CC BY
57
Вместе с тем, на среде ЧуЗ, одновременно с развитием корней, отмечено увядание верхних листьев, отмирание верхушечной части регенеранта.
Спустя 28-40 суток культивирования у регенерантов формировалась нормально развитая корневая система. Такие растения высаживали в стерильный субстрат на адаптацию в условия in vivo.
Выводы
Таким образом, экспериментально установлено соотношение ГК3 и БАП в питательной среде, их сочетание и концентрации, индуцирующие множественное адвентивное побегообразование черешни исследуемых сортов в культуре in vitro. Лучшие результаты регенерации микропобегов были получены на питательных средах PS и В5, дополненных 2,224,44 мкМ БАП и 0,73-2,16 мкМ ГК3. В результате изучения ризогенеза выявлена зависимость корнеобразования от регуляторов роста, а также от генотипа исходного растения-донора.
Список литературы
1. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. -М.: Наука., 1964. - 272 с.
2. Калинин Ф.Л. Технология микроклонального размножения растений / Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир, В.В. Сарнацкая. - К.: Наукова думка, 1992. - 232 с.
3. Методы биотехнологии в селекции и размножении субтропических и косточковых плодовых культур / Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Смыков А.В., Лесникова Н.П. // Труды Никит. ботан. сада. - 1999. - Т. 118. - С. 189-199.
4. Изучение вирусов и вирусных болезней косточковых плодовых культур на юге Украины и особенности оздоровления растений in vitro / Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Ежов В Н. и др. // Тр. Никит. ботан. сада. - 2005. - Вып. 91 - С. 111-120.
5. Вирусы, поражающие косточковые плодовые культуры, и биотехнологические пути создания устойчивых форм / Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Митрофанова И.В., Кузнецова Н.В. // Бюресурси та вiруси: V Miжнар. конф. Кшв, 10-13 верес. 2007 р. - Кшв: Фггосоцюцентр, 2007. - С. 182.
6. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 1968. - Vоl. 46. - № 5. - Р. 417-421.
7. Gregor Osters, Luthar Zlata, Stampak Franci. The importance of the sterilization proceducing vigorous cherry plants (Prunus sp.) in vitro // Acta agriculturae slovenica. - 2004. - Vol. 83. - P. 45-51.
8. Sauer Annemarie. In vitro - Vermehrung verschiedener genotypen von Prunus avium L. // Gartenbauwissenschaft. - 1983. - Bd. 48. - S.124-127.
9. Snir Iona. In vitro micropropagation of sweet cherry cultivars // Hort. Science. - 1982. - Vol. 17. - № 2. - P. 735-736.
10. Quoirin M., Lepoivre Ph. Etude de milieux adaptés aux cultures in vitro de Prunus // Acta Hort. - 1977. - Vol. 78. - Р. 437-442.
11. Yang H. Einflub verschiedener Auxine auf die in vitro - Bewurzelung von Subkirschen // Gartenbauwissenschaft. - 1994. - Bd. 59. - S. 45-47.
Рекомендовано к печати д.б.н., проф. Митрофановой О.В.
РОСТОВАЯ И БИОСИНТЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ AGASTACHERUGOSA O. KUNTZE
Т.В. МАЗУР
Центральный ботанический сад НАН Беларуси, г.Минск, Республика Беларусь
Введение
В настоящее время для получения биологически активных веществ растительного происхождения успешно используют культуру клеток и тканей in vitro [1, 7, 10]. При культивировании клеток in vitro возможно создание условий, позволяющих выделить отдельные новые штаммы клеток с устойчивой направленностью метаболизма на синтез веществ вторичного происхождения. Особое внимание уделяется исследованиям, в которых
изучается взаимосвязь синтеза вторичных метаболитов с ростом культуры и концентрацией фитогормонов в среде культивирования. Одними из наиболее распространенных в растении веществ вторичного происхождения являются фенольные соединения, широко применяемые в современной фармакотерапии [2].
Известно, что для получения биологически активных веществ используют суспензионные культуры [5, 6, 7].
Agastache rugosa O. Kuntze содержит ряд биологически активных веществ, обладающих атерогенным эффектом, а также имеющих антивирусную, капилляроукрепляющую, противовоспалительную и спазмолитическую активность [2, 8]. Однако среди доступной научной литературы отсутствовали какие-либо публикации, посвященные исследованию этой культуры в условиях in vitro.
Поэтому целью настоящей работы было получение суспензионной культуры A. rugosa и выявление взаимосвязи между биосинтетической и ростовой активностью суспензионной культуры данного вида.
Объекты и методы исследования
Многоколосник морщинистый Agastache rugosa относится к роду многоколосников Agastache Clayt. Ex Cronow семейства яснотковых Lamiaceae. Зеленая масса A. rugosa содержит такие биологически активные вещества, как тилианин, акацетин, апигенин, розмариновая и хлорогеновая кислоты.
Для получения каллусной культуры использовали листовые и стеблевые экспланты A. rugosa в культуре in vitro. Каллусную ткань инициировали и выращивали на среде Мурасиге-Скуга с добавлением различных концентраций ауксинов - 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), индолилуксусной кислоты (ИУК) и цитокининов - бензиламинопурин (БАП), кинетин.
Суспензионную культуру A. rugosa получали из рыхлого каллуса, перенося его в жидкую среду МС, с различным содержанием гормонов. При разработке метода получения суспензионной культуры из стеблевого и листового каллуса A. rugosa установлено, что добавление 0,5 мг/л 2,4-Д в сочетании с 0,1 мг/л БАП в среду культивирования, является оптимальным для активной пролиферации клеток.
Культивировали суспензионную культуру в круглодонных колбах при 23-240С на роторной качалке (100-110 об/мин). Пассирование культуры на свежую питательную среду проводили с интервалом 16-25 дней.
В течение цикла выращивания клеток определяли следующие параметры: сырую и сухую массу, плотность, жизнеспособность клеток, общее содержание фенольных соединений.
Для определения массы суспензии клетки отделяли от питательной среды с помощью вакуумного насоса и взвешивали до и после высушивания, которое проводили в сушильном шкафу при температуре 600 С. Количество клеток в суспензионной культуре измеряли каждые вторые сутки, в течение всего пассажа, в камере Фукса-Розенталя. Для этого клетки предварительно мацерировали 20%-м раствором хромовой кислоты при 600С в течение 15 мин.
Жизнеспособность клеток определяли после окрашивания 0,1%-м раствором нейтральным красным. Живыми считались клетки, цитоплазма которых прокрашивалась в течение 20 мин.
Общее содержание фенольных соединений определяли в свободных клетках, а также в среде их инкубирования методом Фолина-Чокальтеу [3]. Для построения калибровочного графика была использована галловая кислота. Измерения проводили на спектрофотометре Agilent 8453 при длине волны 765 нм в кювете толщиной 1 см.
Результаты и обсуждение
Необходимым условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее в каллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Инициация каллусообразования зависит от соотношения эндогенных гормонов эксплантов и экзогенных гормонов питательной среды [4, 10]. Интенсивный каллусогенез листовых и стеблевых эксплантов A. rugosa наблюдали на питательной среде, содержащей 2 мг/л ИУК и 0,3 мг/л кинетина, а также на среде
с добавлением 1 мг/л 2,4-Д в сочетании с БАП в концентрации 0,1 мг/л (табл. 1). На среде, содержащей 2 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л БАП, отмечена активная инициация каллусогенеза листовых эксплантов. Однако для стеблевых эксплантов характерна более интенсивная инициация каллусогенеза по сравнению с листовыми. Первичный каллус эксплантов был плотной консистенции. Для наращивания большей массы каллусной ткани и получения рыхлого каллуса его несколько раз пассировали на среду МС с добавлением 1 мг/л 2,4-Д и 0,1 мг/л БАП.
Суспензионные культуры имеют S-образную форму роста клеток, включающую лаг-фазу, экспоненциальную, стационарную и фазу деградации. Форма ростовых кривых разных культур отличается продолжительностью фаз. Это зависит от генетики популяции, количества инокулюма и состава питательной среды. Скорость нарастания биомассы клеток для разных суспензионных культур колеблется от 15 до 70 суток [1].
Оптимальные условия культивирования клеток A. rugosa определяли по жизнеспособности клеток на всех этапах роста культуры. Наибольшая жизнеспособность клеток приходилась на экспоненциальную фазу роста и достигала 80%.
При рассмотрении динамики нарастания стеблевой и листовой суспензионной культуры A. rugosa (рис. 1, 2) отмечено неодновременное их вступление в экспоненциальную фазу роста (на 4 и 6 сутки, соответственно). На 8 сутки культивирования листовая суспензионная культура вступала в экспоненциальную фазу роста, а на 15 сутки - в стационарную. На 20 сутки начиналась фаза деградации клеток (рис. 2).
Таблица 1
Каллусогенная активность листовых и стеблевых эксплантов многоколосника морщинистого на разных питательных средах
Гормональный состав среды культивирования, мг/л Интенсивность
Среда ИУК Кинетин БАП 2,4-Д каллусогенеза
лист стебель
I 1 0,2 - - + +
II 2 0,2 - - + +
III 3 0,2 - - - +
IV 1 0,3 - - + ++
V 2 0,3 - - ++ +++
VI 3 0,3 - - + ++
VII 1 0,5 - - + +
VIII 2 0,5 - - + ++
IX 3 0,5 - - + +
X - - 0,1 0,5 + ++
XI - - 0,1 1 ++ +++
XII - - 0,1 2 +++ +
Примечание: + - интенсивность каллусогеной активности эксплантов.
Рис. 1. Динамика роста листовой и стеблевой суспензионной культуры A. rugosa по
сухой биомассе
Стационарная фаза роста клеток для стеблевой суспензионной культуры началась на 14 сутки. Установлено, что ростовой цикл полученных листовой и стеблевой культур составляет 16 и 25 суток. Таким образом, латентная фаза длилась трое и шестеро суток. В экспоненциальной фазе роста, которая длилась 12 суток (лист) и 8 суток (стебель), клетки активно делятся. Характер роста кривой листовой и стеблевой суспензионной культуры отличается длительностью фаз роста. Согласно результатам исследований, представленным на рис. 2, внутриклеточное содержание фенольных соединений через 4 суток после начала инкубации возрастало незначительно - от 0,99 мг до 1,36 мг/г (в 1,3 раза) для стеблевой суспензионной культуры. Затем, в течение 8 суток (период интенсивного роста культуры), концентрация фенольных соединений в клетках менялась от 1,36 до 3,4 мг/г. На 16 сутки инкубирования суспензии наблюдали интенсивное увеличение внутриклеточного содержания фенольных соединений - до 4,8 мг/г. Для листовой суспензионной культуры количество фенольных соединений в конце культивирования составляло 3,6 мг/г сухой массы. Одновременно изучали зависимость оптической плотности среды инкубации от времени инкубирования клеток суспензионной культуры. Характер кривой аналогичен зависимости внутриклеточного содержания фенольных соединений от времени роста культуры. Таким образом, одновременно с синтезом фенольных соединений в клетках происходит их экскреция в среду инкубации.
