации идет амплификация с двумя зондами VIC и FAM, соответственно образуются две кривые.
Обсуждение результатов
Несмотря на длительную историю тестирования племенных животных Голштинской породы на генетические дефекты BLAD и CVM, данные дефекты все еще имеют распространение в стадах. Голштинизация животных, широко используемая для повышения генетического потенциала продуктивности, может одновременно привести к передаче генетических дефектов. Накопление в популяциях гибридного скота этих мутаций будет
иметь тот же эффект, что и у чистопородных голштинских животных, а именно: раннюю эмбриональную смертность, аборты и гибель телят на ранних стадиях их развития (проявление только у гомозиготных носителей мутаций). В процессе разведения местных пород скота нельзя исключать случаи скрещивания с голштинскими животными. Поэтому тестирование на носительство мутаций является актуальной задачей генетических лабораторий. В наших исследованиях было показано, что Аулиекольская и Казахская белоголовая породы свободны от рецессивных мутаций BLAD и CVM. В этом
Рис. 3. Результаты Real-time PCR диагностики, гомозиготное здоровое животное по локусу CVM (идет амплификация только с VIC зондом для «дикого типа»).
Рис. 4. Графическое изображение результатов Realtime PCR диагностики точечной мутации в гене SLC35A3, гетерозиготный носитель CVM (идет амплификация с FAM зондом, праймер для мутации, и с VIC зондом, праймер «дикого типа»).
плане наши данные соответствуют представлениям о том, что эти мутации обнаружены пока только у представителей голштинской породы крупного рогатого скота.
Заключение
В результате проведения скрининга на но-сительство мутаций BLAD и СУМ местных пород крупного рогатого скота республики Казахстан (Аулиекольская и Казахская белоголовая), в отличие от Голштинской породы американской селекции, нами не было выявлено носителей по этим генетическим заболеваниям, что позволяет использовать животных в племенных целях без ограничений.
Список литературы
1. Жигачев, А. И. О накоплении груза мутаций в породах крупного рогатого скота при интенсивных технологиях воспроизводства и улучшения по целевым признакам [Текст] / А. И. Жигачев, Л. К. Эрнст,
A. С. Богачев // Сельскохозяйственная биология. -2008. - № 6. - C. 25-32.
2. Митрофанова, О. В. Исследование особенностей генетической гетерогенности пород и экспериментальных популяций кур на основе анализа полиморфизма ДНК [Текст] / О. В. Митрофанова, В. И. Ты-щенко, Н. В. Дементьева, В. П. Терлецкий, А. Ф. Яковлев // Доклады РАСХН. - 2007. - № 6. - С. 36-38.
3. Тыщенко, В. И. Оценка генетического разнообразия в породах и экспериментальных популяциях кур с помощью ДНК-фингерпринтинга [Текст] /
B. И. Тыщенко, О. В. Митрофанова, Н. В. Дементьева, В. П. Терлецкий, А. Ф. Яковлев // Сельскохозяйственная биология. - 2007. - № 4. - С. 29-33.
4. Яковлев, А. Ф. Определение носителей генетических дефектов среди быков-производителей [Текст] / А. Ф. Яковлев, В. П. Терлецкий, О. В. Митрофанова, Н. В. Дементьева // Молочное и мясное скотоводство. -2004. - Т. 6. - С. 31-32.
5. Zhang, Y. A novel method for rapid and reliable detection of complex vertebral malformation and bovine leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle [Текст] / Y. Zhang, X. Fan, D. Sun, Y. Wang, Y. Yu, Y. Xie., S. Zhang // J. Anim. Sci. Biotechnol. - 2012. - Vol. 3. - N 1. - P. 24.
■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■
КАК ОФОРМИТЬ ПОДПИСКУ НА ЖУРНАЛ?
А. Через подписной каталог
Индекс в каталоге «Газеты. Журналы» Агентства «Роспечать» - 33184
Б. Через редакцию журнала
Банковские реквизиты для оплаты подписки по безналичному расчету для юридических лиц:
ЧОУДПО «Институт Ветеринарной Биологии» ИНН 7802196720 КПП 781301001 Р/с 40703810400000000022 в АО «Горбанк», г. Санкт-Петербург К/с 30101810200000000814 БИК 044030814
В поле «Назначение платежа» указать: «Предоплата за подписку на журнал «Актуальные вопросы ветеринарной биологии» на 2017 г. согласно инф. письму б/н от 20.09.16 г. НДС не облагается. Адрес доставки: ...»
Стоимость редакционной подписки на 2017 год: 1600 рублей.
= Адрес редакции: Санкт-Петербург, ул. Ораниенбаумская, 3-Б. =
| Т./ф. (812) 232-55-92, т. 927-55-92. |
| E-mail: virclin@mail.ru; www.invetbio.spb.ru |
^/IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIM
