CC BY
49
Проф. Л.А. Косых, проф. П И. Цапок, к.б.н. Е.В. Луценко, к.м.н. С.А. Арасланов РОЛЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ В МЕХАНИЗМАХ РЕЗОРБЦИИ ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ
Кировская государственная медицинская академия
В настоящее время исследованиями многих авторов убедительно показано, что фиброз и цирроз печени обратимы. В определенных уело виях соединительная ткань, избыточно разрос шаяся при хроническом гепатите и циррозе пече ни, может подвергаться резорбции, а структура печени восстанавливаться. Однако механизмы регуляции процессов восстановления и резорб ции фиброза остаются наиболее сложными и наименее изученными. Изучается роль системы иммуногенеза, нервной системы, эндокринной регуляции, роль межтканевых взаимоотношений в регенерирующей печени. С этой целью предла гаются различные методы стимуляции регенера- ционного процесса как модели, на которых изу чаются механизмы регенерации. Одним из таких методов является облучение области печени красным светом различного спектрального диа пазона.
В настоящем исследовании была выбрана именно данная модель, позволяющая понять роль свободнорадпкальных реакций в механиз мах резорбции соединительной ткани в процес се регенерации нормальной и патологически из мененной печени. Обоснованием выбранной мо дели явились данные о том, что облучение крас ным светом гелий-неонового лазера (1-15 мВт/см в течение 30 с - 15 мин) надчревной об ласти у крыс снижало уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в митохондриях и клетках печени (Н.Д. Девятков и др., 1987). По другим данным, облучение гелий-неонового ла зера (ГНЛ) вызывает реактивацию супероксид- дисмутазы, предварительно инактивированную в кислой среде (Е.А. Горбатенкова, Ю.А. Влади миров и др., 1989). С.М. Зубкова с соавт. (1981) и другие исследователи считают, что важную роль в адсорбции излучения ГНЛ играет гемсо- держащий фермент каталаза, у которой хромо форная группа в активном центре имеет в обла сти 628 нм один из максимумов поглощения энергии. При облучении происходит активация этого фермента. Полагают, что супероксиддис- мутаза и каталаза являются основными фермен тами, нейтрализующими активные формы кис лорода и перекиси, образующиеся при повреж дении клеток печени. Известна активация ГНЛ церулоплазмина, выделенного из плазмы чело века (Л.А. Александрова и др., 1989). Как счита ют авторы, в механизм фотореактивации этого белка вовлечены ноны Си +, т. к. их связывание снимает эффект активации.
В печени крыс после резекции и предвари тельного облучения ГНЛ и гамма-лучами мито- тический индекс гепатоцитов увеличивается с 10,3±3,0% до 18,1 ±2,4%. Лазерное облучение крыс с хроническим гепатитом уменьшает явле ния белковой и жировой дистрофии гепатоци тов, способствует уменьшению некрозов и вое палительной инфильтрации печени (М.Ф. Попо ва и др., 1985).
Как показали дальнейшие исследования, низ коинтенсивное лазерное излучение при действии на биоткани вызывает широкий спектр фотофи зических и фотохимических изменений, что оп ределило использование его в физио- и рефлек сотерапии для стимуляции жизненно важных процессов при лечении многих заболеваний (В.Е. Илларионов, 1992), в том числе хроничес ких заболеваний печени (Ф.А. Ильхамов и др., 1990). Лазеротерапия, проведенная у больных с повреждениями печени после оперативных вме шательств, способствовала более ранней норма лизации иммунологических показателей крови и восстановлению адекватной моторно-эвакуатор- ной функции желудочно-кишечного тракта. Эф фект наступал уже через 3-4 часа после первого сеанса. Лазеротерапия позволила также снизить количество гнойных осложнений с 28,5 до 14,7% (Р.Б. Алиханов и др., 1997).
В научном обзоре «Роль антиоксидантных механизмов в реакциях организма на действие низкоинтенсивного лазерного излучения» Л.Л.Гончарова с соавт. (1994) приходит к выводу, что влияние лазерного излучения на анти окислительные и свободнорадикальные процес сы может осуществляться как непосредственно поглощением света определенными фоторецеп торами, так и опосредованно - через адаптив ные механизмы, в частности, нейроэндокрин- ные. Однако им не принадлежит исключитель ная роль в генерализации лазерного излучения. Актуальными являются исследования механиз мов прямого действия низкоинтенсивного крас ного света на антиокислительные и свободнора дикальные процессы.