■ Число клеток в 1 мл
■ количество ФС
m
* ю
о <
н о
Ш тс * ^
о с
о
1 -г 0,8 -■ 0,6 -■ 0,4 -■ 0,2 -■ 0 --
-Г 5
t
-■4 5
о"
4 з ^
о m
-+-
-+-
-+-
-+-
-+-
-■ 2 -■ 1
0
3 6 9 12 15 19 23 25 время культивирования, сутки
А
■ Число клеток в 1 мл
количество ФС, мг/г сух. в-ва
ш
* ю
о <
н о
ф 1ц *
О Ц
О
10 -Г 8 -6 -4 -2 0
Б
0 2 4 6 8 10 12 14 16 время культивирова ния, сутки
Рис. 2. Зависимость содержания фенольных соединений от плотности суспензионной листовой (А) и стеблевой (Б) суспензионной культуры
0
Показано, что наиболее интенсивный синтез фенольных соединений в клетках суспензионной культуры A. rugosa происходит на тех этапах роста культуры, когда кривая роста клеток соответствует стационарной фазе роста и фазе деградации клеток. Протекание активных ростовых процессов в суспензионной культуре не коррелирует с синтезом фенольных соединений, который активируется с экспоненциальной фазы роста и продолжается в стационарной и фазе деградации клеток.
Выводы
Разработан метод индукции активной пролиферирующей каллусной культуры, что позволило подобрать оптимальные условия получения и культивирования суспензионной культуры A. rugosa. Выявлены условия синтеза и экскреции фенольных соединений клетками суспензионной культуры при сохранении высокой жизнеспособности клеток данной культуры. Показано, что наиболее активный синтез фенольных соединений происходит во время замедления ростовых процессов в стационарной фазе роста суспензионной культуры.
Список литературы
1. Демидова Е.В., Решетняк О.В., Орешников А.В., Носов А.М. Ростовые и биосинтетичсекие характеристики культивируемых клеток женьшеня ползучего при глубинном выращивании в биореакторах //Физиология растений. - 2006. - Т. 53, №1. - С. 148-154.
2. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях. - М.: Наука, 1993.
3. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова. - Л., 1987. -С.117-119.
4. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. - Киев: Наукова думка, 1990.
5. Benzothiadiazole enhances the elicitation of rosmarinic acid in a suspension culture of Agastache rugosa O. Kuntze / Kim H.K., Oh S-R., Lee Y-K., Huh H. // Biotechnology Letters. - 2001. - Vol. 23. - P. 55-60.
6. Induction of rosmarinic acid in cell suspension cultures of Orthosiphon aristatus after treatment with yeast extract / Sumaryono W., Proksh P., Hartmann T., Nimtzs M., Wray V. // Phytochemistry. - 1991. - Vol. 30. - P. 3267-3271.
7. Mizukami H., Tabira Y., Ellis B.E. Induction of rosmarinic acid biosynthesis in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures // Plant cell Rep. - 1993. - Vol. 12. - P.706-709.
8. Vogelmann J. E. Flavonoids of Agastache section Agastache. Biochemical Systematic and Ecology. - 1984. - Vol. 12, №4. - P. 363-366.
9. Berl W. J. Secondary products from plant cell cultures // Biotechnology. - 1986. - Vol. 4. - P. 630-658.
10. Feher A. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 2003. - Vol.74. - P. 201-228.
Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.
БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
БИОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ POLEMONIUM
CAERULEUM Ь. В ФАРМАКОЛОГИИ
А.В. БАШИЛОВ Центральный ботанический сад НАН Беларуси, г.Минск, Беларусь
Введение
В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал по терапевтическому действию лекарственных растений Республики Беларусь, но, к сожалению недостаточно данных о химическом составе физиологически активных веществ многих растений. Отсутствует нормативно-техническая документация, определяющая точные сроки сбора растительного материала, при которых накопление действующих веществ было бы максимально; неизвестна динамика изменений химического состава в процессе хранения воздушно-сухого растительного сырья. К группе таких растений следует отнести синюху голубую (Polemonium caeruleum Ь).
P. caeruleum Ь. относится к группе сапонинсодержащих лекарственных растений. Содержит в корневищах с корнями тритерпеновые пентациклические сапонины группы амирина (сапонозид, полимонозид В, полимонозид А), обладает высокой гемолитической активностью. Агликоны полимонозидов достаточно необычны. Чаще всего это эфиры высокогидроксилированных тритерпеновых спиртов (лонгиспиогенола, барригенола,
