CC BY
87
УДК 577.151.45 + 571.27
Скрининг бактериолитической активности интерлейкина-2 человека и лизоцима куриного яйца на клетках различных микроорганизмов
П. А. Левашов1*, Е. Д. Овчинникова1, О. А. Морозова2, Д. А. Матолыгина1, Е. Э. Осипова1, Т. А. Чердынцева3, С. С. Савин1, Г. С. Захарова1,4, A. A. Алексеева1,4, Н. Г. Белогурова1, С. А. Смирнов1, В. И. Тишков1,4*, А. В. Левашов1
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3 2Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России, межклиническая бактериологическая лаборатория, 119881, Москва, Б. Пироговская, 2,стр.4
3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет,
кафедра микробиологии, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12
4Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр
«Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33
*Е-mail: levashov@yahoo.com, vitishkov@gmail.com
Поступила в редакцию 01.12.2015
Принята к печати 22.01.2016
РЕФЕРАТ Изучена бактериолитическая активность интерлейкина-2 и лизоцима куриного яйца в отношении 34 видов микроорганизмов. Установлено, что в присутствии интерлейкина-2 лизису подвергаются шесть видов из трех семейств: Е^егоЬа^еНасеае, ВасШасеае и Lactobacillaceae. Выявлено также 12 видов микроорганизмов, подверженных лизису в присутствии лизоцима, и 16 видов, лизируемых додецилсульфатом натрия (ДСН). Исследована рН-зависимость бактериолитической активности интерлейкина-2 и лизоцима в отношении разных клеток-субстратов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА бактериолитическая активность, интерлейкин-2, лизоцим куриного яйца. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДСН - додецилсульфат натрия; КОЕ - число колониеобразующих единиц.
ВВЕДЕНИЕ
Интерлейкин-2 (IL-2) - один из важнейших регуляторов жизнедеятельности организма. Этот лимфокин участвует в регуляции таких процессов, как пролиферация и дифференцировка Т-лимфоцитов; увеличение цитолитической активности NK-клеток; пролиферация В-лимфоцитов, секреция иммуноглобулинов и др. Недавно нами было показано, что IL-2 человека способен проявлять бактериолитическую активность [1-3]. В результате сравнительного тестирования на нескольких штаммах бактерий установлено, что IL-2 имеет более узкую субстратную специфичность, чем лизоцим куриного яйца. IL-2, как и лизоцим, способен лизировать клетки Escherichia coli и Lactobacillus plantarum, но, в отличие от лизоцима, не действует на клетки Micrococcus luteus и Bacillus subtilis [1-3]. Обнаружение активности интерлей-кина-2 в отношении E. coli и L. plantarum оказалось
неожиданным. Механизм бактериолитического действия интерлейкина-2 на сегодняшний день не известен, для его выяснения необходимо изучить влияние интерлейкина-2 на другие виды бактерий. Поскольку интерлейкин-2 играет важную роль в развитии иммунного ответа, а также является лекарственным средством, то, в первую очередь, актуально проверить его действие на тех бактериях, которые часто контактируют с человеком, включая компоненты симбиоти-ческой микрофлоры. Основной задачей исследования стал скрининг бактериолитической активности интер-лейкина-2 на микроорганизмах, которые встречаются на коже и слизистых человека, могут обнаруживаться в биоматериале раны. Для сравнения было решено на тех же микроорганизмах проверить действие ли-зоцима, а также изучить лизис клеток в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), который входит в состав медицинских препаратов интерлейкина-2.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использованы следующие материалы: ронколейкин (раствор 0.25 мг/мл очищенного ин-терлейкина-2 для внутривенного и подкожного введения, «Биотех», Россия); MES, трис ("extra pure", Amresco, США); лиофилизированный лизоцим куриного яйца (95% чистоты, Sigma Aldrich, США); NaOH (98% чистоты, AppliChem Panreac, Германия); CH3COOH («ч. д. а.», «Реахим», Россия); HCl (Germed, Германия); 10% водный раствор ДСН (BioRad, США).
