Синусоидальные клетки печени и клетки костного мозга как компоненты единой функциональной системы регуляции восстановительного морфогенеза в здоровой и поврежденной печени Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

ДИСКУССИОННЫЕ И ОБЩЕТЕОРЕТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Синусоидальные клетки печени и клетки костного мозга как компоненты единой функциональной системы регуляции восстановительного морфогенеза в здоровой и поврежденной печени

Н.А. Онищенко 1, А.В. Люндуп12, Р.В. Деев 2, М.Ю. Шагидулин 1, М.Е. Крашенинников 1

1 ФГУ «ФНЦ Трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития, Москва

2 Институт стволовых клеток человека, Москва

Sinusoidal liver cells and bone marrow cells as components of the common functional system for regulation of recovery morphogenesis of healthy and damaged liver

N.A. Onischenko 1, A.V. Lyundup 1-2, R.V. Deev2, M.Y. Shagidulin 1, M.E. Krasheninnikov1

1 V.I. Shumakov Federal Research Center for Transplantology and Artificial Organs, the Ministry of Public Health and Social Development, Moscow

2 Human Stem Cells Institute, Moscow

В обзоре представлены современные сведения о кооперативном взаимодействии синусоидальных клеток печени и клеток костного мозга при осуществлении процессов физиологической, репаративной и патологической (фибро-зирующей) регенерации печени. Показано, что стволовые/ прогениторные клетки костного мозга (гемопоэтические и мультипатентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК)) восполняют регуляционную роль стволовых клеток печени (прежде всего звездчатых клеток — клеток Ито), снижают выраженность процессов воспаления и фибрози-рования и тем самым модулируют процессы восстановительной регенерации поврежденной печени.

Полагают, что применение ММСК костного мозга является наиболее перспективной стратегией. Однако для окончательного суждения о регенераторных возможностях аутологичных и аллогенных клеток костного мозга при печеночной недостаточности необходимо проводить широкомасштабные двойные слепые клинические исследования.

Ключевые слова: синусоидальные клетки печени, клетки Ито, клетки костного мозга, печеночная недостаточность.

По современным представлениям репаративная регенерация поврежденных органов взрослого организма осуществляется при участии региональных малодифференцированных или стволовых/прогени-торных клеток. Однако из-за трудностей получения, идентификации и использования таких клеток в регенерационной медицине для индукции восстановительных процессов в разных органах стали использовать общий источник стволовых/прогениторных клеток — аутогенный костный мозг или аллогенную пуповинную кровь. Полагают, что положительный эффект от применения этих клеток связан с тем, что некоторые стволовые клетки из этих источников способны при доставке в орган приобретать фенотип паренхиматозных

e-mail: gma.tulkas@gmail.com

This review presents current information about the cooperative interaction of sinusoidal liver cells and bone marro w cells at the processes of physiological, reparative and fibrosing liver regeneration. It is shown that the stem/progenitor cells of bone marrow (hematopoietic and mesenchymal stromal cells) supplement regulatory role of liver stem cells (first of all stellate cells — Ito cells), reduce the seriousness of inflammation and fibrosis, and thereby normalize the recovery process of damaged liver regeneration. It is believed that the use of mesenchymal stromal cells of bone marrow is the most future forward strategy. However, to form a final opinion on the regenerative capacity of autologous and allogeneic bone marrow cells at hepatic failure large-scale double-blind clinical trials should be carried out.

Key words: sinusoidal liver cells, Ito cells, bone marrow cells, liver failure.

клеток-предшественниц. Однако регенерационная способность клеток костного мозга и пуповинной крови не ограничивается их мультипотентной пластичностью [1]. Эти клетки, будучи активными структурными элементами иммунной системы, способны активировать ее морфогенетическую функцию, обеспечивая через конкретные паракринные механизмы регенерацию не только и не столько паренхиматозных, сколько непаренхиматозных клеток органа, имеющих как и стволовые/прогениторные клетки костного мозга мезенхимальное происхождение [2].

Настоящий обзор рассматривает эффективность процесса регенерации поврежденной печени взрослого организма с позиций полноты восстановления

в этом процессе взаимодействия синусоидальных клеток печени и клеток костного мозга, имеющих общность филогенетического происхождения и кооперативно действующих при реализации физиологической и репаративной регенерации.

Роль синусоидальных клеток печени и клеток костного мозга в осуществлении физиологической, репаративной и патологической (фиброзирующей) регенерации печени

Известно, что в регенерации нормальной и патологически измененной печени принимают участие все ее клеточные элементы: гепатоциты (более 60% клеточной популяции), синусоидальные клетки (СК) (около 35% всех клеток), а также клетки соединительной ткани (фибробласты, тучные клетки) и внеклеточный матрикс (ВКМ), на долю которых приходится остальная часть массы этого органа 1—5% [3].

СК представлены четырьмя основными разновидностями клеток, имеющими мезенхимальное происхождение: купферовскими клетками, или фиксированными макрофагами, которые составляют 20—25% от всей популяции СК; эндотелиоцитами, составляющими 50—60% и выстилающими печеночные синусоиды; перисинусоидальными клетками — клетками Ито (звездчатые клетки), которые являются предшественниками миофибробластов, располагаются в пространстве Диссе (на их долю приходится 5—15% [4] всех СК). К эндотелию фиксированы ямочные клетки (Р^-сеНэ) или трансформированные лимфоциты-киллеры (5%), непосредственно контактирующие с гепатоцитами. В составе пула СК

обнаруживается также до 20—25% лейкоцитов [5]. Все указанные типы клеток постоянно взаимодействуют между собой и с гепатоцитами при посредничестве ВКМ, составляя единую структурнофункциональную систему (рис. 1), которая обеспечивает гомеостаз печеночной дольки и подчинена выполнению сложных специализированных функций гепатоцитов [6].

В свою очередь адекватность функции печени и ее клеток в организме регулируется с помощью клеток других функциональных систем и, прежде всего, с участием мигрирующих клеток системы крови и иммунной системы [7]. Мигрирующие клетки иммунной системы, будучи производными мезенхимы, как и СК путем продукции регуляторных пептидов — цитокинов (интерлейкины, хемокины, ростовые факторы и др.), а также путем контактного взаимодействия способны регулировать экспрессию рецепторов различных клеток печени, в том числе СК, и предопределять в ней процессы регенерации.

Однако в условиях физиологической, репаративной и патологической (фиброзирующей) регенерации, в частности, при изменении восприятия гепа-тоцитами, СК и ВКМ регуляторных сигналов из-за нарушения функциональных возможностей СК и ВКМ или в случаях торможения миграции стволо-вых/прогениторных клеток костного мозга (ККМ) в очаги повреждения печени, наблюдаются различия в кооперативном взаимодействии отдельных структурных компонентов печени. В этой связи, требуют отдельного рассмотрения механизмы регуляции восстановительных процессов в этом органе в норме и при патологии.

Гепатоцитъ* [

Потеря пепэт-оцитами ыипроверенно*

ПЛІ-

прост реног во Диссе

покоящаяся звездчатая клетка

клетка

Купфера эндотелиальная клетка

Печеночный Синусоид

Э®0®01010

\ж

активированная ¿вездчатад клетка

отложения фибриллярны* активация коллагенов ^ок Кулфера

Рис. 1. Схема строения печеночного синусоида в нормальной (А) и поврежденной печени (Б) по [8] с изм.

Синусоидальные клетки как регуляторы пролиферативной активности гепатоцитов при физиологической регенерации печени Все четыре типа СК, будучи компонентами стенки печеночного синусоида (микрососуда), с помощью длинных цитоплазматических выростов обеспечивают непосредственный контакт примыкающих печеночных балок с гепатоцитами и с другими синусоидами. В отличие от капилляров других органов, эндотелиальная выстилка синусоида, образующая вместе с гепатоци-тами пространство Диссе, не имеет типичной плотной базальной мембраны. Это пространство заполнено мукополисахаридным веществом, которое продуцируют и в которое погружены СК.

Мукополисахаридный субэндотелиальный ВКМ представляет собой тот особый вид базальной мембраны, с которой контактируют СК и гепатоци-ты. Субэндотелиальный ВКМ состоит из различных комбинаций макромолекул 3-х групп веществ [8]: коллагенов, не образующих фибриллы, главным образом, коллагенов IV, VI, XIV типов; гликопротеинов (фибронектина, ламинина, гиалуроновой кислоты, теснасцина, нидогена, мирозина, энтактина и др.) и протеогликанов (гепарана, дерматан сульфата, хон-дроитин сульфата, пергликана, дистрогликана, син-дикана, бигликана, декорина и др.).

Субэндотелиальный ВКМ, находящийся в пространстве Диссе, регулирует функцию гепатоцитов и СК, изменяя экспрессию специфических генов в этих клетках (например, гена альбумина в гепа-тоцитах), а также количество и порозность синусоидальных фенестр [10] путем ремоделирования структуры матрикса энергией слабых связей белковых молекул. Ремоделирование ВКМ регулируется рецептор-опосредованными механизмами передачи информации с участием молекул адгезии, инте-гринов, морфогенных цитокинов, дистрогликанов, тирозинкиназных рецепторов, синдеканов и др., [11] которые образуются при выполнении специфических и гомеостаз-регулирующих функций СК и самих гепатоцитов [12, 13].

В ремоделировании ВКМ особое значение придается гетерогенности свойств мезенхимальной популяции клеток печени, среди которых, в частности, существуют клетки Ито с экспрессией нейральных [14], ангиогенных [15], контрактильных маркеров [16], а также, по крайней мере, 5 маркеров костномозгового происхождения [17]. Важнейшей гомеостаз-регулирующей функцией СК при физиологической регенерации печени (после частичной гепатэктомии) следует, очевидно, считать поддержание в базальной мембране синусоидов вязкодисперсного состояния коллагенов (повышение коллагено-литической активности ткани печени и снижение суммарного содержания в ней коллагеновых белков) для обеспечения ускоренного взаимодействия всех клеток синусоида и растормаживания митотических потенций гепатоцитов. Так, в опытах с 30% гепатэк-томией у крыс было показано, что уже в течение первых суток активизация процессов пролиферации гепатоцитов в здоровой ткани печени сопровождается не только увеличением количества купферов-ских клеток и миграцией их предшественников из костного мозга [18], но и увеличением более чем в

2 раза коллагенолитической активности ткани печени (р < 0,01), а также уменьшением на 42% содержания в ней коллагеновых белков (р < 0,05) [3, 19].