В настоящем исследовании показана роль свободнорадпкальных и антиоксидантных про цессов в механизмах резорбции соединительной ткани печени при облучении эпигастральной об ласти низкоинтенсивным красным светом види мого диапазона (600-750 нм).
Эксперименты проведены на белых беспород ных крысах обоего пола. У животных вызывали токсический хронический гепатит путем введе ния им подкожно 65% раствора тетрахлормета- на в дозе 0,1 мл на 100 г массы тела 4 раза в не делю. Всего сделано 20 инъекций. Одной группе животных после прекращения введений токсина область эпигастрия облучали красным светом в течение 2-х мин. ежедневно. Количество сеансов изменялось в зависимости от срока забоя от 2-х до 10-ти. Мощность источника излучения соста вила 13,32 мВт, площадь облучаемой поверхно сти 4 см2. Плотность потока
мощности 3,3 мВт/ см2. Доза облучения за один сеанс составила 0,396 Дж/см2. Поглощенная доза за один сеанс с учетом коэффициента пропускания составила около 0,142 ±0,223 Дж/см .
Вторая группа животных с хроническим гепа титом служила контролем. Забой животных обе их групп производили через 2, 3, 7 и 30 сут. пос ле окончания введения токсина.
В сыворотке крови животных определяли продукты перекисного окисления липидов хеми-люминесцентным методом по максимальному показателю фотовспышки 1 , дающемулоцеукул
содержатгия-1 терттчнБТХЛТлдуктов ПОЛ. Оценка конечных п род у к fo в НОЛпроиз водилась по со держанию малонового диальдегида (МДА). Ак тивность антиоксида лн оТГггПст е мы ТА.ОС) оце нивали методом х е м и л ю м иТгестГе н ци и по показа телю светосуммы "за 60 секундТ£)- Ее величина указывает на содержание радикалов, находя щихся в конце цепи свободнорадпкальных реак ций, и поэтому обратно пропорциональна анти- оксидантной активности (Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. 1972). Кроме того, антиокриЯан- тную активность оценивали по отношению WS/I (К.Н. Конторщикова, 2000) и по содержани)»-ц£- рулоплазмина (ЦП), как одного из основных ферментативных антиоксидантов.
Состояние соединительной ткани оценивали по содержанию гидроксипролина (метод J. Bergman, R. Loxley, 1970, в модификации А.А. Косых, 1974) и гексозаминов (метод R. Gatt. E.R. Berman, 1966) в ткани печени, а также на гистологических срезах, окрашенных по Ван- Гизон, с последующим морфометрическим анализом объемной плотности волокнистых структур.
Результаты исследований ПОЛ у животных с хроническим гепатитом после окончания введе ний гетрахлорметана (табл. 1) показали сниже ние 1ш на 16,5%, а содержание МДА также име ло некоторую тенденцию к снижению. В то же время при почти неизмененных показателях S и lm/S содержание церулогшазмина в 2,5 раза пре вышало нормальные величины. Эти данные сви детельствуют об активации АОС при патологии и практически полной компенсации свободнора дпкальных реакций. Облучение красным светом эпигастральной области уже через 2-е суток сти мулировало реакции свободнорадикального окисления и АОС. Показатель I увеличился по-
m J
чти на 18%, а содержание МДА почти в 4 раза снизилось по сравнению с контрольными живот ными (Р <0,05). Однако активность АОС у облу ченных животных в этот период оказалась зна чительно выше, чем у необлученных. Показатель S снизился по сравнению с контролем в 1,4 раза при неизменном показателе I /S, а содержа ние церулоплазмина превысило уровень конт рольных животных в 6 раз.
В течение первой недели показатели хемилю- минесценции сыворотки крови у облученных животных закономерно снижались. Показатель I снизился к 7 суткам на 11% по сравнению с контролем. Уровень МДА в этот период снизил ся более, чем в 2 раза, а содержание церулоплаз мина в 5 раз превысило уровень контроля при неизменных показателях S и I /S.