Выделенные из клинического материала (моча, мокрота, кал, раневое отделяемое и т.д.) штаммы микроорганизмов были любезно предоставлены Первым МГМУ им. И.М. Сеченова. Видовую принадлежность микроорганизмов определяли методом прямого белкового профилирования с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии (серия FLEX, Bruker Daltonic GmbH, Германия). В качестве среды для культивирования использовали твердую агаризованную среду - 5% кровяной колумбийский агар (Oxoid, Великобритания) pH 7.3. Культуру клеток выращивали в течение 24 ч при 35°С в атмосфере 5% СО2.
В работе также были использованы штаммы из музейной коллекции кафедры микробиологии МГУ им М.В. Ломоносова (обозначены как КМ МГУ). L. acidophilus КМ МГУ 146, L. casei КМ МГУ 153 и Lactococcus lactis КМ МГУ 165 выращивали на жидкой среде MRS при 37°C в анаэробных условиях [4]. Clostridium butiricum КМ МГУ 19 выращивали на среде следующего состава: глюкоза 10 г/л; пептон 10 г/л; К2НРО4 1 г/л; СаСО3 5 г/л; вода водопроводная, при 37°C в анаэробных условиях [5]. Alcaligenes faecalis КМ МГУ 82, B. megaterium КМ МГУ 17, B. mycoides КМ МГУ 31, B. cereus КМ МГУ 9, Pseudomonas aeruginosa КМ МГУ 47, P. fluorescens КМ МГУ 71, Serratia marcescens КМ МГУ 208 и Staphylococcus aureus КМ МГУ 144 выращивали на мясо-пептонном бульоне при 30°C в аэробных условиях [6].
В работе использовали препарат лиофилизиро-ванных бифидобактерий Bifidobacterium bifidum («Микроген», Россия), из которого перед началом работы готовили суспензию (10 мл воды на одну ампулу). Предполагалось, что лиофилизированный препарат бактерий в эксперименте по измерению скорости лизиса мало отличается от свежевыращенных клеток по аналогии с препаратом лиофилизированных клеток L. plantarum [7].
Препарат клеток Thermus aquaticus любезно предоставлен А.А. Белогуровым. Клетки выращивали по стандартной для данной культуры методике при температуре 75°С в аэробных условиях [8].
Перед началом измерений все препараты бактериальных клеток центрифугировали при 3500 об/мин
в течение 4 мин на центрифуге Minispin (Eppendorf, Германия), затем ресуспендировали в буферном растворе, используемом для измерения активности. Раствор лизоцима куриного яйца готовили непосредственно перед экспериментом, используя тот же буферный раствор, что и для измерения активности. В качестве стандартного раствора интерлейкина-2 использовали готовый препарат без дополнительной обработки, ампулу вскрывали непосредственно перед экспериментом. Поскольку в исходном растворе интерлейкина-2 присутствует ДСН (2.5 мг/мл), проведены эксперименты по влиянию данного компонента на фоновый лизис клеток. Для определения изменений поглощения при лизисе клеток использовали двухлучевые спектрофотометры UV-1800 или UV-1601PC (Shimadzu, Япония). Измерения проводили в кюветах с длиной оптического пути 1 см объемом 0.5 мл.
