Роль стэкинг-взаимодействий в комплексах белков с аденини гуанинсодержащими лигандами Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

УДК 577.32

Роль стэкинг-взаимодействий в комплексах белков с аденин- и гуанинсодержащими лигандами

Т. В. Пырков1, 2#, Д. В. Пыркова1, Е. Д. Балицкая1,3, Р. Г. Ефремов1 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова 2Московский физико-технический институт (государственный университет)

3Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова,

#е-таН: pyrkov@nmr.ru

ВВЕДЕНИЕ

Биологическая функция белков часто определяется взаимодействием с низкомолекулярными соединениями - их лигандами и субстратами. При этом белки выступают, соответственно, в роли рецепторов и ферментов. Знание молекулярных основ взаимодействия рецепторов с лигандами, в частности - пространственной структуры комплекса белок-лиганд, является важнейшей предпосылкой к пониманию функции белка и его роли в биохимических процессах, регулирующих жизнедеятельность клетки. Кроме того, знание такой структуры дает возможность осуществлять на практике рациональное конструирование прототипов лекарственных соединений, которые, как правило, являются лигандами для определенных белков-мишеней в организме.

Инструментальные методы определения пространственной структуры белков и их комплексов с лигандами, такие как рентгеноструктурный анализ и спектроскопия ЯМР,

имеют ряд существенных ограничений. Часто получение структуры комплекса белка с лигандом оказывается затруднительным даже в случае, когда структура самого белка уже известна. Особенно остро проблемы, связанные с экспрессией и кристаллизацией, встают при исследовании трансмембранных белков, которые включают важнейший класс G-белок сопряженных рецепторов. Некоторый оптимизм внушают последние успехи на данном направлении - расшифровка структуры бета-адренергического и аденозинового рецепторов [1].

Технические трудности, сдерживающие применение экспериментальных подходов, привели к развитию методов компьютерного молекулярного моделирования. Одним из таких методов является «докинг» (от англ. docking - стыковка) - алгоритм, позволяющий вписать лиганд в трехмерную структуру белка-рецептора и оценить достоверность предсказанной таким образом структуры комплекса. На сегодняшний день метод до-

кинга активно применяют для исследования структурнофункциональной роли аминокислотных остатков белков, для поиска новых лекарственных соединений, селективно действующих на определенные белки-мишени [2, 3].

Развитие метода докинга происходит за счет применения новых алгоритмов конформационного поиска и новых методов оценки энергии межмолекулярных взаимодействий (оценочных функций, ОФ). ОФ могут иметь различный вид и включать либо термы межмолекулярных взаимодействий, заимствованные из силовых полей [2], либо эмпирические оценки (например, выявление водородных связей по геометрическим параметрам) [4]. В данной работе мы подробно остановимся на стэкинг-взаимодействиях, которые в широко используемых ОФ часто не рассматривают в явном виде.

ПАРАМЕТРЫ СТЭКИНГ-ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

Среди различных типов контактов в биомолекулярных комплексах (водородные связи, электростатические взаимодействия и др.) стэкинг ароматических фрагментов заслуживает особого внимания. Большинство лекарственных препаратов содержат ароматические циклы, и стэкинг часто играет важную роль в молекулярном узнавании рецептор-лиганд. Ранее мы показали [5], что явный учет стэкинг-взаимодействий существенно повышает эффективность докинга АТФ. Стэкинг-контакты описывали функцией, зависящей от геометрических параметров взаимного расположения двух ароматических фрагментов -высоты h и угла а между ними и сдвига d одного из колец относительно другого (рис. 1).

Диапазон этих параметров, определяющий наличие или отсутствие стэкинга, до сих пор остается не выясненным и в оценочных критериях выбирается достаточно произвольно [6, 7]. Его уточнение могло бы повысить эффективность оценки качества и достоверности структур белок-лиганд, предсказываемых методами молекулярного моделирования. С этой целью мы провели анализ экспериментально установленных пространственных структур атомного разрешения для комплексов различных белков с лигандами, содержащими наиболее распространенные пуриновые основания - аденин и гуанин.