П1
Г руппа Животных Срок I забоя 1 (сут) Im (ими.) л I МДА 1 мкмоль/ V. Мл 7 ( S (ими.) V / / Im/S л vy Церулоплазмин (мг/ л)
Интактные 188+12,3 10,2+1,78 2753+2Г7,2 0,070 +0,006 212,6 +3,57
Хр .гепатит (контроль) 0 157 ±6,5 9,3 ±1,51 2646+ 228,7 0,062 +0,003 527,2 +50,06
2 163 ±8,1 25,2 ±4,35 3598 +441,0 0,047+ 0,005 47,8 +9,22
3 168+ 6,2 21,7 ±1,05 3216 +126,4 0,052 +0,000 64,1+ 4,94
7 164 ±7,2 18,1 + 0,87 2627 +321,1 0,056+ 0,005 62,1 +8,34
30 160 ±15,0 17,3 ±1,31 2890 +394,8 0,056+ 0,003 62,3 +4,78
Хр .гепатит + облучен 2 192 ±11,7 6,6+ 1,24 2646+ 228,7 0,055 +0,004 293,1 +47,05
3 158 ±3,6 6,2 +0,66 3086 +87,3 0,051 +0,001 374,1 +30,59
7 148 ±3,9 8,3 +1,86 2680 +67,3 0,057 +0,001 315,0 +48,71
30 185 ±6,8 5,2 +0,77 3059 +285,5 0,061 +0,004 226,0 +54,54
Таблица 1
Динамика показателей перекисного окисления липидок н активное уконтрольных животных с хроническим гепатитом
ги ан гиоксилантнои снег и облучеш
)луче 1 цм;гк
35
3*
К 30 суткам у облученных животных, полу чивших по 10 сеансов фототерапии, показатели хемилюминесценции сыворотки крови нормали зовались, содержание МДА снизилось, и было в 3 раза ниже, чем у контрольных животных на этот срок и даже ниже, чем в норме почти в 2 раза. Нормализация процессов свободноради кального окисления проходила на фоне практи чески полной нормализации активности АОС. Все показатели АОС не отличались от нормаль
ных (Р >0,05). В то же время у контрольных жи вотных такой нормализации не произошло. По казатель I не отличался от исходной величины,
ГП
полученной после окончания затравки живот ных тетрахлорметаном, а содержание МДА по чти в 2 раза превышало исходный уровень и в 1,7 раза превышало норму. Процессы свободно- радикального окисления протекают на фоне сниженной активности АОС. Показатели в и 1ш/8 не отличаются от исходных, а содержание церулоплазмина оказалось ниже исходных зна чений в 8,5 раза и ниже уровня нормы более, чем в 3 раза.
Приведенные данные свидетельствуют о не которой активации свободнорадикальных про цессов в первые 2-е суток под влиянием облуче ния области печени красным светом и соответ ственно повышения активности АОС. В последу ющие сроки происходит подавление процессов ПОЛ на фоне повышенной активности АОС. К 30-м суткам у облученных животных все показа тели ПОЛ и АОС приходят к норме.
У животных с хроническим гепатитом содер жание соединительной ткани по данным морфо- метрии увеличилось почти в 2 раза (табл.2), со держание гидроксипролина в ткани печени воз росло в 1,4 раза, а содержание гексозаминов - в 1,7 раза по сравнению с нормой (Р <0,05).
Через 2-е суток после окончания введений тетрахлорметана у контрольных животных по всем изучаемым показателям состояния соеди нительной ткани в печени достоверных измене ний не произошло, хотя и наметилась тенденция к снижению. У облученных животных в этот пе риод отмечалось значительное снижение уровня гидроксипролина в ткани печени (в 3 с лишним раза), уровня гексозаминов в 1,5 раза и сниже ние объемной плотности соединительной ткани почти в 2 раза.