Бактериолитическую активность определяли турбидиметрически по скорости падения поглощения суспензии клеток [7, 9] при длине волны 650 нм и температуре 37°С. В качестве начальной скорости лизиса клеток использовали изменение поглощения (А650) в интервале времени от 5 до 20-30 с от начала реакции. Если в условиях эксперимента наблюдался фоновый самопроизвольный лизис клеток в отсутствие бактериолитических факторов, то его величину вычитали из значения активности в присутствии бактериолитических добавок. В случае лизиса клеток в присутствии ДСН учитывали также поправку на величину скорости лизиса в присутствии интер-лейкина-2 соответственно содержанию ДСН в пробе. При определении скорости лизиса использовали суспензию клеток с начальным поглощением А650 = 0.4. Активность измеряли в буферном растворе 10 мМ MES-трис-СНдСООН при разных значениях pH. В качестве условного показателя активности приведены значения начального изменения поглощения -dA/dt (ед. погл./мин), которые (с соответствующими для различных клеток коэффициентами) пропорциональны скоростям изменения числа живых клеток или колониеобразующих единиц (-dKOE/dt), соответственно пропорциональны изменениям степени лизиса d©/dt (© = 0, если все клетки целы, и © = 1 в случае 100% разрушения клеток препарата) [7, 9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице приведены данные о воздействии ин-терлейкина-2, лизоцима и ДСН на клетки 37 штаммов 34 различных видов бактерий. Как видим, 12 видов бактерий подвержены лизису в присутствии лизоцима, 16 лизируются в присутствии ДСН и только шесть видов чувствительны к интерлей-кину-2: L. acidophilus, B. megaterium (подтверж-
Лизис бактерий в присутствии интерлейкина-2, лизоцима и додецилсульфата натрия (ДСН)
№ Микроорганизм Скорость лизиса в присутствии добавки
лизоцим интерлейкин-2 ДСН
1 Acinetobacter baumannii 0 0 0
2 Alcaligenes faecalis КМ МГУ 82 3.2/2.0/6.4 0 1.1/100/8.0
3 Bacillus megaterium 5.2/0.8/8.7 6.1/15/8.7 0
4 Bacillus megaterium КМ МГУ 17 2.2/2.0/8.5 2.6/30/8.5 0
5 Bacillus mycoides КМ МГУ 31 4.5/4.0/8.0 3.6/10/8.0 0.7/100/8.0
6 Bacillus cereus КМ МГУ 9 4.5/4.0/8.5 0.9/30/8.5 0
7 Bifidobacterium bifidum 0 0 0
8 dtrobacter braakii 0 0 0
9 Clostridium butiricum КМ МГУ 19 0 0 2.5/400/8.0
10 Corynebacterium amycolatum 0 0 0
11 Enterobacter aerogenes 0 7.8/2.0/6.4 0
12 Enterobacter cloacae 0 0 0.9/200/8.0
13 Enterobacter faecalis 0 0 1.9/50/8.0
14 Klebsiella pneumoniae 0 0 0
15 Lactobacillus acidophilus КМ МГУ 146 3.2/0.8/7.0 2.9/5.0/7.0 2.4/50/8.0
16 Lactobacillus casei КМ МГУ 153 0 0 0
17 Lactococcus lactis КМ МГУ 165 0 0 0
18 Morganella morganii 0 0 2.0/40/8.0
19 Neisseria perflava 0 0 0
20 Proteus mirabilis 0 0 2.9/50/8.0
21 Proteus vulgaris 3.6/2.0/8.7 0 2.2/60/8.0
22 Pseudomonas aeruginosa 4.2/0.2/8.7 0 5.8/50/8.0
23 Pseudomonas aeruginosa КМ МГУ 47 7.3/0.4/7.7 0 1.1/100/8.0
24 Pseudomonas fluorescens КМ МГУ 71 3.5/0.5/8.4 0 0
25 P. putida 0 0 2.5/200/8.0
26 Rothia mucilaginosa 0 0 0
27 Serratia marcescens КМ МГУ 208 3.7/0.2/8.4 4.7/30/8.0 0
28 Staphylococcus aureus 0 0 6.2/50/8.0
29 Staphylococcus aureus КМ МГУ 144 1.6/1.0/7.7 0 0
30 Staphylococcus capitis 0 0 0
31 Staphylococcus epidermidis 0 0 0
32 Staphylococcus haemolyticus 1.4/0.4/8.7 0 4.9/20/8.0
33 Staphylococcus lugdunensis 0 0 0
34 Stenotrophomonas maltophilia 0 0 3.3/150/8.0
35 Streptococcus agalactiae 4.6/5.0/7.0 0 4.1/50/8.0
36 Streptococcus pyogenes 0 0 0
37 Thermus aquaticus 0 0 3.6/125/8.
Примечание. Значения скоростей лизиса даны в виде Х/У/2, где Х - скорость лизиса, ед. погл., 10-3 х мин-1, У - концентрация добавки, мкг х мл-1 и 2 - рН среды, при котором проводили измерения. Для лизоцима и интер-лейкина-2 даны оптимальные значения рН, для ДСН все значения скорости получены при рН 8.0. Нули означают, что вплоть до концентраций лизоцима 5 мкг/мл, интерлейкина-2 - 50 мкг/мл и для ДСН - 0.5 мг/мл не наблюдалось изменений поглощения в течение 3 мин.
1 5
3
ч
ш
< ■О
7.5 pH
Рис. 1. Зависимость скорости лизиса клеток от pH в присутствии лизоцима. 1 - Streptococcus agalactiae, лизоцим 5.0 мкг/мл. 2 - Lactobacillus acidophilus КМ МГУ 146, лизоцим 0.8 мкг/мл. 3 - Serratia mar-cescens КМ МГУ 208, лизоцим 0.2 мкг/мл. 4 - Bacillus megaterium, лизоцим 0.8 мкг/мл. 5 - Pseudomonas aeruginosa, лизоцим 0.2 мкг/мл. 6 - Proteus vulgaris, лизоцим 2.0 мкг/мл. 7 - Staphylococcus haemolyticus, лизоцим 0.4 мкг/мл
х
3
о
ч
ф
< ■О
8 -
6 1
4 -
7.0 7.5 pH
Рис. 2. Зависимость скорости лизиса клеток от pH в присутствии интерлейкина-2. 1 - Enterobacter aerogenes, интерлейкин-2 2.0 мкг/мл. 2 - Bacillus megaterium, интерлейкин-2 15 мкг/мл. 3 - Serratia marcescens КМ МГУ 208, интерлейкин-2 30 мкг/мл. 4 - Lactobacillus acidophilus КМ МГУ 146, интерлей-кин-2 5.0 мкг/мл
дено для двух штаммов данного вида), B. mycoides, B. cereus, S. marcescens и Enterobacter aerogenes. При этом на клетки L. acidophilus и B. mycoides действуют и лизоцим, и интерлейкин-2, и ДСН. На клетки B. megaterium, B. cereus и S. marcescens действуют лизоцим и интерлейкин-2, но не ДСН. На Ent. aerogenes действует только интерлейкин-2. В целом, спектры микроорганизмов, на которые действует ли-зоцим и интерлейкин-2, не совпадают, хоть и имеют пересечение. Вероятно, механизм действия лизоцима и интерлейкина-2 в значительной степени различается.
На рис. 1 и 2 представлены pH-зависимости скорости лизиса клеток лизоцимом и интерлейки-ном-2. Видно, что значения pH-оптимума активности интерлейкина-2 и лизоцима в отношении клеток B. megaterium совпадают и составляют 8.7. В случае клеток L. acidophilus pH-оптимумы активности лизоцима и интерлейкина-2 также сходны (6.5-7.0 и 6.7-7.3). Оптимумы активности лизоцима и интерлейкина-2 близки и в случае B. mycoides, и B. cereus (на графиках зависимости не представлены из-за сходства с зависимостями для B. megaterium). Явление схожего смещения оптимумов активности лизоцима и интерлейкина-2, зависящего от выбора субстрата - вида бактерий, наблюдали также в случае клеток E. coli и L. plantarum [3].