Полагают, однако, что влияние СК на пролиферацию гепатоцитов не столько прямое, сколько опосредованное, так как, участвуя в образовании и рассасывании (ремоделировании) основного вещества и волокнистых структур ВКМ [20], а также выполняя специфические регуляторные функции (синтез про-и противовоспалительных цитокинов [21], факторов роста, в т.ч. фактора роста гепатоцитов (ШР) [22], фактора стволовых клеток (БСР), мезенхимального морфогенного протеина [23]; индукция рецептор-опосредованных взаимодействий в ВКМ [24] и др.), эти клетки формируют микроокружение гепатоцитов, необходимое для их пролиферации и выполнения специфических функций [5].

Было показано, что клетки Купфера поддерживают адекватное микроокружение для гепатоцитов за счет ранней активации в них лизосомальных гидролаз, а также активации рецептора Ы-ацетилгликозамина, который, как полагают, может выполнять роль посредника в пиноцитозе некоторых гликопротеинов ВКМ. Показано также, что клетки Купфера локально секре-тируют коллагеназу 4-го типа, а также другие матрикс-ные металлопротеиназы (ММП): ММП-1, ММП-13, желатиназы и стромолизин, участвуя таким образом в ремоделировании ВКМ и микроокружения гепатоцитов при восстановительной регенерации печени [25].

Синусоидальные эндотелиальные клетки также активно участвуют в ремоделировании ВКМ, так как очищают кровь от различных патогенных факторов, в т.ч. от разрушенного коллагена, а также участвуют в деградации мукополисахаридов, так как эндотелиоци-ты содержат высокую активность арилсульфатазы [5]. Кроме того, эндотелиальные клетки сами продуцируют нефибриллярный коллаген IV типа и протеогликаны — структурные компоненты нормального ВКМ [24].

Клетки Ито за счет своего расположения в субэн-дотелиальном пространстве, а также за счет своей пластичности и способности к трансдифференцировке (см. следующий раздел) способны к выполнению различных, порой взаимоисключающих функций, реализация которых, по-видимому, регулируется степенью их активации при воздействии стрессорных факторов. Функция клеток Ито к настоящему времени оказалась достаточно изученной при стрессорном повреждении печени, при котором наступает их гиперактивация и стимулируется фиброгенез с отложением в пространстве Диссе фибриллярных коллагенов I, III, V типов и фибронектина, что способствует необратимости повреждения печени [10, 26]. Роль клеток Ито в регуляции гомеостаза печеночной дольки и митотической активности гепатоцитов до сих пор остается мало изученной, хотя в последние годы стали появляться работы, показывающие, что этот тип клеток является важнейшим компонентом микроокружения гепатоци-тов, который необходим для их нормального развития, дифференцировки и регенерации [17].

Так, например, при частичной гепатэктомии клетки Ито продуцируют цитокины, являющиеся потенциальными м ито ген а ми для гепатоцитов: НЭР [27, 28], БСР [29], эпиморфин [30], плейотрофин [31]. Экспрессируя VCAM-1 и БйР-1 а клетки Ито выполняют роль триггера для привлечения в печеночную ткань гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток — активных участников ранней регенерации [32]; ремоделируя ВКМ, клетки Ито участвуют в образовании соединительнотканного каркаса для регенерации паренхиматозных клеток печени [12].

Констатируется, что в культуре клеток печени коллаген, синтезируемый клетками Ито, составляет 5% от общего количества всех синтезируемых ими белков; всего же клетки Ито продуцируют коллагена в 10 раз больше, чем гепатоциты [7]. Показано, что клетки Ито синтезируют протеогликаны, являющиеся главными компонентами нормального внеклеточного матрикса печени, причем они вырабатывают его в 6 раз больше, чем гепатоциты [33].

Однако клетки Ито участвуют в процессах обновления и ремоделирования ВКМ не только путем синтеза структурных матриксных белков, но и путем синтеза и секреции ММП (коллагеназ), желатиназ, стромолизинов и их ингибиторов [34], которые регулируют во ВКМ баланс структурных белков за счет регуляции выраженности гидролиза (деградации) основных белков матрикса. ММП и тканевые ингибиторы металлопротеиназ (ТИМП) входят в семейство цинк-зависимых ферментов [35]. ММП синтезируются клетками Ито в виде неактивных проферментов, которые активируются при отщеплении пропептида, но ингибируются при взаимодействии с эндогенными ТИМП-1 и ТИМП-2. Клетки Ито продуцируют

4 разновидности ММП-мембранного типа, которые активируются под воздействием И_-1р. Среди ММП особое значение придается ММП-9 — нейтральной матриксной металлопротеиназе, которая обладает активностью против коллагена IV типа, входящего в состав базальной мембраны, а также активностью против частично денатурированных коллагенов I и V типов [26].

Повышение коллагеназной активности ткани регенерирующей здоровой печени после 30% частичной гепатэктомии, очевидно, объясняется избирательной субстратной чувствительностью различных отделов ВКМ к разным ММП (ММП-1 чувствительна к интерстициальному коллагену I типа, а ММП-9 к коллагену IV типа) и ТИМП (ТИМП-1 и ТИМП-2) [26]. В результате повышения коллагеназной активности происходит преимущественное усиление деградации коллагена базальных мембран, которое создает благоприятные условия для ускоренного выполнения регуляторных процессов в микроокружении гепатоци-тов. Определяющая роль ММП в процессах предотвращения конверсии субэндотелиального матрикса низкой плотности в матрикс, богатый интерстициальным (фибриллярным) коллагеном, для сохранения адекватной динамики регуляторных процессов при восстановительной регенерации печени доказывается фактом возможности кооперативной и последовательной секреции ММП (коллагеназы, желатиназы, эластазы и других протеиназ), в особенности ММП-9 (коллагеназа 4 типа), другими СК печени: клетками Купфера, эндотелиоцитами, а также несколькими типами мезенхимальных клеток крови и костного мозга

— полиморфноядерными лейкоцитами [26, 36], которые, как известно, являются активными участниками любых регенераторных процессов в организме.

Субэндотелиальный ВКМ низкой плотности, образуемый сбалансированно секретируемыми ММП и ТИМП в период физиологической регенерации, представляет собой адекватную среду для доставки регуляторных (информационных и индуктивных) сигналов всем клеткам печени, которые в виде спектра цитокинов (преимущественно ростовых факторов), поступающих из активированных клеток иммунной системы, сорбированы на ВКМ.

Восприятие цитокиновой сигнализации осуществляется клетками с помощью мембранных рецепторов, которые, как полагают, передают клеткам (от клетки клетке и внутрь клетки) информацию, закодированную в цитокинах в виде соответствующей последовательности аминокислот [37].

Таким образом, анализ функций СК по поддержанию адекватного микроокружения гепатоцитов и их пролиферативной активности убеждает в том, что важнейшим фактором их обеспечения является пролонгированное сохранение низкой плотности субэн-дотелиального ВКМ, которое создает благоприятные условия для скоростного выполнения регуляторных процессов и сохранения собственного адекватного биоритма митотической активности гепатоцитов [26].

Пролонгированное сохранение в печени оптимальной плотности белков базальной мембраны обеспечивается кооперативным взаимодействием нормально функционирующих СК (синтез и секреция ММП, особенно ММП-9, а также ТИМП) с клетками костного мозга и поддерживается широким спектром клеточных, надклеточных, органных и системных факторов (гепатотропные, миелотропные, нейрогуморальные, иммунные) через рецептор-опосредованные взаимодействия этих факторов с ВКМ и гепатоцитами [7].

Синусоидальные клетки и клетки костного мозга как источник восполнения популяции гепатоцитов при репаративной регенерации печени Установлено, что при некоторых видах токсического повреждения печени восполнение популяции гепатоцитов происходит не путем пролиферации дифференцированных клеток, а за счет митозов и диф-ференцировки т.н. овальных клеток [38]. Эти клетки происходят из недифференцированных клеток каналов Геринга, и ряд авторов считают их печеночными стволовыми/прогениторными клетками [39—41].

Овальные клетки у человека можно идентифицировать по поверхностному маркеру OV-6. Они также экспрессируют маркеры гепатоцитов (альбумин, а-фетопротеин), эпителия желчных протоков (цитокератин-19), маркеры гемопоэтических стволовых клеток (CD34, SCF, SCFR, c-kit, тирозинкиназа и Thy-1), что позволило предположить их костномозговое происхождение [42].

В последние годы была показана возможность развития гепатоцитов непосредственно из стволовой кроветворной клетки [43], т.е. из клеток мезенхимальной, а не энтодермальной природы. В частности, было показано, что способностью дифференцироваться в полноценные гепатоциты обладают гемопоэтические стволовые клетки, имеющие фенотип c-kithigh Thylow Linneg Бса-1+, а также мульти-потентные взрослые прогениторные клетки (MAPC) костного мозга [44].

В литературе обсуждается два альтернативных пути репопуляции гепатоцитов клетками костномозгового происхождения. Во-первых, некая субпопуляция клеток костного мозга может выходить в кровоток, подвергаться хоумингу в печень и дифференцироваться в гепатоциты [45]. Эти клетки могут быть либо общими мультипотентными предшественниками гепатоцитов и клеток крови, либо специализированными энтодермальными прогениторными клетками. Во-вторых, костномозговые клетки могут сливаться с гепатоцитами, что создает иллюзию

их дифференцировки в клетки печени [46]. Интереснейшей находкой стало выявление в печени в процессе раннего гистогенеза и при регенерации клеток, одновременно экспрессирующих маркеры мезенхимальных клеток (десмин) и маркеры цитоскелета эпителиальных (печеночных) клеток (цитокератины), а также обнаружение СК, экспре-сирующих только цитокератины, и гепатобластов, продуцирующих десмин [47].

Наличие в гепатобластах и СК развивающейся печени маркера мезенхимальных клеток позволило выдвинуть гипотезу о том, что СК могут служить источником появления гепатоцитов в печени в процессе ее гистогенеза [48].

В литературе уже имеются данные, подтверждающие не только тесную связь пролиферации овальных клеток с пролиферацией синусоидальных клеток [49], но и данные о возможной дифференцировке клеток Ито в печеночный эпителий [22], которая была названа мезенхимально-эпителиальной трансформацией перисинусоидальных клеток [50].

Применяя маркер кроветворных стволовых клеток c-kit (CD-117) для выявления связи процессов регенерации печени со стволовыми потенциями СК А.А. Гумерова с соавт. (2007) показали, что c-kit позитивные клетки появляются на 2-е сут. токсического повреждения печени крысы (введение нитрата свинца) не только среди СК, но и среди гепатоцитов. Было выдвинуто предположение, что при регенерации печени часть гепатоцитов может образовываться из кроветворных стволовых клеток [47]. Однако филогенетически более оправданным явилось предположение об участии кроветворных стволовых клеток прежде всего в восстановлении пула регионарных стволовых клеток печени, которыми, по мнению D.L. Suskind с соавт. (2004), являются синусоидальные клетки Ито [51]. В работе С. Kordes с соавт.

(2007) клетки Ито были впервые названы стволовыми клетками печени [52], а в работе I. Sawitza с соавт. (2009) [32] приводятся доказательства того, что пространство Диссе, образованное протеинами базальной мембраны, эндотелиальными клетками, гепатоцитами и клетками Ито, выполняет роль «стволовой ниши» для последних.

Совсем недавно были опубликованы работы, в которых клетки Ито рассматриваются даже как подтип [53], или производные овальных клеток [54], так как оказалось, что активированные овальные клетки печени крыс экспрессируют не только традиционные маркеры (OV-6, BD-1/BD-2 и M2PK) и маркеры гепатоцитов (альбумин, а-фетопротеин), но и гены, кодирующие белки ВКМ (коллагены, ММП и ТИМП), которые являются маркерами клеток Ито [55—57].

А.А. Гумерова и А.П. Киясов (2010), изучив закономерности экспрессии мезенхимальных и эпителиальных маркеров печени в ходе гисто- и органогенеза, а также при различных экспериментальных условиях, считают, что между клетками Ито, овальными клетками и гепатоцитами существуют не только мезенхимальноэпителиальные, но и эпителиально-мезенхимальные переходы, которые свидетельствуют о фенотипической пластичности клеток Ито и их возможности служить источником развития гепатоцитов [17].

В последние годы появляется все больше сторонников той точки зрения, что гемопоэтические и ММСК костного мозга могут служить источником развития не только гепатоцитов [58—62], но и клеток

Ито [63], так как они единственные из СК способны экспрессировать маркеры стволовых гемопоэтиче-ских клеток (ТЬу-1) и мезенхимальных (Сй133) клеток костного мозга [52, 64—66].

В свою очередь, существуют данные, свидетельствующие о значительном влиянии клеток Ито, их свойств и продуцируемых ими факторов (экспрессия VCAM-1, БйР-1 а, ретиноиды) на дифференцировку и миграционную активность кроветворных стволовых клеток [13, 67].

Вышеприведенные факты позволяют предполагать возможность использования стволовых функций клеток Ито для привлечения активированных компартментов стволовых клеток костного мозга к осуществлению ранних этапов восстановительной регенерации печени [17, 32]. При утрате стволовых функций клеток Ито и возникающем ингибировании миграционной и индуктивной активности стволовых клеток костного мозга возможность развития патологической (фиброзирующей) регенерации печени становится весьма вероятной.

Из работ, анализирующих условия поддержания стволовых свойств клеток Ито, можно заключить, что нахождению этих клеток в недифференцированном состоянии способствует их микроокружение (ниша), причем главную роль играет поддерживаемое взаимодействие клеток Ито с гепатоцитами и нефибриллярными белками нативной базальной мембраны (ламинин, коллаген 4 типа), которые ингибируют запуск их дифференцировки [17, 32, 68]. При отсутствии условий для взаимодействия гепато-цитов и клеток Ито последние приобретают фенотип миофибробластов и утрачивают маркеры стволовых клеток [32], вследствие чего нарушаются регуляторные связи печени с костным мозгом и другими органами иммуногенеза [69], а также нарушаются процессы ее восстановительной регенерации.

На основании приведенных экспериментальных данных можно заключить, что в обеспечении восстановительной регенерации поврежденной печени из всех СК — клеткам Ито принадлежит ведущая роль, при этом они должны сохранять свои стволовые функции. Клетки Ито способствуют адекватной восстановительной регенерации печени тогда, когда при воздействии повреждающих факторов эти клетки, как и другие СК, не только сохранили свою жизнеспособность, но и сохранили свои стволовые регуляторные функции: способность воспринимать регуляторные сигналы, в т. ч. гепатоцитов и других клеток микроокружения, а также стволовых клеток костного мозга; способность поддерживать регуляторное взаимодействие со всеми клетками печени и клетками иммунной системы, обеспечивая баланс цитокинов, ростовых факторов в организме, а также способность предотвращать конверсию ВКМ в матрикс, богатый фибриллярным коллагеном, что необходимо для растормаживания пролиферации гепатоцитов.

Ингибирование стволовых функций клеток Ито

и клеток костного мозга как ведущие механизмы

патологической (фиброзирующей) регенерации

печени

Среди факторов необратимого повреждения печени выделяют местные и системные механизмы, из которых определяющими являются перечисленные ниже [26].

Массовая гибель (некроз) гепатоцитов, которая нарушает химизм их микроокружения и вызывает стрессорную (повреждающую) активацию СК и, прежде всего, клеток Ито [70]. В результате клетки Ито утрачивают пластические и регуляторные функции стволовых клеток и трансдифференцируются в клетки, подобные миофибробластам, которые экспрессируют а-гладкомышечный актин (аБМА), но не способны регулировать в печени межклеточные взаимодействия и структурную адаптацию ВКМ, вызывая дисбаланс функций клеток печени (потеря микроворсинок на гепатоцитах, капилляризация синусоидов, нарушение активации митотических потенций гепатоцитов) (см. рис. 1).

Преобладание процессов синтеза фибриллярных матриксных коллагенов и относительная недостаточность синтеза (активности) матриксных протеиназ (коллагеназ). Результатом этого становится формирование фиброзной ткани, которое начинается в пространстве Диссе и характеризуется отложением коллагена I, III, V типов и фибронектина, создающих препятствия для нормального обмена веществ между кровью синусоидов, гепатоцитами и СК [10] (см. рис. 1).

Развитие дискоординации биорегуляторных ритмов активности гепатоцитов и СК вследствие снижения массы функционирующих гепатоцитов до критического уровня. В результате резко возраста-

ет функциональная нагрузка на оставшиеся клетки, снижается и десинхронизируется их митотическая активность, а также возрастает апоптоз сохранившихся гепатоцитов [7, 71].

Из системных механизмов в развитии необратимости повреждения печени важную роль играет ингибирование функции клеток в органах других систем, участвующих в регуляции процессов регенерации в организме, в частности, в органах иммунной системы. Установлено, что при развитии токсического гепатита у крыс, так же, как и у больных циррозом печени, имеет место торможение миграции стволовых клеток костного мозга, угнетение всей системы моно-нуклеарных фагоцитов, а также атрофия центральных (тимус) и периферических (селезенка) органов им-муной системы [69]. На этом фоне, очевидно, ингибируется восстановление регуляторных функций клеток печени, и прежде всего клеток Ито, что делает процесс фиброгенеза в печени необратимым.

Следует, однако, иметь в виду, что степень ингибирования регуляторных функций СК, в том числе клеток Ито, зависит также от стадии (фазы) и степени выраженности их стрессорной активации патогеном, характер которых и предопределяет дальнейшее течение патологического процесса в печени.

В активации клеток Ито выделяют 2 фазы: фазу инициации и фазу самоподдерживаемой активации (рис. 2).

Рис. 2. Схема изменений функционального состояния клеток Ито в фазу инициации и в фазу самоподдерживаемой активации развивающегося повреждения печени [по данным литературы): КИ - клетка Ито; ММП - матриксная металлопротеиназа; ТИМП - тканевый ингибитор металлопротеиназ; ЕТ1 - эндотелин-1; TGF-ß 1 - трансформирующий фактор роста ß; MCP - моноцитарный хемотаксический протеин; PDGF - тромбоцитарный фактор роста

В первой фазе при паракринном воздействии факторов повреждения печени происходит экспрессия генов и начинается подготовка клеток Ито к изменению фенотипа (превращение из клеток-депо витамина А в фиброзирующие миофибробласты), в результате которого они становятся восприимчивыми к индукторам воспаления [26].

Во второй фазе при паракринном и аутокринном воздействии провоспалительных стимулов в клетках Ито «поддерживается» активированный фенотип, который характеризуется «превращением» этих клеток в миофибробласты, осуществляющие синтез фибриллярного коллагена.

Инициация провоспалительной активации клеток Ито начинается с усиления процессов свободнорадикального окисления в поврежденных клетках печени и поступления во внеклеточное пространство продуктов перекисного окисления липидов, недоокис-ленных продуктов метаболизма, а также цитокинов и сигнальных молекул (окислительный стресс) [26]. В начальную фазу активации клеток Ито усиленный синтез первичных медиаторов воспаления (IL-1, IL-6, TNF -а, интерфероны, молекулы адгезии ICAMI-1, ICAM-2, VCAM-1, селектины и др.) поддерживается активированными купферовскими клетками, которые инициируют процесс локального воспаления и пара-кринно стимулируют клеток Ито [24]. Одновременно окислительный стресс стимулирует синусоидальные эндотелиальные клетки, которые, продуцируя фибро-нектин, также способствуют активации клеток Ито. Кроме того, в этих условиях эндотелиальные клетки начинают участвовать в превращении латентных ци-токинов в активные, в частности, в превращении латентного TGF-ß1 в активную профиброгенную форму путем активации плазмина. Недавние исследования показали, что не только некроз гепатоцитов, но и их апоптоз может способствовать фиброгенному ответу клеток Ито, причем образующиеся апоптотические фрагменты гепатоцитов индуцируют фиброгенный ответ клеток Ито как в культуре in vitro, так и в опытах на животных in vivo [71].

В фазу инициации процесс активации клеток Ито может завершиться, но это происходит на фоне стимуляции образования ими противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-12), которые ингибируют воспалительную реакцию в зоне повреждения, в частности, продукцию TNF-а печеночными макрофагами. [72]. В результате в клетках Ито ингибируются процессы воспаления (либо эти клетки подвергаются апопто-зу) и процессы фиброза в печени не развиваются (см. рис. 2).

Если исходить из экспериментальных данных, приведенных в разделе 1.2, то имеются все основания полагать, что прекращение воспаления в фазу инициации активности клеток Ито обусловлено продолжающимся сохранением на этом этапе их стволовых функций и осуществлением регуляторного взаимодействия не только с клетками печени, но, прежде всего, со стволовыми/прогениторными клетками костного мозга. В результате становится возможным поступление последних в печень для восполнения (дублирования) пула региональных стволовых клеток и регуляторного восстановления баланса цитокинов и ростовых факторов в клетках печени, в том числе в клетках Ито, а также ремоделирования ВКМ, создающего каркас для паренхиматозных клеток [12].

Фаза самоподдерживаемой активации клеток Ито характеризуется развитием в них фенотипических изменений, которые ведут к потере ретиноидов и превращению их в контрактильные клетки — миофибробласты. Эти клетки осуществляют усиленный синтез фибриллярного коллагена, в результате чего в пространствах Диссе между гепатоцитами образуются мощные пучки новообразованных коллагеновых волокон, окруженных скоплениями фибробластов, макрофагов, клеток Ито, лимфоцитов, полиморфноядерных лейкоцитов, эозинофилов и плазматических клеток, которые поддерживают воспалительный процесс в печени, снижают репаративные и митотические потенции гепатоцитов и способствуют формированию глубоких структурных нарушений ВКМ с развитием цирроза [7, 73—75]. Миофибробласты проявляют также способность к хемотаксису, деградации ВКМ и пролиферации, что усугубляет цитоки-новый дисбаланс в печени и становится фактором непрерывно поддерживаемой активации клеток Ито (см. рис. 2) и развития системной воспалительной реакции в организме.

Пролиферация клеток Ито во второй фазе их активации была подтверждена в экспериментальных работах с повреждением печени, когда была установлена активация множества митогенных факторов клеток Ито, а также экспрессия их тирозин-киназных рецепторов [76]. Наиболее выраженная пролиферация клеток Ито достигалась с участием таких митогенов, как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эндотелин-1 (ET-1), тромбин, фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и др. Однако накопление клеток Ито в зонах повреждения печени происходит не только за счет их пролиферации, но и за счет их направленной миграции в эти зоны путем хемотаксиса при участии таких хемоаттрактантов, как PDGF и лейкоцитарный хемоаттрактант — моноцитарный хемотаксический протеин-1 (MCP) [70].

Контрактильность клеток Ито также является маркером их непрерывной аутоактивации в результате перехода в миофибробласты. Главными стимулами для сокращения количества клеток Ито являются такие цитокины как: эндотелин-1, аргинин-вазопрессин, адреномедуллин и эйкозаноиды, экспрессия которых клетками Ито становится повышенной.

Важнейшим фиброгенным фактором при непре-кращающейся аутоактивации клеток Ито выступает TGF-ß1, уровень которого в крови повышается как при экспериментальном фиброзе, так и при развитии фиброза печени у человека. Имеется множество источников избыточного образования TGF-ß1, среди которых наиболее важным считают аутокринную экспрессию клетками Ито [77], которая наступает за счет транскрипционной стимуляции TGF-ß1, активации латентного TGF-ß1, возросшей экспрессии рецепторов к TGF-ß1 и стимуляции сигнальных компонентов TGF-ß1 [78].

Показано, что фиброгенной активностью обладают и другие цитокины, такие как IL-1 ß, TNF, а также липидные перекиси. Не менее важная роль в процессах фиброгенеза печени принадлежит количественным и качественным нарушениям продукции клетками Ито ММП и ТИМП, в результате чего ВКМ превращается в матрикс, богатый интерстициальным (фибриллярным) коллагеном, нарущающим процессы восстановительной регенерации всех клеток ткани печени.

В фазу непрерывно поддерживаемой самоак-тивации клеток Ито, прогрессирующего образования фиброгенных факторов и развития фиброза — нарастающая тканевая гипоксия становится фактором дополнительной избыточной экспрессии в CK провоспалительных молекул адгезии — ICAM-1, ICAM-Э, VEGF, провоспалительных хемоаттрактан-тов — M-CSF, MCP-1 (моноцитарный хемотаксиче-ский протеин-1) и CJNC (цитокин-связанный нейтро-фильный хемоаттрактант) [7Ш и тд., которые в свою очередь стимулируют образование цитокинов (TGF-b, PDGF, FGF, PAF, SCF, ET-1) и усиливают процессы фиброгенеза в печени, создавая условия для само-поддерживаемой активации клеток Ито [7Ш.

Анализ результатов современных исследований позволяет признать, что патологическая (фибрози-рующая) регенерация печени возникает в результате стрессорного повреждения CK, в особенности клеток Ито, которые утрачивают свойства региональных стволовых клеток и превращаются в миофибробласты, поддерживающие местную и системную про-воспалительную реакцию и процессы фиброгенеза в печени на фоне угнетения миграционных и регуляторных функций клеток костного мозга и иммунной системы в целом [7, Б9].

Поскольку CK, как и клетки костного мозга, имеют мезенхимальное происхождение, а физиологическая и репаративная регенерация печени происходят при активном участии мигрирующих клеток костного мозга, имеются основания полагать, что для предотвращения патологической (фиброзирующей) регенерации печени и восполнения в ней дефицита гепа-тоцитов патогенетически оправданным может стать применение аутогенных, обязательно культивированных стволовых/прогениторных клеток костного мозга (гемопоэтических и стромальных) для индукции, усиления или возмещения регуляторных функций региональных стволовых клеток печени [1Э].

Стволовые/прогениторные клетки костного мозга как участники восстановительной регенерации поврежденной печени

Традиционно считалось, что цирроз печени является необратимым патологическим состоянием. Однако экспериментальные и клинические наблюдения последних лет стали убеждать в возможности морфологического регресса патологических изменений в печени [79—81] путем принудительного перепрограммирования процессов регенерации и активного включения в него системных механизмов регуляции с помощью тканевых, клеточных и пептидных методов терапии [ВЭ—84], в т.ч. клеток костного мозга, применение которых является патогенетически оправданным, так как при тяжелом повреждении печени должна быть интенсифицирована миграционная и регуляторная активность клеток костного мозга.

Факторы, предопределяющие участие и эффективность воздействия клеток костного мозга на процессы восстановительной регенерации печени

В настоящее время уже накоплено достаточно экспериментальных и клинических наблюдений, свидетельствующих о том, что при хроническом фиброзирующем повреждении печени аутогенные, аллогенные и ксеногенные гемопоэтические стволовые клетки и ММ^ костного мозга при введении

в организм способны оказывать восстановительное воздействие на структуру и показатели функции поврежденной печени [85—92].

Было установлено, что введение стволовых/прогениторных клеток костного мозга мышам с CCL4-поврежденной печенью и сформировавшимся в ней фиброзом, снижает летальность, повышает уровень альбумина в крови, снижает трансаминазы [90], повышает уровень антиоксидантной защиты [93] и оказывает фибролитический эффект [86, 91], возникновение которого связывают с выраженной экспрессией ММП-9 [85]. Полагают, что активация восстановительных процессов в цирротически измененной печени может быть обусловлена наступающим увеличением количества овальных клеток в перипортальной зоне уже через одну неделю после трансплантации стволовых/прогениторных клеток костного мозга [85], снижением экспрессии мРНК проколлагена 1 типа, a-SMA и TGF-ß1 в эти же сроки за счет индукции апоптоза активированных клеток Ито, а также может быть обусловлена повышением количества высокоплоидных гепатоцитов (8n и 16n) в сохранившейся паренхиме печени, которые образовались за счет активизации механизмов клеточного слияния [87, 93].

Показано, что характер и интенсивность восстановительных процессов в печени зависят, с одной стороны, от тяжести повреждения печени, а с другой — от степени сохранности биорегуляторной активности клеток костного мозга. Так, при умеренной степени поражения печени появление донор-зависимых гепатоцитов в печени после трансплантации аллогенных клеток костного мозга варьировало от 1 до 5% [94]. В то же время, при более выраженном поражении печени количество донор-зависимых гепатоцитов становилось достоверно выше и достигало в отдельных наблюдениях (при выраженном фиброзе печени на фоне хронического гепатита С) — 43% [95].

Имеющиеся наблюдения позволяют заключить, что вовлечение стволовых/прогениторных клеток костного мозга в процессы репаративной регенерации происходит наиболее активно в условиях, когда повреждена значительная часть ткани печени и когда необходима эффективная компенсация проявлений печеночной недостаточности. В условиях физиологической регенерации процесс репопуляции печени клетками костного мозга, по-видимому, также имеет место [18], но происходит с минимальной интенсивностью, и это дало основание полагать, что митотическая активность гепатоцитов в печени регулируется только местными (печеночными) факторами без участия стволовых/прогениторных клеток костного мозга [38].

Средние сроки репопуляции клеток печени под влиянием клеток костного мозга варьируют. Так, у мышей и крыс этот процесс продолжается от нескольких недель до нескольких месяцев [87, 96, 97]; у человека репопуляция клеток печени регистрируется уже через 2 нед. после их трансплантации и сохраняется продолжительное время [98].

Попадание стволовых/прогениторных клеток костного мозга в печень происходит при различных способах их введения: при внутривенном, внутрипор-тальном, интраперитонеальном, а также при введении клеток под капсулу селезенки [45, 99, 100]. Одним из механизмов их миграции является трансэндотелиальная миграция, за счет продукции по-

врежденными клетками печени провоспалительных сигнальных молекул, в частности, SDF-1 — хомин-гового белка, рецепторы которого экспрессируются стволовыми/прогениторными клетками костного мозга [101, 102], а также за счет продукции IL-8, HGF и ММП-9 [103].

Важным обстоятельством, интенсифицировавшим исследования по применению клеток костного мозга для восстановительной регенерации поврежденной печени, стали многочисленные наблюдения способности гемопоэтических и мезенхимальных стромальных стволовых клеток, клеток пуповинной крови и крови взрослого человека дифференцироваться в гепато-цитоподобные клетки [96, 104—110], а также наблюдения, доказывающие появление в печени после введения клеток костного мозга функционально полноценных гепатоцитов костномозгового происхождения, которые обеспечивают коррекцию моделированной печеночной недостаточности [59, 87, 111—114].

При этом практически все сходятся во мнении, что способность стволовых клеток костного мозга дифференцироваться под влиянием печеночного микроокружения в гепатоцитоподобные клетки, проявляющаяся экспрессией в них специфических печеночных генов, а также способность клеток миеломоноцитарного ряда к гибридизации (химеризации) в результате их слияния с гепатоцитами (fusion-феномен) [115, 116] обусловлены их пластичностью. Однако исследованиями последних лет установлено, что партнерами при гибридизации клеток печени при введении клеток костного мозга становятся не столько гепатоциты (0,6% от всей популяции гепатоцитов), сколько звездчатые клетки (68% всех клеток Ито) и миофибробласты (70% всех клеток), так как именно они включали Y-хромосому доноров-самцов в результате введения мышам-самкам с токсическим повреждением печени клеток костного мозга [117]. Поскольку клетки Ито CD133+ обладают свойствами прогениторных клеток [52] и при направленном культивировании начинают экспрессировать гепатоцитарные маркеры — мРНК альбумина и а-фетопротеина, — то это дает основание считать, что клетки костного мозга осуществляют репрограммирование и активизацию восстановительных процессов в печени путем клеточной гибридизации (химеризации) не столько гепатоцитов, сколько непаренхиматозных клеток и, прежде всего, клеток Ито. Подтверждением регуляторного воздействия стволовых/прогениторных клеток костного мозга преимущественно на непаренхиматозные структуры печени у больных с хроническим гепатитом в стадии тяжелого фиброза может служить работа А.П. Киясова с соавт.

(2008) [92]. Наряду с пластическим эффектом. участие стволовых/прогениторных клеток костного мозга в регенерации печени осуществляется паракринным путем с помощью дистантно продуцируемых ими гуморальных факторов — цитокинов, хемокинов, ростовых факторов — TNF-a, IL-1, IL-6, LiF, IL-10, NGF, оксид азота, VEGF (A и B), HGF, TGF-b, MMPs (1, 2, 9), TIMPs, FGF-2,7, SCF и др. [83, 118—125], многие из которых оказывают регулирующее воздействие на пролиферацию гепатоцитов как in vitro, так и in vivo [126, 127].

Особый интерес представляют данные о важной роли SCF в репаративной регенерации печени. Выяснилось, что печень является богатым источником SCF и что этот фактор стимулирует пролиферацию гепатоцитов при резекции печени [128]. Кроме того, оказалось, что клетки костного мозга, и пре-

жде всего ММСК, также являются продуцентами SCF [120]. Эти факты заставляют предполагать, что при дефиците образования SCF в печени в результате ее резекции или повреждения, активация образования и доставки SCF клетками костного мозга будут способствовать восстановлению (нормализации) функциональной активности не только гепатоцитов, но и непаренхиматозных клеток печени — главных регуляторов митотической активности гепатоцитов, а также будет способствовать пролиферации и дифференци-ровке стволовых клеток печени, т.е. овальных клеток и клеток Ито, репопулирующих ее паренхиму и обеспечивающих регресс фиброзирования ВКМ.

Индукция регенерации печени под воздействием паракринного эффекта ММСК была впервые продемонстрирована B. Parekkadan с соавт. (2007) [82], которые на модели поражения печени D-галакто-замином смогли продемонстрировать значительное улучшение выживаемости крыс с фульминантным течением токсического гепатита при введении им среды, кондиционированной ММСК. В последующих исследованиях эти авторы уточнили, что повышение выживаемости крыс, снижение гибели клеток печени и ускорение их регенерации при использовании фракционированной кондиционированной среды обусловлено молекулами (цитокинами, хемокинами), имеющими гепарин-связывающую аффинность [84].

При сравнительном исследовании терапевтической эффективности аутогенных гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток при печеночной недостаточности было констатировано, что результативность от применения последних была выше как в эксперименте [85, 93], так и в клинической практике при исследовании противовоспалительной и фибролитической активности [129]. При этом выраженность противовоспалительной активности ММСК на повреждение обусловлена секрецией ими факторов, способных нейтрализовать активность провоспалительных цитокинов, например за счет NFkB-зависимой секреции sTNFR-1 [130].

При ответе на вопрос о предпочтительности используемого типа ММСК — недифференцированных или предифференцированных в гепатоцитарном направлении (была подтверждена экспрессия гепато-цитарых маркеров), было установлено [89], что независимо от способа введения клеток (внутривенно или под капсулу селезенки) регенерационный потенциал недифференцированных превосходит регенерационный потенциал гепатоцитоподобных ММСК. Полученный результат может быть связан со снижением при культивировании in vitro экспрессии хемо-киновых рецепторов на гепатоцитоподобных клетках, которое ведет к соответствующему снижению их хемотаксической реакции [131]. Возможно также, что более высокая реакционная активность ММСК обусловлена их меньшей дифференцированностью и поэтому способностью продуцировать более широкий спектр факторов, которые, действуя суммарно, ускоряют восстановительные процессы в поврежденной печени.

Подтверждением этой точки зрения могут служить данные о выраженном антифибротическом эффекте ММСК из плаценты человека у крыс с CCl4-поврежденной печенью, что позволило авторам предложить применение плацентарных мезенхимальных стромальных клеток для лечения заболеваний печени, трудно поддающихся лечению [132].

Клиническая эффективность клеток костного мозга

при хроническом (фиброзирующем) повреждении

печени

В настоящее время в разных клиниках мира на крайне ограниченном контингенте больных с печеночной недостаточностью начали проводиться исследования по оптимизации условий применения аутогенных клеток костного мозга: изучаются разные популяции клеток, их дозы, а также сроки и кратность введения больному [75, 88, 92, 133—136].

Так, А. ОаэЬатт с соавт. (2007) [133] сообщили о позитивных результатах внутрипортального введения несортированных аутогенных клеток костного мозга для спасения 67-летнего больного с тяжелым токсическим (лекарственным) гепатитом, у которого имелись противопоказания для трансплантации печени. Было констатировано быстрое улучшение синтетической и детоксикационной функции печени, причем в биопсийном материале, взятом на 20-е сут. после трансплантации, отмечалось увеличение пролиферации гепатоцитов вокруг очагов некроза, которое авторы связали с паракринным эффектом введенных клеток.

А.П. Киясов с соавт. (2008) сообщают о позитивных изменениях в клиническом состоянии 3-х больных с хроническим гепатитом в стадии тяжелого фиброза после однократного введения гемопоэ-тических стволовых клеток в чревный ствол [92]. По результатам пункционной биопсии печени эти авторы уже через 1 мес. после клеточной терапии констатировали снижение индекса гистологической активности за счет уменьшения выраженности портального воспаления и внутридольковых дегенераций. Однако самым важным результатом трансплантации, по мнению авторов, являются положительные качественные изменения непаренхиматозных структур печени — уменьшение количества миофибробла-стов в паренхиме, разрешение перисинусоидального фиброза — исчезновение коллагеновых волокон в пространстве Диссе и восстановление нормального строения синусоидальных капилляров, что вызвало снижение напряженности регенераторного ответа паренхимы и нашло отражение в значительном снижении исходно высокого уровня пролиферции гепатоцитов, а также в восстановлении их исходно сниженной функциональной активности (произошло снижение АЛТ, АСТ, ГГТ и повышение протромбино-вого индекса).

W.T. Knoefel с соавт. (2005) после внутрипор-тальной трансфузии аутогенных Сй133+ ММСК больным с эмболизацией портальной вены в результате опухоли печени отметили увеличение пролиферации гепатоцитов в 2,5 раза и коррекцию клинических показателей печеночной недостаточности, что позволило им высказать предположение о высоком терапевтическом потенциале вводимых клеток и указать на необходимость дальнейшего изучения возможностей этого метода [134].

М. МоЬатас^ас! с соавт. (2007) [136] провели уже 2 группы исследований на больных с циррозом печени, в которых сравнивалась терапевтическая эффективность аутогенных ММСК (I группа) при введении 31,73х106 клеток, и аутогенных гемопоэ-тических стволовых клеток (II группа) при введении в печеночную артерию в количестве 5,25х106 клеток. Оказалось, что из 4-х больных 1-й группы у 2-х через 12 мес. наступило достоверное улучшение

состояния, оцениваемое по клиническим шкалам более чем в 2 раза, тогда как во 2-й группе (n = 4) позитивные изменения по тем же критериям к тому же сроку наблюдения были незначительные. Эти результаты послужили для авторов основанием считать, что применение ММСК для коррекции печеночной недостаточности в дозах, в 6 раз более высоких, чем дозы гемопоэтических стволовых клеток, может оказаться более эффективным, чем применение гемопоэтических клеток.

Анализ результатов клинических исследований разных групп авторов, в которых, наряду с позитивной оценкой, приводятся сведения об отсутствии улучшения структуры и функции печени при введении ММСК в условиях тяжелой печеночной недостаточности [117, 137] позволил L.J. Dai и соавт.

(2009) сформулировать общие рекомендации для повышения результативности их применения в клинике у больных с циррозом [75]. Эти авторы рекомендуют:

— использовать фракцию ММСК, очищенную от фиброгенных клеток, т.е. использовать CD133 + клетки, что должно снизить риск прогрессирования фиброза печени;

— осуществлять возможно более раннее примение ММСК, в частности, на этапе развитого гепатита В, когда по своим биологическим характеристикам они еще не отличаются от клеток здоровых людей [138] и когда еще не наступило перепрограммирование в работе систем восстановительной регенерации;

— использовать достаточно большой объем клеток (от млн до млрд клеток на 1 кг массы тела больного), чтобы можно было оказать мощное регуляторное воздействие на оставшуюся паренхиму печени, сохранившиеся непаренхиматозные клетки и измененный ВКМ [139];

— считать безопасным при наращивании массы ММСК использование не более 3—5 культуральных пассажей, так как при этом сохраняется генетическая стабильность культивируемых клеток. Достаточным исходным объемом аспирата костного мозга для получения необходимого количества клеток может стать объем 10—15 мл [99, 140];

— считать предпочтительным способом введения клеток внутривенный: внутриартериальная и внутри-портальная трансплантация из-за нарушения свертываемости крови у больных печеночной недостаточностью должна служить противопоказанием для катетеризации указанных сосудов;

— проводить широкомасштабные двойные слепые клинические исследования, которые должны предшествовать внедрению трансплантации ММСК в широкую клиническую практику лечения хронической печеночной недостаточности.

Продолжающиеся исследования терапевтических возможностей клеток костного мозга при печеночной недостаточности с фиброзом обусловлены способностью стволовых клеток костного мозга хотя бы частично индуцировать регресс хронического воспаления и сформировавшегося цирроза в паренхиме печени [79—81].

Ключевым моментом индукции этих процессов в поврежденной печени становится поддерживаемая провоспалительными цитокинами самоактивация непаренхиматозных клеток и, прежде всего, клеток Ито, которые, наряду с секрецией провоспалительных цитокинов и экспрессией молекул адгезии, при

активации «превращаются» в клетки, хронически поддерживающие иммунореактивность, так как приобретают черты антигенпрезентирующих клеток и способны стимулировать пролиферацию эффекторных лимфоцитов [73]. Однако при самоподдерживаемой активации клетки Ито подвергаются фенотипическому изменению и дифференцируются в активно пролиферирующие миофибробластоподобные клетки, главной функцией которых становится синтез фибриллярного коллагена и других нерастворимых белков ВКМ, количество которых увеличивается при фиброзе печени [13]. Так как активированные клетки Ито являются клетками, прежде всего, поддерживающими хроническое воспаление в печени, то индукция апоптоза этих клеток за счет создания в организме условий, присущих развитию состояния иммунной толерантности, и составляет, очевидно, основу разработки метода антифиброзной терапии печени стволовыми/прогениторными клетками костного мозга (рис. 3).

В настоящее время на многочисленных моделях фиброза печени [75, 92, 142—144] был показан факт антифиброзного действия ММСК. Было установлено, что сокультивирование их с активированными клетками Ито приводит к значительному снижению накопления коллагена в среде, а также к индукции апоптоза клеток Ито [82]. При этом в основе механизма регуляторного влияния ММСК на активированные клетки Ито при их сокультивирова-нии лежит торможение дифференцировки последних в активированные миофибробласты, так как количество клеток Ито в фазе G0 — увеличивалось, а в фазе

S — сокращалось [143].

Кроме того, в исследованиях in vitro была показана четкая корреляция между снижением экспрессии ТИМП и повышением апоптоза клеток Ито, что позволило предположить участие ТИМП в регуляции жизнеспособности клеток Ито через сопряженную активацию ММП [144—146].

Рис. 3. Схема иммунорегуляторных свойств мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [из 141 с изм.]: М-СБР - моноцитарный колониестимулирующий фактор; РБЕ2 - простогландин Е2; N0 - оксид азота;

ТБГр - трансформирующий фактор роста р; НБГ - гепатоцитарный фактор роста

Вместе с тем, следует иметь в виду, что не все исследователи признают фибролитический эффект клеток костного мозга и их способность индуцировать апоптоз клеток Ито [117, 147]. Более того, они считают, что клетки костного мозга сами по себе вносят вклад в развитие фиброза печени, так как существенно увеличивают в ней популяцию клеток Ито. Эти наблюдения дополняются результатами исследований I. Sakaida с соавт. (2006), которые отметили, что, несмотря на снижение фиброза печени при введении ММСК, незначительное количество трансплантированных клеток все же дифференцируется в клетки Ито [85]. Полученные результаты авторы объясняют тем, что введенные клетки снижают количество активированных клеток Ито, вызывая их апопотоз, но, очевидно, способствуют также дифференцировке костномозговых предшественников в незрелые клетки Ито, обеспечивая тем самым восполнение пула стволовых клеток в поврежденной печени, которыми, по последним данным, являются сами клетки Ито [17].

Заключение

Общность мезенхимального происхождения, способность к осуществлению мезенхимальноэпителиальных переходов и кооперативному взаимодействию, поддерживаемому широким спектром гепатотропных, миелотропных, нейрогуморальных и иммунных факторов, позволяет стволовым/проге-ниторным клеткам и, в частности, клеткам костного мозга поддерживать гомеостаз печеночной дольки и обеспечивать адекватный уровень митотической активности гепатоцитов при восстановительной регенерации печени.

Среди множества функций стволовых/прогени-торных клеток при регенерации печени важнейшей является сохранение низкой плотности субэндотели-ального ВКМ, которое регулируется ММП и ТИМП, продуцируемыми стволовыми/прогениторными клетками и, прежде всего, незрелыми (недифференцированными) клетками Ито.

По современным представлениям, клетки Ито являются региональными стволовыми клетками печени и с помощью своих стволовых факторов способны привлекать стволовые/прогениторные клетки костного мозга в печень для кооперативного осуществления ранних этапов восстановительной регенерации.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Gennero L., Roos M.A., Sperber K. et al. Pluripotent plasticity of stem cells and liver repopulation. Cell Biochem. Funct. 2010; 28: 178-89.

2. Шумаков В.И., Онищенко Н.А. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. М.: Лавр; 2009.

3. Маянский Д.Н. Роль стромы печени в патогенезе гепатитов. Вестник АМН СССР 1988; 5: 81-8.

4. Geerts A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin. Liver Dis. 2001; 21: 311-35.

5. Щеглев А.И., Мишнев О.Д. Структурно-метаболическая характеристика синусоидальных клеток печени. Успехи совр. Биол. 1991; 3(1): 73-82.

6. Секамова С.М., Бекетова Т.П. Функциональная морфология печени. В: Серов В.В., Лапиш К.М., редакторы. Морфологическая диагностика заболеваний печени. М.: Медицина 1989;8-36.

7. Онищенко Н.А. Регуляция восстановительных процессов в печени в норме и при патологии. В: Шумакова В.И., Онищенко Н.А., редакторы. Лечение печеночной недостаточности методами трансплантации и экстракорпорального подключения печени и других тканей. М.: ВИНИТИ 1994; 76-141.

8. Friedman S.L. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J. Biol. Chem. 2000; 275: 2247-50.

За счет стволовых функций клетки Ито поддерживают адекватное взаимодействие с гепатоцитами и нефибриллярными белками ВКМ, которое ингибирует запуск дифференцировки незрелых клеток Ито в зрелые, имеющие фенотип миофибробластов. Клетки Ито со свойствами миофибробластов продуцируют фибриллярные белки, утрачивают свои стволовые функции, не способны поддерживать регуляторное и кооперативное взаимодействие со стволовыми/про-гениторными клетками костного мозга, что создает условия для возникновения глубоких нарушений восстановительной регенерации печени с развитием в ней процессов хронического воспаления и фибрози-рования.

Позитивное влияние стволовых/прогениторных клеток костного мозга, доставленных в печень в условиях торможения ее репаративной регенерации (прогрессирование процессов воспаления и фибро-зирования) связывают со снижением количества активированных клеток Ито со свойствами миофи-бробластов за счет их апоптоза, с нейтрализацией активности провоспалительных цитокинов и воспалительного ответа на повреждение и со снижением процессов фиброзирования в печени.

Возможно, что клетки костного мозга (в частности, ММСК) способствуют дифференцировке костномозговых предшественников в клетки Ито со стволовыми функциями, которые обеспечивают в печени регуляцию восстановительных процессов.

Результаты применения клеток костного мозга для индукции восстановительных процессов в поврежденной печени как в эксперименте, так и в клинике зависят от множества факторов — от типа используемых клеток костного мозга (гемопоэтических или ММСК), их предифференцировки, дозы, а также от тяжести (обратимости) и объема исходного повреждения печени. Поэтому для более полного суждения о регенераторных возможностях аутологичных клеток костного мозга при лечении заболеваний печени в клинической практике необходимо проводить широкомасштабные двойные слепые клинические исследования под контролем информативных клинических, лабораторных и морфологических методов исследования, позволяющих в динамике оценивать степень выраженности и направленность регенераторных процессов.

9. Schuppan D., Ruehl M., Somasundaram R. et al. Matrix as modulator of stellate cell and hepatic fibrogenesis. Semin. Liver Dis. 2001; 21: 351-72.

10. Шерлок Ш., Дули Д. Заболевания печени и желчных путей. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2002.

11. Yurchenco V., Analysis of basement membrane self-assembly and cellular interactions with native and recombinant glycoproteins. Methods Cell Biol. 2002; 69: 111-44.

12. Kim T.H., Mars W.M., Stolz D.B. et al. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. J. Hepatol. 1997; 26: 896-904.

13. Friedman S.L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional and enigmatic cells of liver. Physiol. Rev. 2008; 88: 125-72.

14. Cassiman D., Libbrecht L., Desmet V. et al. Hepatic stellate cell/myofibroblast subpopulations in fibrotic human and rat livers. J. Hepatol. 2002; 36: 200-09.

15. Corpechot C., Barbu V., Wendum D. et al. Hypoxia-induced VEGF and collagen I expressions are associated with angiogenesis and fibrogenesis in experimental cirrhosis. Hepatology 2002; 35: 1010-21.

16. Rockey D.C. Vascular mediators in the injured liver. Hepatology 2003; 37: 4-12.

17. Гумерова А.А., Киясов А.П. Могут ли перисинусоидальные клетки быть региональными стволовыми клетками (прогениторны-ми) клетками печени? Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010;5(1): 33-40.

18. Панин Л.Е., Соколова М.В., Усынин И.Я. Роль мононукле-арной фагоцитирующей системы в регуляции биосинтеза белка в переживающих срезах печени и гепатоцитах белых крыс. Бюлл. экс-пер. биол. мед. 1991; 1: 108—9.

19. Косых А.А., Бесараб И.Ю., Рощина Н.М. Роль соединительной ткани в репаративной регенерации нормальной и цирротически измененной печени. В кн.: Солопаев Б.П. Регенерация, адаптация, гомеостаз. Горький. 1990; 21—30.

20. Michalopoulos G.K, De Frances M.C. Liver regeneration. Science 1997; 276(5309): 60-6

21. Плющ И.В., Цырендоржиев Д.Д., Зубахин А.А. и др. Филогенная и гемопоэзстимулирующая активности макрофагов печени и легких при регенерации печени. Бюлл. экспер. биол. мед. 1996; 11: 494-8.

22. Masumoto A., Yamamoto N. Cell characterization of a hepatocyte growth factor derived from nonparenchymal liver cells. Struct. Funct. 1993; 18(2): 87-94.

23. Gaca M.D., Pickering J.A., Arthur M.J. et al. Human and rat hepatic stellate cells produce stem cell factor: a possible mechanism for mast cell recruitment in liver fibrosis. J. Hepatol. 1999; 30(5): 850-8.

24. Tsukamoto H. Redox regulation of cytokine expression in Kupffer cells. Antioxid Redox Signal 2002; 4: 741-8.

25. Han Y.P., Zhou L., Wang J. et al. Essential role of matrix metalloproteinases in interleukin-1-induced myofibroblastic activation of hepatic stellate cell in collagen. J. Biol. Chem. 2004; 279: 4820-8.

26. Friedman S., Rockey D. Montgomery B. Hepatic fibrosis 2006: report of the third AASLD single topic conference. Hepatology 2006; 45: 242-9.

27. Schirmacher P., Geerts A., Pietrangelo A. et al. Hepatocyte growth factor/hepatopoietin a is expressed in fat-storing cells from rat liver but not myofibroblast-like cells derived from fat-storing cells. Hepatology 1992; 15: 5-11.

28. Maher J.J. Cell-specific expression of hepatocyte growth factor in liver. upregulation in sinusoidal endothelial cells after carbon tetrachloride. J. Clin. Invest. 1993; 91: 2244-52.

29. Fujio K., Evarts R.P., Hu Z. et al. Expression of stem cell factor and its receptor, c-kit, during liver regeneration from putative stem cells in adult rat. Lab. Invest. 1994; 70: 511-6.

30. Yoshino R., Miura K., Segawa D. et al. Epimorphin expression and stellate cell status in mouse liver injury. Hepatol. Res. 2006, 34: 238-49.

