CC BY
20
ЭКОЛОГИЯ
УДК: 582.288.45:576.8.097.21:541.54
РОСТ И РАЗВИТИЕ МИКРОМИЦЕТОВ НА РАЗНЫХ ТИПАХ КРАХМАЛА И МОДИФИКАЦИЯХ СОЕВОЙ МУКИ
М.С. Поломошных, А.Н. Лихачев, А.А. Попов
(Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, кафедра микологии и альгологии биологического факультета МГУ)
Переработка полимерных отходов путем пиролиза, сжигания, захоронения не всегда экономически и экологически оправдана. Для более быстрого старения и разрушения полимерных материалов в их матрицу вводят различные окислители, хромофоры, которые способствуют фрагментации макромолекул под влиянием УФ-лучей и других факторов (Фомин, Гузеев, 2001). В другом случае исследуют возможность создания композитных смесей пластика, способных разрушаться под влиянием микроорганизмов-деструкторов. В качестве смесевого компонента наиболее часто используют крахмал как доступный и легко восполнимый источник сырья (Власова, Макаревич, 2001; Патент Японии № 2720424, 1998). Однако несмотря на единую эмпирическую формулу, в зависимости от исходного сырья, виды крахмала могут отличаться соотношением содержания в них основных полисахаридов — амилозы и амилопектина, декстринов, составом зольных элементов, белка, рядом других соединений и быть доступными в качестве источников питания для микодеструкторов.
Цель настоящей работы — исследование возможности роста на разных типах крахмала и соевой муке микромицетов-биодеструкторов, влияние их на прочностные характеристики композиционных смесей получаемого с сополимером этилена и винилацетата в качестве синтетической матрицы.
Материалы и методы
В качестве питательной среды для культивирования микромицетов-биодеструкторов использовали водные суспензии 1%-х крахмалов, агаризо-ванную и жидкую среду Чапека при добавке тех же концентраций. Использованы следующие типы крахмала: кукурузный, пшеничный, гороховый, растворимый картофельный и ряд модифицированных крахмалов на основе кукурузного — кар-боксимитил крахмал (КМК), фосфатный и кати-онный, а также соевая мука и ее модификации.
Тест-объектом служили штаммы Aspergillus niger v. Tiengh., A. terreus Thom., A. flavus Link:Fr., Chaetomium globosum Kunze, Penicillium funiculosum
Thom., P. erevi-compactum Diereckx, P. purpurogenum Stoll., P. chrysogenum Thom., Trichoderma viride Pers.: Fr., Paecilomyces variotii Bainier., Stachybotrys chartarum Hughes, Botrytis cinerea Pers.:Fr., рекомендованных ГОСТ 9.049-91 для испытания грибостойко-сти полимеров. В качестве контроля взята среда Чапека. Возможность потребления данными видами микромицетов на агаризованных средах разных типов крахмала оценивали по началу и интенсивности спороношения через каждые двое суток в течение 12 дней. Накопление биомассы биодеструкторами при стационарной инкубации культур в 20 мл водных суспензий различных типов крахмала и соевой муки определяли весовым методом, отделив предварительно плавающие вверху среды пленки и фрагменты мицелия от нерастворимых фракций крахмала и муки. Инкубация культур проводилась в течение 12 дней при 26—27° при изначальном рН среды 6—6,5. Внесение инокулю-ма на агаризованные среды крахмала и муки проводили уколом, на жидкие — примерно равными кусочками фрагментов мицелия со спороношени-
Степень развития и интенсивность спороношения видов микромицетов на разных типах крахмала
Тип крахмала Степень развития и интенсивность спороношения на 4-е сутки, (в баллах)
A. niger Т. viride A. flavus P. ere-vicom-pactum P. purpuro-genum P. chry-soge-num Botry-tis cinerea
Пшеничный 4 4 4 2 3 2 2
Кукурузный 3 3 3 2 3 2 2
Картофельный 2 2 2 2 1 2 1
Гороховый 2 2 2 2 1 1 1
Фосфатный 1 1 1 0 0 0 0
КМК 0 0 0 0 0 0 0
Катионный 0 0 0 0 0 0 0
Контроль 5 5 5 4 5 4 4
ем. Степень развития культур на агаризованной среде оценивали визуально и микроскопически по 5-балльной шкале: 0 — отсутствие проросших конидий и развития мицелия; 1 — прорастание конидий и образование лишь мелких очагов мицелия в виде отдельных пятен, спороношение отсутствует; 2 — поверхностное развитие мицелия в виде многочисленных пятен, спороношение отсутствует; 3 — обильное разрастание мицелия на поверхности среды, начало спороношения; 4 — при визуальном осмотре отчетливо виден сплошной рост мицелия и спороношение; 5 — зарастание мицелием всей площади среды при наличии интенсивного спороношения.