На рис. 3 представлена pH-зависимость скорости лизиса клеток в присутствии ДСН. На графике приведены данные только для пяти из 16 микроорганизмов, чувствительных к ДСН. У остальных 11 микроорганизмов зависимости скорости лизиса от pH в присутствии ДСН имеют аналогичный вид. Как видим, ДСН лучше действует на клетки в щелочной среде, что присуще самым различным микроорганизмам. Действие ДСН обнаруживается при pH выше 7.3-8.0. Возможно, что подобный характер pH-зависимости каким-то образом связан c диапазоном значений pK фосфатных групп фосфолипидов клеточных мембран. Вполне вероятно также, что на характер pH-зависимости могут влиять и компоненты буферной смеси, например, трис. Выяснение точной молекулярной причины подобной зависимости действия ДСН от pH выходит за рамки нашей работы.
Интерлейкин-2 действует на отдельных представителей грамотрицательного семейства Enterobacteriaceae, в том числе на Ent. aerogenes и S. marcescens, что показано в нашей работе, а также, как установлено ранее, на E. coli [1-3]. Интерлейкин-2 активен в отношении таких грам-положительных представителей семейства Lactobacillaceae, как L. acidophilus (данная работа) и L. plantarum [3]. Обнаружено также, что интер-лейкин-2 действует на B. megaterium, B. mycoides
4
3
2
0
2
0
pH
Рис. 3. Зависимость скорости лизиса клеток от pH в присутствии ДСН. 1 - Morganella morganii, ДСН 40 мкг/мл. 2 - Proteus vulgaris, ДСН 60 мкг/мл. 3 - Lactobacillus acidophilus КМ МГУ 146, ДСН 50 мкг/мл. 4 - Pseudomonas putida, ДСН 0.2 мг/мл. 5 - Stenotrophomonas maltophilia ДСН 0.15 мг/мл
и B. cereus - грамположительные спорообразую-щие палочки семейства Bacillaceae, которые отличаются по строению и составу клеточной стенки как от бактерий семейства Enterobacteriaceae, так и от Lactobacillaceae. Можно предположить, что в клеточной стенке E. coli, Ent. aerogenes, S. marcescens, L. plantarum, L. acidophilus, B. mycoides, B. megaterium и B. cereus есть некие схожие структуры. Действительно, в клеточной стенке B. megaterium, B. cereus и L. plantarum обнаружены структуры, содержащие диаминопимелиновую кислоту [10-13], что не характерно для многих грамположительных микроорганизмов, но достаточно распространено у представителей семейства Enterobacteriaceae [13, 14]. Считается, что клеточная стенка L. acidophilus не содержит значительных количеств диаминопимелиновой кислоты [15]. Однако по аналогии с L. plantarum мы можем предположить, что диаминопимелиновая кислота может входить в состав клеточной стенки отдельных штаммов L. acidophilus. Нами не обнаружены публикации, в которых приведены точные данные о присутствии и количестве диаминопимелиновой кислоты у B. mycoides, однако мы можем предполагать, что строение клеточной стенки у этой бактерии
и у В. megaterium и В. сетеш может быть частично схожим. По-видимому, сходную восприимчивость к интерлейкину-2 у столь неродственных микроорганизмов можно объяснить наличием общих структур, содержащих диаминопимелиновую кислоту. Ранее мы показали, что интерлейкин-2 не действует на клетки В. suЪtilis [1, 2], которые также входят в семейство ВасШасеае. Однако опубликованы сведения, согласно которым у В. suЪtilis, в отличие от многих других представителей этого семейства, диаминопимелиновая кислота находится в амиди-рованной форме [16]. Таким образом, устойчивость В. suЪtilis к действию интерлейкина-2 фактически подтверждает нашу гипотезу. В целом, на данном этапе исследования преждевременно делать точные выводы о том, какие типы микроорганизмов чувствительны к интерлейкину-2. Кроме того, чувствительность к бактериолитическим агентам может изменяться в зависимости от наличия и состава капсулы у бактерии, а также различаться даже у разных штаммов одного и того же вида [17]. Следует отметить, что продолжаются дискуссии относительно механизмов действия даже давно изучаемого лизоцима на различные микроорганизмы. Есть основания полагать, что лизоцим может действовать на бактериальные клетки не только как фермент, но и как антибактериальный катион-ный белок [18]. В результате нашей работы установлен некий спектр микроорганизмов, чувствительных к интерлейкину-2, что поможет дальнейшему изучению молекулярных механизмов восприимчивости или невосприимчивости микроорганизмов к данному бактериолитическому фактору. •
Авторы выражают благодарность сотрудникам Межклинической бактериологической лаборатории Первого МГМУ им. И.М. Сеченова за предоставленную возможность культивирования микроорганизмов и определения их видовой принадлежности. Авторы также выражают благодарность сотрудникам кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова за предоставленную возможность работы с микроорганизмами музейной коллекции.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 15-14-00012).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Левашов П.А., Седов С.А., Белогурова Н.Г., Шиповсков С.В., Левашов А.В. // Биохимия. 2012. Т. 77. № 11. С. 1567-1570.