31. Asahina K., Sato H., Yamasaki C. et al. Pleiotrophin/heparinbinding growth-assosiated molecule as a mitogen of rat hepatocytes and its role in regeneration and development of liver. Am. J. Pathol. 2002; 160: 2191-205.

32. Sawitza I., Kordes C., Hausinger D. The niche of stellate cells within rat liver. J. Hepatol. 2009; 50(5): 1617-24.

33. Arenson D.M., Friedman S., Bissel M. Formation of extracellular matrix in normal rat liver: lipocytes as a mayor source of proteoglycan. Gastroenterology 1998; 95: 441-7.

34. Arthur M.J., Friedman S.L., Roll F.J. et al. Lipocytes from normal rat liver release a neutral metalloproteinase that degrades basement membrane (type IV) collagen. J. Clin. Invest. 1989; 84(4): 1076-85.

35. Arthur M.J. Degradation of matrix proteins in liver fibrosis. Pathol. Res. Pract. 1994; 190(9-10): 825-33.

36. Ben S., Li X., Xu F. et al. Treatment with anti-CC chemokine receptor 3 monoclonal antibody or dexamethasone inhibits the migration and differentiation of bone marrow CD34 progenitor cells in an allergic mouse model. Allergy 2008; 63(9): 1164-76.

37. Чалисова Н.И., Князькин И.В., Кветной И.М. Нейроиммуно-эндокринные механизмы действия пептидов и аминокислот в тканевых культурах. СПб: Деан; 2005.

38. Ярыгин К.Н. Роль резидентных и циркулирующих стволовых клеток в физиологической и репаративной регенерации печени. Па-тол. Физиол. Экспер. Терапия. 2008; 1: 2-7.

39. Fausto N. Hepatocyte differentiation and liver progenitor cells. Curr. Opin. Cell Biol.1990; 2: 1036-42.

40. Sell S. Is there a liver stem cell? Cancer Res. 1990; 50(13): 3811-5.

41. Sigal S.H., Brill S., Fiorino A.S. et al. The liver as a stem cell and lineage system. Am. J. Physiol. 1992; 263(2 Pt 1): 139-48.

42. Grompe M. The role of bone marrow stem cells in liver regeneration. Semin. Liver Dis. 2003; 23(4): 363-72.

43. Petersen B.E., Grossbard B., Hatch H. et al. Mouse A-6-positive hepatic oval cells also express several hematopoietic stem cell markers. Hepatology 2003; 37: 632-40.

44. Schwartz R.E., Reyes M., Koodie J. et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J. Clin. Ivest. 2002: 109: 1291-302.

45. Черных Е.Р., Останин А.А., Пальцев А.И. Стволовые клетки в регенерации печени: новые подходы к лечению печеночной недостаточности. Гепатология 2004; 5: 24-33.

46. Terada N., Hamazaki T., Oka M. et al. Bone marrow cells adopt

the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 2002; 416: 542-5.

47. Гумерова А.А., Киясов А.П., Калигин М.С. и др. Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 2(4): 39-46.

48. Kiassov A.P., Van Euken P., Van Pelt J.F. et al. Desmin expressing nonhematopoietic liver cells during rat liver development: an immunohistochemical and morphometric study. Differentiation 1995; 59: 253-8.

49. Paku S., Schur J., Nagy P. et al. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am. J. Hepatol. 2001; 158: 1313-23.

50. Киясов А.П., Гумерова А.А., Титова М.А. Овальные клетки -предполагаемые стволовые клетки печени или гепатобласты? Клету-точная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 2(4): 55-8.

51. Suskind D.L., Muench M.O. Searching for common stem cells of the hepatic and hematopoietic systems in the human fetal liver: CD34+ cytokeratin 7/8+ cells express markers for stellate cells. J. Hepatol. 2004; 40: 261-8.

52. Kordes C., Sawitzal J., Miller-Marbach A. et al. CD34 hepatic stellate cells are progenitor cells. Biochem., Biophys. Res. Commun. 2007, 352(2): 410-7.

53. Yang L., Jung Y., Omenetti A. et al. Fate-mapping evidence that hepatic stellate cells are epithelial progenitors in adult mouse livers. Stem Cells 2008; 26(8): 2104-13.

54. Wang P., Liu T., Cong M. et al. Expression of extracellular matrix genes in cultured hepatic oval cells: an origin of hepatic stellate cells through transforming growth factor beta? Liver Int. 2009; 29(4): 575-84.

55. Han Y.P., Yan C., Zhou L. et al. A matrix metalloproteinase-9 activation cascade by hepatic stellate cells in trans-differentiation in the three-dimensional extracellular matrix. J. Biol. Chem. 2007; 282(17): 12928-39.

56. Arthur M.J., Stanley A., Iredale J.P. et al. Secretion of 72 kDa type IV collagenase/gelatinase by cultured human lipocytes. Analysis of gene expression, protein synthesis and proteinase activity. J. Biochem. 1992; 287 (3): 701-7.

57. Schaefer B., Rivas-Estilla A.M., Meraz-Cruz N. et al. Reciprocal modulation of matrix metalloproteinase-13 and type I collagen genes in rat hepatic stellate cells. Am. J. Pathol. 2003; 162(6): 1771-80.

58. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells. Science 1999; 284(5417): 1168-70.

59. Sato Y., Araki H., Kato J. et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood 2005; 106(2): 756-63.

60. Taléns-Visconti R., Bonora A., Jover R. et al. Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. World J. Gastroenterol. 2006; 12(36): 5834-45.

61. Taléns-Visconti R., Bonora A., Jover R. et al. Human mesenchymal stem cells from adipose tissue: Differentiation into hepatic lineage. Toxicol. In Vitro. 2007; 21(2): 324-9.

62. Lange C., Bruns H., Kluth D. et al. Hepatocytic differentiation of mesenchymal stem cells in cocultures with fetal liver cells. World J. Gastroenterol. 2006; 12(15): 2394-7.

63. Киясов A.^, Исламов Р.Р., Ризванов А.А. и др. Клеточная терапия генетически модифицированными стволовыми клетками пуповинной крови трансгенных G93A мышей, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофического склероза. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва: 2007; 65-6.

64. Baba S., Fujii H., Hirose T. et al. Commitment of bone marrow cells to hepatic stellate cells in mouse. J. Hepatol. 2004; 40: 255-60.

65. Hoppo T., Fujii H., Hirose T. et al. Thy1-positive mesenchymal cells promote the maturation of CD49f-positive hepatic progenitor cells in the mouse fetal liver. Hepatology 2004; 39(5): 1362-70.

66. Dezso K., Jelnes P., László V. et al. Thy-1 is expressed in hepatic myofibroblasts and not oval cells in stem cell-mediated liver regeneration. Am. J. Pathol. 2007; 171(5): 1529-37.

67. Tocci A., Parolini I., Gabbianelli M. et al. Dual action of retinoic acid on human embryonic/fetal hematopoiesis: blockade of primitive progenitor proliferation and shift from multipotent/erythroid/monocytic to granulocytic differentiation program. Blood 1996; 88(8): 2878-88.

68. Watt F.M., Hogan B.L. Out of Eden: stem cells and their niches. Science 2000; 287(5457): 1427-30.

69. Колпащикова И.Ф. Общие и местные изменения в организме при экспериментальном повреждении печени и ее регенерации (диссертация). Казань 1982.

70. Marra F., Efsen E., Romanelli R.G. et al. Ligands of peroxisome proliferator-activated receptor gamma modulate profibrogenic and proinflammatory actions in hepatic stellate cells. Gastroenterology 2000; 119: 466-78.

71. Canbay A., Taimr P., Torok N. et al. Apoptotic body engulfment by a human stellate cell line is profibrogenic. Lab. Invest. 2003; 83: 655-63.

72. Safadi R., Ohta M., Alvarez C.E. et al. Immune stimulation of hepatic fibrogenesis by CD8 cells and attenuation by transgenic interleukin-10 from hepatocytes. Gastroenterology 2004; 127(3): 870-82.

73. Viñas O., Bataller R., Sancho-Bru P. et al. Human hepatic stellate cells show features of antigen-presenting cells and stimulate lymphocyte proliferation. Hepatology 2003; 38: 919-29.

74. Wynn, T.A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. J. Pathol. 2008; 214: 199-210.

75. Dai L.J, Li H.Y. The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis. Stem Cell Res. 2009; 2(1): 16-25.

76. Pinzani M. PDGF and signal transduction in hepatic stellate cells. Front. Biosci. 2002; 7: 1720-6.

77. Gressner A.M., Weiskirchen R., Breitkopf K. et al. Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis. Front. Biosci. 2002; 17: 793-807.

78. Wells R.G., Kruglov E., Dranoff J.A. Autocrine release of TGF-beta by portal fibroblasts regulates cell growth. FEBS Lett. 2004; 559(1-3): 107-10.

79. Arthur M.J. Reversibility of liver fibrosis and cirrhosis following treatment for hepatitis C. Gastroenterology 2002; 122: 1525-8.

80. Issa R., Zhou X., Constandinou C.M. et al. Spontaneous recovery from micronodular cirrhosis: evidence for incomplete resolution associated with matrix cross-linking. Gastroenterology 2004; 126: 1795-808.

81. Friedman S.L. Reversibility of hepatic fibrosis and cirrhosis - is it all hype? Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 2007; 4: 236-7.

82. Parekkadan B., Poll D., Suganuma K. et al.. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulmimant hepatic failure. PLoS One 2007; 2(9): e941.

83. Parekkadan B., Poll D., Megeed Z. et al.. Immunomodulation of hepatic stellate cells by mesenchymal stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commu. 2007, 363; 247-52.

84. Poll D., Parekkadan B., Cho C.H. et al. Mesenchymal stem cellderived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology 2008; 47: 1634-43.

85. Sakaida I. et al. Cell therapy with bone marrow cell for liver cirrhosis. Electrophoresis 2006; 50: 7-12.

86. Sakaida I., Terai S., Yamamoto N. et al. Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver fibrosis in mice. Hepatology 2004; 40: 1304-11.

87. Terai S., Sakaida I., Yamamoto N. et al. An in vivo model for monitoring transdifferentiation of bone marrow cells into functional hepatocytes. J. Biochem. 2003; 134: 551-8.

88. Terai S., Ishikawa T., Omori K. et al. Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy. Stem Cells 2006; 24(10): 2292-8.

89. Kuo T.K., Hung S. et al. Stem cell therapy for liver disease: parameters governing the success for using bone marrow mesenchymal stem cells. Gastroenterology 2008; 134: 2111-21.