Известный пример стэкинг-взаимодействий - параллельная упаковка азотистых оснований нуклеотидов в ДНК [8, 9]. Но некоторые ароматические соединения стремятся расположиться не только параллельно, но еще и перпендикулярно друг другу, как это показано для аминокислот в белках [7, 10] и в модельных системах, состоящих из простых углеводородов - бензола, нафталина [11-14]. Кроме того, такие соединения имеют тенденцию участвовать в п-катионном взаимодействии, при котором образуется контакт между положительно заряженными группами и п-электронным облаком [15-17].

Поэтому мы исследовали распределение параметров h и d в зависимости от угла а относительно азотистого основания лиганда для ароматических боковых цепей остатков Phe, Tyr, Trp и His, а также для положительно заряженных гуанидиновой группы Arg и аминогруппы Lys. На рис. 2 приведены результаты для лигандов, содержащих гуанин.

Показано, что для остатка Phe характерны два альтернативных положения над плоскостью гуанинового коль-

Рис. 1. Геометрические параметры, с помощью которых описывали стэкинг-взаимодействия между двумя ароматическими кольцами: смещение (ф и высота центра одного из циклов относительно другого цикла; угол (а) между нормалями к плоскостям циклов

Phe

Туг

it?** ^ * *-? • * i* * *

* ■

ii— ■ * - 'К 1 ■

* * * I# * I ' F* *

*\л V ' ■ Г* *

Q 4 t , • i ■# . e

сыещамиа, А

Тф

His

•<

i*

* V * m * г •

• * _ — , ' С 1

Ч\ Чят * /-*• ** "

% > ** +

2 A смещение, A Arg 6 в

t*v г.; мг

• * * * с.

* й'ЛГЛ

.. V* *

I*

■и.

• [i * 1 • Л/. .

V • t* *

* * ■ i •

Lys

2 4 6

смсшсииа. к

1 | 1_ 1 ■ 1 ■" *■ Ai#** ■ # *

’1 m .* *.>• +

m

с Б В

смишачич. I

Рис. 2. Распределение центров ароматических колец и положительно заряженных боковых групп аминокислотных остатков белка-рецептора относительно центра гуанинового основания в комплексах белков с гуанинсодержащими лигандами. Красный цвет соответствует cos2а = 0.6-1.0 (параллельное расположение), зеленый — cos2a = 0.0-0.4 (перпендикулярное расположение), желтый — промежуточным значениям, где а — угол между плоскостями ароматических циклов. Для Lys угол а не определен

ца - параллельное и перпендикулярное (на рис. 2 показано красным и зеленым цветом соответственно). Для обоих типов контактов смещение d может меняться в достаточно большом диапазоне - до 3 Л. При этом два типа контактов хорошо различаются по высоте h, которая не превышает 4.5 Л для параллельной и 5.5 Л для перпендикулярной ориентации колец. Аналогичные распределения были получены и для остатков Tyr, Trp и His, хотя здесь тенденции проследить труднее ввиду меньшей распространенности данных остатков. Кроме того, видно, что для ароматических фрагментов остатков Tyr, Trp и His Т-образная геометрия не так характерна, как для Phe.

Интересно, что распределение для гуанидиновой группировки Arg очень похоже на Tyr, Trp и His с преобладанием параллельной ориентации относительно азотистого основания. Для аминогруппы боковой цепи Lys характерно как положение над плоскостью гуанина (п-катионное взаимодействие), так и в его плоскости. Последнее объясняется образованием водородных связей с гетероатомами гуани-нового основания.

Для аденина распределения в точности повторяют полученные для гуанина (данные не приведены). Полученные данные по геометрическим параметрам, описывающим стэкинг-взаимодействия, могут в дальнейшем быть использованы при разработке критериев оценки результатов докинга или включены в ОФ, используемые в процессе докинга.