2. Седов С.А., Белогурова Н.Г., Шиповсков С.В., Семёнова М.В., Гитинов М.М., Левашов А.В., Левашов П.А. // Биоорган. химия. 2012. Т. 38. № 3. C. 315-323.
3. Левашов П.А., Матолыгина Д.А., Осипова Е.Э., Савин С.С., Захарова Г.С., Гасанова Д.А., Белогурова Н.Г., Овчинникова Е.Д., Смирнов С.А., Тишков В.И., Левашов А.В. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2015. Т. 56. № 6. C. 359-364.
4. de Man J.D., Rogosa M., Sharpe M.E. // J. Appl. Bacteriol. 1960. V. 23. P. 130-135.
5. Галынкин В.А., Заикина Н.А., Кочеровец В.И., Курба-нова И.З. Питательные среды для микробиологического контроля качества лекарственных средств и пищевых продуктов. СПб.: Проспект науки, 2006. 304 с.
6. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. М.: Академия, 2005. 608 с.
7. Матолыгина Д.А., Осипова Е.Э., Смирнов С.А., Белогурова Н.Г., Еремеев Н.Л., Тишков В.И., Левашов А.В., Левашов П.А. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2015. Т. 56. № 6. С. 365-371.
8. Brock T.D., Edwards M.R. // J. Bacteriol. 1970. V. 104. P. 509-517.
9. Levashov P.A., Sedov S.A., Shipovskov S., Belogurova N.G., Levashov A.V. // Anal. Chem. 2010. V. 82. P. 2161-2163.
10. Bricas E., Ghuysen J.-M., Dezelee P. // Biochemistry. 1967. V. 6. № 8. P. 2598-2607.
11. Okada S., Suzuki Y., Kozaki M. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1979. V. 25. P. 215-221.
12. van Heijenoort J., Elbaz L., Dezelee P., Petit J.F., Bricas E., Ghuysen J.M. // Biochemistry. 1969. V. 8. № 1. P. 207-213.
13. Day A., White P.J. // Biochem J. 1977. V. 161. № 3. P. 677-685.
14. Berges D.A., DeWolf W.E. Jr., Dunn G.L., Grappel S.F., Newman D.J., Taggart J.J., Gilvarg C. // J. Med. Chem. 1986. V. 29. № 1. P. 89-95.
15. Ikawa M., Snell E.E. // J. Biol. Chem. 1960. V. 235. P. 13761382.
16. Warth A.D., Strominger J.L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. V. 64. № 2. P. 528-535.
17. Campos M.A., Vargas M.A., Regueiro V., Llompart C.M., Albert! S., Bengoechea J.A. // Infection Immunity. 2004. V. 72. № 12. P. 7107-7114.
18. Ginsburg A., Koren E., Feuerstein O. // SOJ Microbiol. Infect. Dis. 2015. V. 3. № 1. P. 1-8.