В течение первой недели (3-й и 7-е сутки) у облученных животных существенных изменений в содержании гидроксипролина в ткани печени не произошло. Его уровень оставался ниже, чем у контрольных животных и ниже, чем в норме. У необлученных животных в этот период также происходит достоверное снижение уровня гид роксипролина, но значительно меньше, чем у облученных. Содержание гексозаминов в печени облученных животных к концу недели снижает ся в 2,6 раза по сравнению с исходным уровнем и в 2,8 раза по сравнению с контролем на этот же срок. При этом объемная плотность соедини тельной ткани у облученных животных практи чески нормализовалась, а у контрольных необлученных крыс сохранялась на исходных показателях.
К 30-м суткам содержание гидроксипролина и гексозаминов в печени облученных животных оставалось ниже нормальных значений, а объем ная плотность волокнистых структур нормали зовалась (Р >0,05). У контрольных необлучен ных животных все изучаемые показатели были значительно выше нормального уровня и прак тически не отличались от исходных на высоте развития патологии, т.е. сразу после окончания введений тетрахлорметана.
Таким образом, полученные данные свиде тельствуют о том, что при хроническом гепати те наступает некоторая стабилизация уровня ПОЛ, что компенсируется повышением активно сти АОС. В течение месяца после отмены токси на на фоне подавленной активности АОС не сколько активируются процессы ПОЛ, о чем свидетельствуют данные по содержанию в сыво ротке крови МДА, отражающих уровень конеч ных продуктов ПОЛ. Об отсутствии активных восстановительных процессов в печени, повреж денной тетрахлорметаном, говорят и данные по состоянию соединительной ткани. Нормализа ции структуры печени за этот период не проис ходит.
Таблица 2
Динамика основных показателей соединительной ткани печени крыс схроническим гепатитом и после облучения
Г руппа Животных Срок забоя (сут) Рст. (усл.ед.) Г идрокси-нролин мг/г Г ексозамины Мг/г Относит, масса печени (%)
Интактные Хр. 0,109±0,014 1,94±0,11 * 9,59+0,63* 3,44±0,12
гепатит 0 0,192±0,023* 2,63±0,26* 16,05±2,74* 4,01+0,29
2 0,217±0,095* 2,03±0,18 13,71±1,13* 4,00+0,22*
3 0,205 ±0,006* 1,56±0,21 17,22±1,58* 4,22±0,25
7 0,175±0,044 1,26±0,17* 17,38±1,62* 3,96+0,17
30 0,232+0,059* 2,13±0,19 13,33±1,73* 3,10+0,08
Хр.гепатит + 2 0,106±0,024 0,86±0,10* 10,79±2,32 4,17±0,50*
облучение 3 0,171 + 0,044 1,00±0,17* 10,08± 1,71 3,12±0,3 1
7 0,105±0,034 0,93+0,16* 6,14± 1,37 3,67+0,15
30 0,198±0,035 * 1,31+0,18* 7,08±0,63 3,01 ±0,18
Примечание: *- различия достоверны по сравнению с нормой (Р <0,05)
Облучение области печени красным светом уже после двух сеансов вызвало увеличение пер вичных продуктов реакции ПОЛ и активацию АОС, что способствовало значительной пере стройке соединительной ткани органа, сниже нию объемной плотности волокнистых струк тур. Наиболее значительные изменения в состо янии соединительной ткани печени после облу чения произошли в ее биохимических показате лях. Содержание гидроксипролина. отражающе го уровень коллагенизации
стромы, значительно снизилось и нормализовалось только к концу месяца, т.е. после прекращения облучения. Реак ция основного вещества соединительной ткани, о чем свидетельствуют данные по уровню гексо заминов. была аналогичной. Самые низкие по казатели гексозаминов были также к концу неде ли, когда животные получили 7 сеансов облуче ния. К 30-м суткам изучаемые показатели при близились к уровню интактных животных. Ха рактерно, что уровень церулоплазмина - белка, вырабатываемого гепатоцитами и являющегося одним из основных ферментативных антиокси- дантов, был значительно выше, чем у конт рольных необлученных животных. Этот факт свидетельствует об активации АОС под влияни ем облучения.