гуанин-специфичная оценочная функция

Эффективность явного учета стэкинг-взаимодействий в ОФ продемонстрировали на примере оценки результатов докинга ГТФ для 14 комплексов с различными белками-рецепторами. Все структуры комплексов, сгенерированные с помощью докинга, были разделены на корректные и неправильные по значению среднеквадратичного отклонения (СКО) по координатам атомов гуанина (см. Методы). Были сконструированы несколько оценочных функций в виде линейной комбинации заранее заданных термов межмоле-кулярных взаимодействий. При этом все комплексы были разделены на две равные группы - обучающий и тестовый наборы. Весовые коэффициенты при термах подбирали методом линейной регрессии на значения дискретной

функции (1 - корректное решение, 0 - в противном случае) по результатам докинга для 7 комплексов обучающего набора. Для проверки устойчивости полученных весовых коэффициентов использовали метод перекрестной проверки путем изъятия из обучающего набора по одному комплексу. Относительная ошибка для всех коэффициентов при термах составила <30 %, что свидетельствует о надежности полученных результатов.

Новые ОФ были использованы для сортировки структур, сгенерированных с помощью докинга для каждого комплекса по отдельности. Видно, что эффективность ОФ goldscore [18], используемой в алгоритме докинга, составляет около 50 % - из возможных 7 корректные структуры выявлены только для 4 и 3 комплексов обучающего и тестового наборов соответственно (табл. 1). Эффективность сортировки по значению терма T k, описывающего стэкинг-контакты, выше, чем по ОФ goldscore. Комбинирование ОФ goldscore и T k (ОФ1) также дает лучшие результаты, чем ОФ goldscore. Такой же эффект наблюдали при включении терма Tstack в ОФ, учитывающую липофильные контакты и водородные связи гуанин-белок (ОФ2 и ОФ3, табл. 1).

Наиболее эффективной из полученных ОФ является функция ОФ3. Число комплексов, где верное решение ранжировано на первом месте по ОФ3, заметно превышает те же показатели для стандартной функции goldscore. При этом также значительно улучшается и средний лучший ранг верного решения, т.е. качество ранжирования повышается в целом равномерно для всех комплексов. Это видно и из анализа результатов, полученных для каждого комплекса (рис. 3).

заключение

Анализ структурных данных по комплексам белков с гуанин- и аденинсодержащими соединениями позволил уточнить геометрические параметры стэкинг-взаимодействий лигандов с ароматическими боковыми цепями аминокислотных остатков рецептора. На примере докинга ГТФ было продемонстрировано, что явный учет стэкинг-взаимодействия в оценочных критериях позволяет повысить эффективность поиска достоверных (близких к нативной) структур комплексов белок-лиганд, предсказываемых с помощью методов компьютерного моделиро-

Табл. 1. Ранжирование решений докинга ГТФ

Метод ранжирования Обучающий набор, 7 комплексов Тестовый набор, 7 комплексов

Число комплексов, где верное решение ранжировано на 1 месте Средний лучший ранг верного решения Число комплексов, где верное решение ранжировано на 1 месте Средний лучший ранг верного решения

goldscore 4 4.7 3 12.1

Tslack 2.3 3 7.0

ОФ1 = - 1.3 + 0.21 X Tstack + 0.016 X goldscore 1.7 4 6.9

ОФ2 = 0.06 + 0.007 x T fcI + 0.43 x T. . . lipophilic h-bond 2.3 4 6.9

ОФ3 = 0.05 + 0.004 X T „, + 0.39 x T + 0.22 x T . lipophilic h-bond stack 2.0 6.4

Рис. 3. Эффективность ранжирования результатов докинга ГТФ по ОФ goldscore (зеленый) и ОФ3 (красный) для обучающего (А) и тестового (Б) наборов. Показано лучшее по значению ОФ положение корректной структуры комплекса, сгенерированной с помощью процедуры молекулярного докинга

вания. В дальнейшем полученные результаты могут быть использованы для повышения точности докинга более широкого класса нуклеотид-содержащих соединений.

МЕТОДЫ

Структуры комплексов гуанин- и аденинсодержащих лигандов с белками были взяты из базы данных PDB (Brookhaven Protein Data Bank) [19]. Веб-сервер PDBlig [20] использовали для поиска записей комплексов, лиганды в которых содержат аденин и гуанин как подструктуру. Лиганды с модифицированными азотистыми основаниями, а также структуры, содержащие цепочки нуклеиновых кислот, не рассматривали. Для выбора представительного набора рецепторов использовали кластеризацию по аминокислотной последовательности с помощью программы Clustalw [21] и выбирали структуру с наилучшим разрешением.