Результаты
и их обсуждение
Динамика развития видов микромицетов на агаризованных типах крахмала при одинаковых условиях инкубации и равном их содержании различна и особенно четко проявляется к моменту формирования спороношения. Из 11 культур только 7 наиболее активно развивались на разных типах крахмала. Наиболее быстрое начало роста (на 2-е сутки) и формирование спороношения (на 3—4 сутки) характерно для А. niger, Т. утйв на пше-
ничном и кукурузном крахмале. Меньшая скорость роста и формирования спороношения отмечена на картофельном и гороховом крахмалах, слабое развитие всех тест-культур грибов выявлено на фосфатном крахмале. На КМК и катионном крахмале формирования спороношения у тест-культр не отмечено (таблица). Вероятно, низкая растворимость крахмалов, зависящая от соотношения амилозы и амило-пекина, а также разная активность амилолитических ферментов исследуемых видов определяют скорость развития и формирования морфологических структур.
Данные визуальной оценки подтверждаются динамикой накопления биомассы, представленной на рис. 1.
Накопление биомассы на крахмалах, взятых в качестве единственного источника питания, у разных видов неодинаково, что, вероятно, связано с их биологическими особенностями, активностью ферментов, а также доступностью элементов этих субстратов. Возможно, что низкая активность а-амилазы, снижающая вязкость, наличие связанных липидов, определяющих растворимость
«
о В О-
Рис. 2. Накопление биомассы видами микромицетов на соевых субстратах. 1 — среда Чапека, 2 — соевая мука, 3 — соевый концентрат (90%), 4 — соевый изолят (70%), 5 —
пшеничный крахмал
зерен крахмалов и образующих амилозо-липидные комплексы, понижают водосвязывающую и набухающую их способность, что отражается на доступности белков и аминокислот этих субстратов (Андреев, 2001). При этом крахмал как труднорастворимое вещество способствует более медленному изменению рН среды при росте грибов. На это указывают и результаты большего накопления биомассы грибов на минеральной среде Чапека по сравнению с крахмалами, взятыми в качестве единственного источника питания.
Потенциальным компонентом в смесевых составах пластика может служить и соевая мука или ее модификации. Ее часто используют в составе сред для получения антибиотиков или других биологически активных веществ (Семенов, 1990). Для проведения опытов взяты необез-жиренная соевая мука, соевый концентрат (содержание белка 70%, влагосвязывающая способность 1:4) и соевый изолят (содержание белка 90%, влаго-связывающая способность 1 : 6) фирмы "Майкон" в качестве единственного источника питания в количестве от 10 до 40% от массы синтетического полимера.
Накопление биомассы видами микромицетов при росте на соевых субстратах по сравнению с крахмалом и средой Чапека представлены на рис. 2, из которого видно, что на соевой муке и ее модификациях происходит большее накопление биомассы у всех тест-культур по сравнению с пшеничным крахмалом. Однако и в этом случае доступность экзо-
генных, растворимых источников питания углерода и азота в исследуемых субстратах по сравнению со средой Чапека обусловливает и меньшее накопление на них биомассы. На необходимость наличия экзогенного источника азота, определяющего скорость выхода конидий из состояния покоя А. niger и последующий темп его развития, указано в работе Морозовой (Морозова, 2003). Отметим также, что мелкие зерна крахмала более устойчивы к кислотному и ферментативному гидролизу. Пшеничный крахмал состоит из двух фракций — крупной (крахмал А) и мелкозернистой (крахмал Б). Такое распределение зерен оказывает влияние на структуру, термодинамические, реологические характеристики и степень набухания зерен (Андреев, 2001).
