CC BY
54
ВЕСТНИК ТГГПУ. 2011. №3(25)
УДК 612.833+591.51
РОЛЬ ЦИКЛИЧЕСКОГО АДЕНОЗИНМОНОФОСФАТА В РЕГУЛЯЦИИ МЕМБРАННОГО И ПОРОГОВОГО ПОТЕНЦИАЛОВ КОМАНДНЫХ НЕЙРОНОВ У ОБУЧЕННЫХ УЛИТОК
© А.Н.Головченко, Т.Х.Гайнутдинова, Х.Л.Гайнутдинов
В статье были исследованы эффекты аппликации неспецифического ингибитора фосфодиэстеразы 1ВМХ и мембранопроникающего аналога циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) - 8-Вг-цАМФ на изменение мембранных характеристик командных нейронов виноградной улитки на препаратах обученных и интактных улиток. Было найдено, что увеличение концентрации цАМФ разными способами приводит к изменению лишь мембранного потенциала, но не порогового потенциала исследуемых нейронов. Это говорит о том, что изменения этих параметров идут по разным механизмам и в изменении мембранного потенциала, по-видимому, участвует аденилатцик-лазная система, при этом сами механизмы остаются неизвестными, но непременно должны выражаться через ионные каналы.
Ключевые слова: цАМФ, условный оборонительный рефлекс, мембранный потенциал, пороговый потенциал, 1ВМХ, 8Вг-цАМФ, улитка.
Аденилатциклазная система является универсальной внутриклеточной сигнальной системой.
Она вовлечена в разные этапы образования памяти при сенситизации или пресинаптическом облегчении, вызываемом как стимуляцией нервов, так и аппликацией серотонина [1; 2]. Внутриклеточная концентрация циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) находится под контролем двух противоположно направленных действий и опосредуется относительной активностью аденилатциклазы, образующей цАМФ из АТФ, с одной стороны, и фосфодиэстеразы, разрушающей циклический нуклеотид с образованием 5'АМФ - с другой. ЦАМФ является неотъемлемым компонентом аденилатциклазной системы [3], поэтому было интересно посмотреть роль этого циклического нуклеотида в функционировании командных нейронов виноградной улитки при обучении. Существует прямая взаимосвязь между электрической активностью командных нейронов оборонительного поведения и пластическими модификациями поведения, что свидетельствует о сложной динамике изменений электрических характеристик командных нейронов при обучении [4; 5]. С другой стороны, существует целый ряд работ, посвященных эффектам цАМФ на электрические характеристики нейронов и токи ионных каналов [6; 7].
Показано, что внутриклеточная инъекция цАМФ либо его мембранопроникающего аналога, а также увеличение активности протеинкина-зы А приводят к усилению сенситизации и ассоциативного обучения [2; 8; 9]. Однако нет ясности в том, какие текущие функции нейрона поддерживает или обеспечивает аденилатциклазная
система после выработки условного рефлекса. Поэтому нами была поставлена задача - провести исследование роли системы цАМФ в функционировании командных нейронов при обучении виноградной улитки.
Материалы и методы
Наиболее удачным объектом для различных физиологических, фармакологических и
биологических исследований общих свойств
нейронных структур в настоящее время считаются моллюски. В нашей лаборатории все эксперименты проводились на наземном легочном моллюске рода Helix - Helix lucorum [4]. В эксперименте использовали половозрелых особей, однородных по весу и размеру. На протяжении экспериментов разные группы (опытные и контрольные) содержались в
одинаковых условиях.
Работа включала две части - поведенческую (выработка условного оборонительного
рефлекса) и электрофизиологическую
(регистрация мембранного и порогового
потенциалов).
Для выработки условного оборонительного рефлекса (УОР) использовали сочетание условного (УС) и безусловного (БС) стимулов. В качестве УС служило постукивание по раковине, которое в норме не вызывает оборонительной реакции у улитки, БС служило вдувание струи воздуха в отверстие легочной полости, что вызывало у животных безусловную оборонительную реакцию закрытия пневмостома. В день предъявлялось не менее 30 сочетаний УС и БС. Результатом такого обучения являлось полное закрытие пневмостома в ответ на УС.