Докинг ГТФ проводили с помощью программы GOLD [18] с использованием функции ранжирования gold-

score. Использовали параметры докинга, установленные по умолчанию. Для каждой структуры белка-мишени было получено по 60 решений докинга. Предсказание докинга считали корректным, если СКО от экспериментальной структуры по координатам атомов гуанина составляло менее 2.5 А.

Для расчета площади гидрофобного контакта ГТФ-белок (как меры гидрофобного взаимодействия, Tlipophilic) использовали веб-сервер PLATINUM [22], смещение шкалы атомных констант гидрофобности взяли равным +0.2 по поверхности лиганда, что позволило более реалистично описать распределение гидрофобных/гидрофильных свойств ГТФ.

Терм Th bond представляет собой дискретную функцию, принимающую значение 1 в случае контакта гуанина с определенным мотивом водородных связей и значение 0 в противном случае. Такими мотивами считали водородные связи атомов N1, N2, O6 гуанина с остатками i, i, i либо i, i, i-2.

Список литературы

1. Hanson M.A., Stevens R.O. Structure. 2009. 17. 8-14.

2. Kitchen D.B., Decornez H., Furr J.R., Bajorath J. Nat. Rev. Drug. Discov. 2004. 3. 935-949.

3. Moitessier N., Englebienne P., Lee D., Lawandi J., Corbeil C.R. Br. J. Pharmacol. 2008. 153. S7-S26.

4. Eldridge M.D., Murray C.W., Auton T.R., Paolini G.V., Mee R.P. J. Comput. Aided. Mol. Des. 1997. 11. 425-445.

5. Pyrkov T.V., Kosinsky Y.A., Arseniev A.S., Priestle J.P., Jacoby E., Efremov R.G. PROTEINS 2007. 66. 388-398.

6. Deng Z., Chuaqui C., Singh J. J. Med. Chem. 2004. 47. 337-344.

7. Chakrabarti P., Bhattacharyya R. Prog. Biophys. Mol. Biol. 2007. 95. 83-137.

8. Gotoh O. Adv. Biophys. 1983. 16. 1-52.

9. Sponer J., Leszczynski J., Hobza P. J. Biomol. Struct. Dynam. 1996. 14. 117-135.

10. Chelli R., Gervasio F.L., Procacci P., Schettino V. J. Am. Chem. Soc. 2002. 124. 6133-6143.

11. Tsuzuki S., Honda K., Uchimaru T., Mikami M., Tanabe K. J. Am. Chem. Soc. 2001. 124. 104-112.

12. Small D., Zaitsev V., Jung Y., Rosokha S.V., Head-Gordon M., Kochi J.K. J. Am. Chem. Soc. 2004. 126. 13850-13858.

13. Sato T., Tsuneda T., Hirao K. J. Chem. Phys. 2005. 123. 104307.

14. Malathy Sony S.M., Ponnuswamy M.N. Crystal Growth & Design 2006. 6. 736-742.

15. Waters M.L. Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. 6. 736-741.

16. Meyer E.A., Castellano R.K., Diederich F. Angew. Chem. Int. Ed. 2003. 42. 1210-1250.

17. Tewari A.K., Dubey R. Bioorg. Med. Chem. 2008. 16. 126-143.

18. Jones G., Willett P., Glen R.C., Leach A.R., Taylor R.D. J. Mol. Biol. 1997. 267. 727-748.

19. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. Nucleic. Acid. Res. 2000. 28. 235-242.

20. Chalk A.J., Worth C.L., Overington J.P., Chan A.W. J Med Chem. 2004. 47. 3807-3816.

21. Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., Thompson J.D., Gibson T.J., Higgins D.G. Bioinformatics. 2007. 23. 2947-2948.

22. Pyrkov T.V., Chugunov A.O., Krylov N.A., Nolde D.E., Efremov R.G. Bioinformatics. 2009. DOI: 10.1093/bioinformatics/btp111