Влагоемкость нативных крахмалов и воздействие на них высокой температуры при получении композитной смеси пластика являются также факторами, способными определять его обрастание. На рис. 3 показана влагопоглощающая способность различных типов крахмала, определенная весовым методом при выдерживании крахмалов одинаковой массы при 100%-й влажности в течении 120 ч. Как видно из рис. 3, наибольшей вла-
Рис. 3. Влагоемкость типов крахмала при разной экспозиции в условиях 100%-й относительной влажности воздуха. 1 — картофельный крахмал, 2 — гороховый крахмал, 3 — пшеничный крахмал, 4 — фосфатный крахмал, 5 — кукурузный крахмал
Рис. 4. Накопление биомассы тест-культур на пшеничном крахмале и пшеничном декстрине: 1 — пшеничный крахмал, 2 — пшеничный декстрин
гопоглощающей способностью обладает картофельный крахмал, затем гороховый, пшеничный, фосфатный и кукурузный. При воздействии на крахмал 120° в течение 3 ч происходит частичный гидролиз крахмала — разрыв регулярной упаковки амилозной цепочки, уменьшение молекулярной массы и образование новых а-1,6 связей, которые указывают на наличие разветвления в структуре амилопектина, таким образом способствуя образованию менее прочной структуры полимерной упаковки крахмала, что должно облегчить грибам доступ к углероду (Квеститадзе, 1984). Как видно из рис. 4, термическая обработка крахмала не приводила к значительному повышению накопления биомассы у тест-культур, а декстрины, вероятно, образующиеся при таком режиме, мало влияют на рост грибов.
Распределение дисперсной фазы наполнителя, в данном случае соевой муки, в структуре полимера и влагоемкость полученной смеси могут влиять на обрастание смеси пластика. В качестве испытуемого полимера был выбран севилен марки 111, содержащий 6—10% винилацетатных (ВА) групп ТУ 6-05-1636-97. В данном полимере отмечена лучшая равномерность распределения добавок с увеличением ВА групп (Сычугова, Лихачев, Колесникова, 2003). Предварительно соевую муку и соевые модификации пластифицировали глицерином в соотношении 2:1, выдерживали 30 мин, а затем смешивали на смесителе с полимером при 120° и 50 об/мин в течение 4 мин. Содержание добавки варьировалось от 10 до 40 масс.%. Необходимость использования обработки глицерином объясняется высокой температурой смешивания.
Рис. 5. Зависимость водопоглощения смеси полимера и соевой модификации от вида и количества добавки: 1 — соевая мука, 2 — соевый концентрат, 3 — соевый изолят
Глицерин слабо ингибирует рост микроорганизмов и входит в состав некоторых питательных сред (Семенов, 1990).
Создание композиционного материала предполагает и изучение ряда физических характеристик: степень водопоглощения пленок, разрывной прочности, относительного удлинения, определяющих экспуатационные возможности. Показатель степени во-допоглощения измерялся весовым методом при выдерживании пленок полимера в дистиллированной воде с различным количеством добавки в течение суток. Полученные данные представлены на рис. 5, на котором видно, что при увеличении содержания добавки степень водопог-лощения увеличивается практически линейно. Различная степень поглощения исследуемых композитных материалов с различными добавками объясняется разной площадью поверхности раздела фаз. В случае использования в качестве добавки соевого изолята (содержание белка 90%) вкрапления более крупнодисперсные по сравнению с соевой мукой и соевым концентратом и площадь поверхности раздела фаз меньше и соответственно меньше степень поглощения.