90. Yu Y., Yao A.H., Chen N., et al. Mesenchymal stem cells overexpressing hepatocyte growth factor improve small-for-size liver grafts regeneration. Mol. Ther. 2007; 15:1382-9.

91. Yagi K., Kojima M., Oyagi S. et al. Application of mesenchymal stem cells to liver regenerative medicine. Yakugaku Zasshi. 2008; 128: 3-9.

92. Киясов А.П.,. Одинцова А.Х, Гумерова А.А. и др. Трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток больным хроническими гепатитами. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2008; 3(1): 70-5.

93. Pulavendran S., Vignesh J., Rose C. Differential antiinflammatory and anti-fibrotic activity of transplanted mesenchymal vs. hematopoietic stem cells in carbon tetrachloride-induced liver injury in mice. Int. Immunopharmacol. 2010; 10(4): 513-9.

94. Theise N.D., Nimmakayalu M., Gardner R. et al. Liver from bone marrow in humans. Hepatology 2000; 32: 11-6.

95. Alison M.R., Poulsom R., Jeffery R. et al. Hepatocytes from non-hepatic adult stem cells. Nature 2000; 406: 257.

96. Kakinuma S., Tanaka Y., Chinzei R. et al. Human umbilical stem cell cord blood as a source of transplantable hepatic progenitor cells. Stem cells 2003; 21: 217-27.

97. Wang X., Willenbring H., Akkary Y. et al. Cell fusion is the principal source of bone marrow-derived hepatocytes. Nature 2003; 422: 897-901.

98. Korbling M., Katz R.L., Khanna A. et al. Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral blood stem cells. N. Engl. J. Med. 2002; 346(10): 738-46.

99. Zhang Z.X., Guan L.X., Zhang K. et al. A combined procedure to deliver autologous mesenchymal stromal cells to patients with traumatic brain injury. Cytotherapy 2008; 10: 134-9.

100. Xiang G.A., Zhang G.Q., Fang C.H. et al. A preliminary study of the homing capacity of allograft mesenchymal stem cells to rat liver. Di Yi Junyi Daxue Xuebao 2005; 25: 994-7.

101. Petersen B.E. Hepatic "stem cells": coming full circle. Blood cells mol. Dis. 2001; 27(3): 590-600.

102. Fox J.M., Chamberlain G., Ashton B.A. et al. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. Br. J. Haematol. 2007; 137: 491-502.

103. Dalakas E., Newsome P.N., Harrison D.J. et al. Hematopoietic stem cell trafficking in liver injury. FASEB 2005; 19(10): 1225-31.

104. Avital J., Inderbitzin D., Aoki T. et al. Isolation, characterization and transplantation of bone marrow-derived hepatocyte stem cells. Bioch., Biophys. Res. Communic. 2001; 288: 156-64.

105. Fiegel H.C., Lioznov M.V. et al. Liver-specific gene expression in cultured human hematopoietic stem cells. Stem cells 2003; 21(1): 98-104.

106. Zhao Y., Glesne D., Huberman E. A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells. PNAS USA 2003; 100: 2426-31.

107. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. Pluripotency of mesenchimal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002; 418: 41-9.

108. Lee K.D., Kuo T.K., Whang-Peng Y et al. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology 2004; 40: 1256-9.

109. Lange C., Bassler P., Lioznov M.V. Liver-specific gene expression in mesenchymal stem cells is induced by liver cells. World J. Gastroenterol. 2005; 11: 4497-504.

110. Ong S.Y., Dai H., Leong K.W. Inducing hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet culture. Biomaterials 2006; 27: 4087-97.

111. Lagasse E., Connors H., Al-Dhalimy M. et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat. Med. 2000; 6: 1229-34.

112. Miyazaki M., Akiyama I., Sacaguchi M. et al. Improved conditions to induce hepatocytes from rat bone marrow cells in culture. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 298: 24-30.

113. Fontanellas A., Mazurier F., Landry M. et al. Reversion of hepatobilary alterations by bone marrow transplantation in a murine model of erythropoietic protoporphyria. Hepatology 2000; 32: 73-81.

114. Chamberlain J., Yamagami T., Colletti E. et al. Efficient generation of human hepatocytes by the intrahepatic delivery of clonal human mesenchymal stem cells in fetal sheep. Hepatology 2007; 46: 1935-45.

115. Camargo F.D., Finegold M., Goodell M.A. Hematopoietic myelomonocytic cells are the major source of hepatocyte fusion partners. J. Clin. Invest. 2004; 113: 1266-70.

116. Willenbring H., Bailey A.S., Foster M. et al., Myelomonocytic cells are sufficient for therapeutic cell fusion in liver. Nat. Med. 2004; 10: 774-48.

117. Russo F.P., Alison M.R., Bigger B.W. et al. The bone marrow functionally contributes to liver fibrosis. Gastroenterology 2006; 130: 1807-21.

118. Fausto N., Webber E.M. Liver regeneration. 2 Role of growth factors and cytokines in hepatic regeneration. FASEB 1995; 9: 1527-36.

119. Galun E., Axelrod J.H. The role of cytokines in liver failure and regeneration: potential new molecular therapies. Biochym. Biophys Acta. 2002; 1592: 345-58.

120. Kinnard T., Stabile E., Burnett M.S. et al. Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arterigenic cytokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis though paracrine mechanisms. Circul. Res., 2004; 94: 678-82.

121. Liu C.H., Hwang S.M. Cytokine interactions in mesenchymal stem cells from cord blood. Cytokine 2005; 32: 270-9.

122. Linker R.A., Kruse N., Israel S. et al. Leukemia inhibitory factor deficiency modulates the immune response and limits autoimmune demyelination: a new role for neutrophic cytokines in neuroinflammation. J. Immunol. 2008; 180: 2204-13.

123. Chen X., Li Y., Wang L. et al.. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production. Neuropathol. 2002; 22: 275-9.

124. Ren X., Colletti L. et al. Stem cell factor restores hepatocyte proliferation in IL-6 knockout mice following 70% hepatectomy. J. Clin. Invest. 2003; 112: 1407-18.

125. Langer D.A., Das A., Semela D. et al. Nitricoxide promotes caspase-independent hepatic stellate cell apoptosis through the generation of reactive oxygen species. Hepatology 2008; 47: 1983-93

126. Marubashi S., Sakon M., Nagano H. et al. Effect of portal hemodynamics on liver regeneration studied in a novel portohepatic shunt rat model. Surgery 2004; 136: 1028-37.

127. Fausto N., Riehle K.J. Mechanisms of liver regeneration and their clinical implications. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 2005; 12: 181-9.

128. Ren G., Zhang L., Zhao X. et al.. Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide. Cell Stem Cell 2008; 2: 141-50.

129. Mohamadnejad M., Namiri M., Bagheri M. et al. Phase 1 human trial of autologous bone marrow-hematopoietic stem cell

transplantation in patients with decompensated cirrhosis. World J. Gastroenterol. 2007; 13: 3359—63.

130. Yagi H., Soto-Gutierrez A., Navarro-Alvarez N. et al. Reactive bone marrow stromal cells attenuate systemic inflammation via sTNFRI. Mol. Ther. 2010; 18(10): 1857-64.

131. Honczarenko M., Le Y., Swierkowski M. et al. Human bone marrow stromal cells express a distinct set of biologically functional chemokine receptors. Stem Cells, 2006, 24, 1030-1041.

132. Lee M.J., Jung J., Na K.H. et al. Anti-fibrotic effect of chorionic plate-derived mesenchymal stem cells isolated from human placenta in a rat model of CCl(4)-injured liver: potential application to the treatment of hepatic diseases. J. Cell Biochem. 2010; 111(6): 1453-63.

133. Gasbarrini A., Rapaccini G.L., Rutella S et al. Rescue therapy by portal infusion of autologous stem cells in a case of drug-induced hepatitis. Dig. Liver Dis. 2007; 39: 878-82.

134. Knoefel W.T., Klein M. et al. Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration. Stem Cells 2005; 23: 463-70.

135. Kallis Y.N., Alison M.R., Forbes S.J. Bone marrow stem cells and liver disease. Gut 2007; 56: 716-24.

136. Mohamadnejad M., Alimoghaddam K., Mohyeddin-Bonab M. et al. Phase 1 trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated liver cirrhosis. Arch. Iran Med. 2007; 10: 459-66.

137. Carvalho A.B., Quintannilha L.F., Dias et al. Bone marrow multipotent mesenchymal stem cells do not reduce fibrosis or improve function in a rat model of severe chronic liver injury. Stem Cells 2008; 26: 1307-14.

138. Peng L., Li H., Gu L. et al. Comparison of biological characteristics of marrow mesenchymal stem cells in hepatitis B

patients and normal adults. World J. Gastroenterol. 2ВД7; 1З: 174З—Б.

1З9. Fox I.J., Strom S.C. To be or not to be: generation of hepatocytes from cells outside the liver. Gastroenterology 2ВДВ; 1З4: В7В—В1.

14^. Zhang Z.X., Guan L.X., Zhang K. et al. Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro. Cell Biol. Int. 2ВД7; З1: 645—8.

141. Dugast A., Vanhove B. Immune regulation by non-lymphoid cells in transplantation. Clin. Exp. Immunol. 2ВД9; ^БИ): 25—34.

142. Aziz M.T., Atta H.M., Mahfouz S. et al. Therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on experimental liver fibrosis. Clin. Biochem. 2ВД7; 4^: В9З—9.

143. Zhao D.C., Lei J.X., Chen R. et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells protect against experimental liver fibrosis in rat. World J. Gastroentrol. 2005; 14: З4З1—4^.

144. Fang B., Shi M., Liao L. et al. Systemic infusion of FLK1 + mesenchymal stem cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice. Transplant. 2ВД4; 7В: ВЗ—В.

145. Murphy F.R., Issa R., Zhou X. et al. Inhibition of apoptosis of activated hepatic stellate cells by tissue inhibitor of metalloproteinase—1 is mediated via effects on matrix metalloproteinase inhibition. J. Biol. Chem. 2Ш2; 277: 1ЮБ9-7Б.

14Б. Higashiyama R., Inagaki Y., Hong Y.Y. et al. Bone marrow-derived cells express matrix metalloproteinases and contribute to regression of liver fibrosis in mice. Hepatology 2ВД7; 4S: 21З—22.

147. Bonzo L.V., Ferrero I., Cravanzola C. et al. Human mesenchymal stem cells as a two-edged sword in hepatic regenerative medicine: engraftment and hepatocyte differentiation versus profibrogenic potential. Gut 2ВДВ; S7: 22З—З1.

Поступила 25.02.2011