Анализ электрических характеристик идентифицированных командных нейронов оборонительного рефлекса закрытия пневмостома ППаЗ, ППа2 и ЛПаЗ, ЛПа2, находящихся в правом и левом париетальных ганглиях, осуществляли на изолированном препарате нервной системы на другой день после обучения. Перед приготовлением препарата ЦНС улитки для анестезии помещали в смесь воды со льдом на 15-30 минут. Электрофизиологические измерения проводились по стандартной методике с применением внутриклеточных стеклянных микроэлектродов, заполненных раствором электролита (2,5М раствора КС1). В ходе эксперимента регистрировали потенциал покоя (Уш), пороговый потенциал (VI;). Значение мембранного потенциала покоя измеряли, когда клетка находилась в невозбужденном состоянии. Пороговый потенциал определяется как разница между мембранным потенциалом и значением потенциала, при котором генерируется потенциал действия (в этот момент первая производная потенциала по времени достигает определенного значения, в нашем случае это была величина 1 В/сек) [10].
Для изменения внутриклеточной концентрации цАМФ проводили аппликацию неспецифического ингибитора фосфодиэстеразы 1ВМХ (3-изобутил 1-метилксантин) в концентрации 2^10 4 М/л и мембранопроникающего аналога цАМФ 8-Вг-сАМР в концентрации 10 4 М/л в раствор, омывающий препарат нервной системы. Контролем служили результаты, полученные в этих же группах улиток в физиологическом растворе
(ФР).
Результаты статистически обрабатывались с применением 1-критерия Стьюдента, приведены среднее значение и стандартная ошибка среднего (М ± 8БМ).
Результаты и обсуждение
Мембранный и пороговый потенциалы нервных клеток играют важную роль при таких пластических модификациях нервной системы, как условный оборонительный рефлекс. Выработка условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки сопровождается снижением этих величин в командных нейронах (рис.1а, б, значения в ФР).
Результаты с аппликацией 1ВМХ в раствор препарата обученных улиток показал, что 1ВМХ приводит к деполяризации мембраны командных нейронов. Мембранный потенциал у обученных улиток с исходного уровня -56,2±1,1 мВ достоверно снизился до -51,3±1,6 мВ (р<0,05, рис.1а). У контрольных (интактных) улиток различия были недостоверны Уш с -59,2±0,7мВ изменился до -57,5±1,3 мВ (рис.1б), что вызвано малой ак-
тивностью фосфодиэстеразы, которая увеличивает лишь в результате повышения уровня цАМФ. Пороговый потенциал во всех группах достоверно не менялся.
-\/т, мВ
-\Лп, мВ
Рис.1. Значение мембранного потенциала (Уш) командных нейронов у контрольных (а) и обученных улиток (б) при аппликации 1ВМХ * - достоверное отличие от значений в ФР (р<0,05).
Регуляция активности фосфодиэстераз является важным механизмом, которым многие клетки организма модулируют свою приспособительную активность к внешним воздействиям. Возможно, у обученных улиток происходит долговременное увеличение активности фосфодиэ-стераз, и их ингибирование приводит к изменению установившегося баланса синтеза и распада цАМФ. Результаты показывают, что одним из механизмов участия аденилатциклазной системы в сохранении результатов ассоциативного обучения может быть увеличение активности фосфо-диэстеразы цАМФ. Однако нужно отметить, что 1ВМХ, являясь неспецифическим ингибитором, блокирует как цАМФ-метаболизирующие, так и цГМФ-метаболизирующие изоформы фосфодиэ-стераз [3]. Поэтому нельзя исключать, что эффект 1ВМХ может быть частично опосредован и воздействием на гуанилатциклазную систему.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Применение 8Бг-цАМФ приводит к снижению мембранного потенциала командных нейронов оборонительного поведения. Мембранный потенциал нейронов в группе интактных улиток (п=8), с исходного уровня -59,4±0,4 мВ, через 30 минут после добавления 8Бг-цАМФ уменьшался до -55,7±1,1 мВ (р<0,05, рис.2а) и в группе обученных улиток (п=9) с -56,1±0,6 мВ до -52,5±1,5 мВ (р<0,05, рис.2б). При этом 8Бг-цАМФ не изменяет пороговый потенциал нейронов. Не было найдено отличий в эффектах мембранопроникающего аналога цАМФ 8Бг-цАМФ между группами контрольных улиток и улиток после выработки УОР. Таким образом, увеличение концентрации цАМФ в командных нейронах оборонительного поведения не выявляет различий в чувствительности этих нейронов к цАМФ у контрольных и обученных улиток.
-Ут, мВ 62
8Вг-цАМФ
-Vm, мВ
Рис.2. Значение мембранного потенциала (Уш) командных нейронов у контрольных (а) и обученных улиток (б) при аппликации 8-Бг-цАМФ.