Прочностные характеристики полученных композиционных материалов представлены на рис. 6 и 7. Испытания проводились по стандартному методу исследования (ГОСТ 270, ГОСТ 262) на динамометре 1ш1хоп 1122.
Как видно из полученных графиков, использование в качестве биодеструктируемой добавки соевого изолята (содержание белка 90%) значительно ухудшает прочностные характеристики полученного композиционного материала вследствие увеличения площади поперечного сечения образца. В данном случае добавка представляет собой крупнодисперсные включения, нарушающие однородность материала. Добавление соевого концентрата (содержание белка 90%) и соевой муки в меньшей степени ухудшает исследуемые показатели. Зависимость прочности на разрыв и относительного удлинения линейная и уменьшается пропорционально увеличению содержания добавки.
Предварительные испытания роста грибов на агаризированной соевой муке и ее модификациях
Рис. 6. Разрывная прочность образцов с добавкой соевых модификаций: 1 — соевый концентрат, 2 — соевая мука, 3 — соевый изолят
Рис. 7. Относительное удлинение образцов смесей севилена и соевых модификаций: 1 — соевая мука, 2 — соевый концентрат, 3 — соевый изолят
при их содержании от 1 до 40 масс.% от объема показали, что рост тест-объектов наиболее интенсивно происходит при содержании не менее 10 масс.%. Использование концентрации добавок в полимерные смеси в качестве питательной среды свыше 40 масс.%, вероятно, является нецелесообразным из-за увеличения стоимости такого материала.
Проведенные исследования показали, что наиболее оптимальными компонентами в составе смеси полимера могут являться соевая мука и соевый концентрат (содержание белка 70%). Содержание данных добавок в количестве 10—30 масс.% незначительно влияют на физические характеристики пластика согласно ТУ 6-05-1636-97. Наиболее интенсивное накопление биомассы из взятого набора потенциальных биодеструкторов отмечено у штаммов Aspergillus niger, Trichoderma viride и A. flavus, которые могут служить тест-объектами для испытания грибостойкости композиционных материалов, содержащих сополимер этилена и ви-нилацетата в качестве синтетической матрицы и соевую муку либо соевый концентрат.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Андреев Н.Р. 2001. Основы производства на-тивных крахмалов. М.
Власова Г., Макаревич А. 2001. Биораз-лагаемые пластики в индустрии упаковки // Биоразла-гаемые пластики. Технологии переработки и упаковки. № 8 // propack.by.ru/technologii 42^Мт1.
ГОСТ 262-93.1993. Определение упруго-прочностных свойств резин при растяжении.
ГОСТ 270-75.1975. Резина. Определение сопротивления раздиру.
ГОСТ 9.049-91.1992. Материалы полимерные и их компоненты. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов.
Квеститадзе Г.И. 1984. Грибные и бактериальные амилазы. Тбилиси.
Морозова Е.В. 2003. Прорастание, хранение и химический состав конидий Aspergillus niger van Ti-enghem. — продуцента лимонной кислоты: Автореф. канд. дисс. М.
Патент Японии № 2720424. 1998.
Семенов С.М. 1990. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов ВО. М.
Сычугова О.В., Лихачев А.Н., Колесникова Н.Н. 2003. Рост и развитие микро-мицетов на сополимере этилена и винилацетата с добавками крахмала // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 4. С. 27—31.
Фомин В.А., Гузеев В.В. 2001. Биоразла-гаемые полимеры: состояние и перспективы использования // Пластические массы. № 2. С. 42—46.
Поступила в редакцию 23.01.05
GROWTH AND DEVELOPMENT FUNGUS
ON DIFFERENT TYPE OF STARCHES AND SOY MODIFICATIONS
M.S. Polomoshnyh, A.N. Likhachev , A.A. Popov
This investigates deal with selection of a composite of a mix is lead from among different kinds of starch and a soy modifications on the basis of growth and development on them fungus — biodestructers. The additive of a soy flour and soy concentrate to plastic in quantity of 10—30 weights %, not reducing physical properties of a material and promotes the most intensive them development kinds Aspergillus niger, A. flavus and Trichoderma viride.