Следовательно, облучение области печени светом красного диапазона вначале усиливает реакции свободнорадикального окисления, ак тивирует АОС. а затем подавляет перекисное окисление липидов и, тем самым, предохраняет гепатоциты от повреждения, блокируя фиброге- нез. Более конкретные механизмы влияния крас ного света на процессы фиброгенеза и фиброк- лазии в печени объяснить пока не представляет ся возможным. Однако на основании литератур ных данных и собственных исследований можно высказать некоторые соображения.
Во-первых, одним из биоэффектов красного света спектрального диапазона 600-750 нм явля ется стимуляция синтеза ДНК и РНК (Т.П. Кару. 1986, 1989). Действительно, в первые 48 часов после начала облучения происходит не которое увеличение относительной массы пече ни, что связано, в основном, с пролиферацией гепатоцитов. По нашим данным, в печени в этот период наблюдается масса митозов (С.А. Арас- ланов, 2001). Вероятной причиной этих измене ний является индукция активных форм кислоро да (Е.В. Луценко, 2002).
Во-вторых, как показали исследования Л.А. Буткова и М.А. Савченковой (1983). красный ла зер стимулирует функции соединительной ткани и снижает активность фактора, ингибирующего миграцию макрофагов. Низкие дозы излучений ГНЛ стимулируют фагоцитарную активность как полиморфноядерных, так и мононуклеарных лейкоцитов (1. Гига, 3. НиЬасек, 1996). Примене ние красного света (0,62 - 0,66 мкм) мощностью 2,5 мВт в импульсном режиме стимулирует фаго цитарную активность нейтрофилов перифери ческой крови у крыс (О.В. Столбовская и др., 1999). Ранее нами было показано, что одним из механизмов резорбции избыточно разросшейся соединительной ткани при хроническом гепати те и циррозе печени является активация клеток Купффера (А.А. Косых, 1992). В то же время при облучении области печени красным светом на ультрамикроскопическом уровне нами была об наружена фрагментация и разволокнение колла- геновых волокон в непосредственной близости от клетки Купффера.
Ли терату ра
I. Александров а Л.А., Басиладзе Л.И., Шибуневич Л.В., Жуманкулов М.С. Фотоактивирующее действие излучения 11 К-\ К лазера на церулоплазмин человека: Цит. по Н.Ф.Гамалея, отв. ред. Действие низкоэнер гетического лазерного излучения на кровь. Киев. - 1989,- С.3-4.
2Али.ханов Р.Б., Нестеров А О. Лазеротерапия в комплексном лечении больных с повреждениями пе- чени//Студ. мед. наука - 97: Матер, конф. ММСИ. М„ 1997. С.53.
ЪАраелсшов С.А. Влияние оптического излучения в спектральном диапазоне 0,6 0,75 мкм на соедини тельную ткань регенерирующей печени в норме и при хроническом токсическом гепатите / Автореф. дисс. канд., М. 2001.
4.Бутков Л.А.. Савченкова М.А. Влияние излуче ния ГНЛ на общую регенерационную способность и клеточную иммунную реактивность человека//Т ез. докл. Всесоюзной конф. по применению лазеров в меяпткже. Красноярск, 1983. - С. 107.
(/ 5. /Владимиров Ю .4., Арчаков А.И. Перекисное окттсйение липидов в биомембранах. М., 1972.
6.Гончарова Л.Л.. Покровская Л.А.. Ушкова И.П., Малькова 11. Ю. Роль антиоксидантных механизмов в реакциях организма на действие низкоинтенсивного лазерного излучения / Международные медицинские обзоры. 1994. Т. 2,- № 1. - С. 15-19.
7.Горбатеикова ЕА., Владимиров Ю.А., Парамо нов 11.В.. Азизови О.А. Красный свет гелий-неонового лазера реактивирует суперосиддисмутазу//Бюлл. экс- перим. биолог ии и медицины. - 1989,- Т.107. № 3. С.302-305.
8.Девятков 11.Д., Зубкова С.М.. Лапрун И. Б.. Ма кеева 11. С. Физико-химические механизмы биологи ческого действия лазерного излучения// Успехи совр. биологии, 1987. Т. 103,- № 1. С.31-43.