* - достоверное отличие от значений в ФР (р<0,05).
Использование в нашей работе ІБМХ, 8Бг-цАМФ, повышающих содержание цАМФ раз-
ными способами (ингибирование фосфодиэсте-раз и увеличение непосредственно содержания цАМФ) приводил к деполяризационному сдвигу мембранного потенциала исследуемых нейронов, при этом пороговый потенциал достоверно не менялся. Это свидетельствует о том, что изменения этих параметров идут по разным механизмам и в изменении мембранного потенциала, по-видимому, участвует аденилатциклазная система, при этом сами механизмы остаются неизвестными, но непременно должны выражаться через ионные каналы.
1. Гринкевич Л.Н., Топоркова Л.Н., Лисачев П.Д., Изварина Н.Л. Роль G-белков и систем вторичных посредников в пластичности оборонительного рефлекса у виноградной улитки // Журн. высш. нервн. деят. - 1996. - Т.46. - №5. - С.886-891.
2. Hawkins R.D. Kandel E.R., Bailey C.H. Molecular mechanisms of memory storage in Aplysia // Biol Bull. - 2006. - Vol.210. - №.3. - P.174-191.
3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: в 2 т. - М.: Мир. - 1993.
4. Гайнутдинов Х.Л., Андрианов В.В., Гайнутдинова Т.Х. Мембранные механизмы пластичности поведения при обучении. - Казань: ООО "Печатный двор", 2002. - 115 с.
5. Балабан П.М. Клеточные механизмы пластичности поведения в простых нервных системах // Рос. физиол. журнал им.И.М. Сеченова. - 2007. - Т.93.
- №5. - С.521-530.
6. Кононенко Н.И., Костюк П.Г. Влияние внутриклеточной инъекции циклического аденозинмо-нофосфата на кальциевый ток в идентифицированных нейронах виноградной улитки // Нейрофизиология. - 1982. - Т.14. - №3. - С.290-297.
7. Levitan, E.S., Levitan I.B. Serotonin acting via cyclic AMP enhances both the hyperpolarizing and depolarizing phases of bursting pacemaker activity in the Aplysia neurons R15 // J. Neurosci. - 1988. - Vol.8.
- №4. - P. 1152-1161.
8. Cedar H,. Kandel E.R, Schwartz J.H. Cyclic adenosine monophosphate in the nervous system of Aplysia californica. I. Increased syntheses in response to synaptic stimulation // J. Gen. Physiol. - 1972. - Vol.60.
- P.558-569.
9. Klein M., Shapiro E., Kandel E.R. Synaptic plasticity and the modulation of the Ca2+ current // J. Experim. Biol. - 1980. - Vol.89. - P.117-157.
10. Береговой Н.А. Электрофизиологический анализ мембранных механизмов долговременной сенси-тизации: автореф. дис. ... канд. биолог. наук. -Новосибирск, 1996. - 20 с.
THE ROLE OF CYCLIC ADENOSINE MONOPHOSPHATE IN REGULATION MEMBRANE AND THRESHOLD POTENTIALS OF COMMAND NEURONS OF LEARNED SNAILS
A.N.Golovchenko, T.Kh.Gainutdinova, Kh.L.Gainutdinov
The authors of the article studied the effects of application of nonspecific inhibitor of phosphodiesterase IBMX and membrane permeable analog of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) - 8-Br-cAMP on changing of membrane characteristics of command neurons in the preparations of learned and naive snails. It was found out that the increase of cAMP’s concentration by various means led to changing only of membrane potential, but not of threshold potential of studied neurons. These results argue that changes of these parameters are held by different mechanisms. Probably, the adenylate cyclase system of snails takes part in changes of membrane potential, but the exact mechanism is not known. It may mean that these mechanisms are connected with ion channels.
Key words: cAMP, defensive conditioned reflex, membrane potential, threshold potential, IBMX, 8Br-cAMP, snail.
Головченко Александра Николаевна - аспирант лаборатории биофизики Казанского физико-технического института Казанского научного центра РАН.
E-mail: golovtchenkoan@mail.ru
Гайнутдинова Татьяна Халиловна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биофизики Казанского физико-технического института Казанского научного центра РАН.
E-mail: tat-gain@mail.ru
Гайнутдинов Халил Латыпович - доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией биофизики Казанского физико-технического института Казанского научного центра РАН.
E-mail: kh_gainutdinov@mail.ru
Поступила в редакцию 03.05.2011