9.Зубкова С.М.. Лапрун П. Б., Соколова ЗА., Попов В.И Окислительные и синтетические процессы в тка ни печени и головного мозга при воздействии облу чения гелий-неонового лазера// Науч. докл. высш. школы. Биол. науки. -1981. - № 4. С.24-31.
10Илларионов В.Е. Основы лазерной терапии,- М.: Изд-во «Респект» Объединения «ИНОТЕХ-Про- гресс», 1992.
- 123 с.
ПИльхимов Ф.А., Поетолов А.П.. Калим Ю.И., Макаров К.И. Низкоэнергетическое лазерное излуче ние в хирургии печени и желчевыводящих путей//Сов. медицина, 1990. - № 3,- С.34-37.
12Кару Т.Н. О молекулярном механизме терапев тического действия излучения низкоэнергетического лазерного света // Докл. АН СССР. - 1986. Т.291. № 5,- С. 1245-1249.
\ЪКару Т.Н. Регуляция клеточного метаболизма низкоинтенсивным лазерным светом//Методы лазер ной биофизики и их применение в медицине: Матер, докл. 1-й республиканской школы-семинара. - Тарту, 1989. - С. 15-22.
( 14. Копторщикова КН. Перекисное окисление ли- кЦщж/в норме и патологии: Учебное пособие. Ниж ним Новгород, 2000. - С.21.
15КосыхАА. Модифицированный метод опреде ления оксипролина в моче//Лабораторное дело. - 1976. -№ 12. -С. 715-717.
1 бКосых А.А. Соединительная ткань печени в норме, при хроническом гепатите и циррозе в услови ях
регенерации: Автореф. дисс. докт. мед. наук. - М. 1992.
17 Л уценка ЕВ. Влияние оптического излучения спектрального диапазона 6000750 им на евободнора- дикальные процессы печени в ходе ее регенерации / Автореф. дисс.канд. Киров - 2002.
ISIJonoea М.Ф., Зубкова СМ., Л струн И. Б. и др. Процессы восстановления в 7ПО-облученной ткани печени при профилактическом применении лазерно го излучения // Сравнительные аспекты изучения ре генерации и клеточной пролиферации. - М., 1985,- 4.2. - С.242-245.
\9.Столбовская О.В., Софронова Л.А., Сыч В.Ф. и др. 11 Материалы междунар. конгресса «Лазер и здоро вье - 99»,-1999. - С. 483-484.
20Bergman J., Loxley R. The determination of hydroxyproline in urine hydrolysates// Clin. Chem. acta. - 1970." № 2, P.347-349.
21.Gall R . Bermcm. A rapid procedure for the estimation of amino sugar on a micro scale / Analyt. Biochem. - 1966. -Vol. 15. P.167-171.
22Luza J.. Hubacek J. In vitroIle-Ne laser effekt on some immunological functions of the polymorphonuclears and monocytes in rabbits// Acta Univ. Palacki. Olomuc. Fac. Med. - 1996,- Vol. 140. - P.43-46.
Summary
THE ROLE OF FREE RADICAL REACTIONS
IN MECHANISMS OF LIVER FIBROSIS RESORBTION
A.A. Kosykh, P.I. Tsapok, Ye.V. Lutsenko, S.A. Araslanov Kirov State Medical Academy
Red light irradiation causes changes in different organs. The pathogenesis of these changes is not quite clear. The current study is devoted to analysis of the influence of red light irradiation on the levels of serum ceruloplasmin and malonic dialdehid as well as hydroxyprolin and hexosamins in livers of rats with chronic hepatitis caused by CCL4. On the second day of red light irradiation, the level of malonic dialdehid of serum was 4 times lower than in the control group (P<0,05). The level of serum ceruloplasmin was 7 times lower than in the control group on the second day of red light irradiation (P<0,05). The maximum reduction of the level of liver hydroxyprolin and hexosamins was seen on the 30th day after the beginning of red light irradiation. The amount of connective tissue became normal. The above results show that red light irradiation decreases POL due to the increase of ceruloplasmin and decrease of malonic dialdehid. Red light irradiation of visible range results in great decrease of connective tissue of the fibrotic liver. These changes may be connected with decrease of POL levels.
