CC BY
117
УДК 581.143:577.175.1
И.Ф. Головацкая, Р.А. Карначук, М.В. Ефимова, Т.Н. Копылова, В.А. Светличный
РОЛЬ КРИПТОХРОМА 1 И ФИТОХРОМОВ А-Е В РЕГУЛЯЦИИ РОСТА АРАБИДОПСИСА НА ЗЕЛЕНОМ СВЕТУ
Изучена роль фоторецепторов криптохрома 1 (сгу1) и фитохромов А-Е (рИуА-Е) в регуляции роста растений на зеленом свету. Этиолированные проростки ЛгаЬіі^орзіз їкаїіапа (Ь.) ИеупЬ. экотипа ЬапёвЪе^ егеіїа (исходная линия Ьег и мутанты ку4 и ку1, дефектные соответственно по сгу1 и рЬуА-Е) подвергали воздействию расфокусированного узкополосного импульсного лазерного излучения зеленой (ЗС, 542 нм), красной (КС, 672 нм) и дальней красной (ДКС, 730 нм) области спектра. Наблюдали разные ростовые реакции ЛгаЬіі^орзіз на действие ЗС и ЗС+ДКС, зависимые от состава фоторецепторов. Отмечена наибольшая ответная ростовая реакция гипо-котилей у Ьег на действие ЗС по сравнению с ку4 и ку1. Последействие ДКС аннулировало эффект действия ЗС на рост гипокотилей мутанта ку4, но не влияло на рост гипокотилей мутанта ку1. Отмечена схожесть ЗС/ДКС-эффектов с КС/ДКС-эффектами на размеры гипокотилей у Ьег. Полученные данные свидетельствуют о совместном участии сгу1 и рЬуА-Е в регуляции роста гипокотилей на ЗС.
Свет как важнейший фактор природы активирует ряд регуляторных фоторецепторов, контролирующих программы морфогенеза [1-3]. В соответствии со спектральной специализацией выделяют фоторецепторы красного света (КС) и дальнего красного света (ДКС) (фитохромы рЬуЛ-Е), синего света (СС) (фототропины рЬоИ-2, криптохромы сгу1-2) [4, 5]. Однако до сих пор не найдены регуляторные пигменты зеленого света (ЗС).
В связи с этим изучали роль криптохрома 1 и фитохромов А-Е в регуляции ростовых реакций арабидоп-сиса на ранних этапах онтогенеза при деэтиоляции на зеленом и красном свету.
МЕТОДИКА
воротного зеркала, равномерно распределялось на площади 25 см2 и падало на чашку Петри с растениями. Чашка Петри располагалась на вращающемся столике, что увеличивало однородность облучения. Растения освещали 300 имп. ЗС или 200 имп. КС, а затем 30 и 300 имп. ДКС. Облученность (Е) растений с учетом отражения крышки чашки Петри (13%) была равна 1,9; 1,0 и 0,8 Вт/м2 соответственно при X = 542, 672 и 730 нм. После деэтиоляции на свету проростки выдерживали в течение 3,5 сут в темноте и затем фиксировали. Длину гипокотилей и площадь семядолей измеряли у 100 образцов каждого варианта 7-дневных проростков А. ЛаЫапа.
На графике приведены средние арифметические и их стандартные ошибки.
Стерилизованные в 3%-ной Н2О2 в 80%-ном этаноле семена Arabidopsis высевали в чашки Петри на стерильную жидкую питательную МС-среду. Для синхронизации прорастания семена выдерживали в течение 3 сут в темноте при 6°С, затем 3 ч освещали (люминесцентные лампы ЛД-40, интенсивность света - 33 Вт/м2) и помещали в темноту.
3, 5-дневные этиолированные проростки Arabidopsis ЛаНапа (Ь.) ИеупЬ экотипа ЬаМБЪещ вгвсга исходной линии Ьег и мутантов ку4 и ку1, дефектных соответственно по криптохрому 1 (сгу1) и фитохромам А-Е [6, 7], подвергали воздействию узкополосного импульсного (имп.) лазерного излучения зеленой области спектра (ЗС, длина волны 542 нм; энергия имп. 5,5 мДж; длительность имп. 10 нс, частота 1 Гц) и красной области (КС и ДКС, длина волны 672 и 730 нм, энергия имп. 3,0 и 2,4 мДж соответственно; длительность имп. 10 нс; частота 1 Гц). Это излучение при помощи оптической системы, состоящей из короткофокусной линзы и по-
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении фоторецепторов ЗС оценивали вклад известных фоторецепторов (криптохрома 1 и фитохромов А-Е) в восприятие ЗС растением. Для исследования фи-тохромного контроля ростовых реакций последовательно освещали растения КС и ДКС, оценивая эффект КС/ДКС-обращения. В соответствии с последними данными этот эффект проявляется при действии низкой интенсивности света и в большей степени оценивается работа рЬуВ, тогда как рЬуА контролирует реакции на очень низкую и высокую интенсивность света [8, 9]. Удобной моделью для изучения фоторецепторов служили мутанты араби-допсиса с нарушенными фоторецепторами, ку4 и ку1.
Деэтиоляция на КС (X = 672 нм; 200 имп.; 1,04 Вт/м2) обусловливала уменьшение длины гипокотилей и увеличение площади семядолей 7-дневных проростков Ьег арабидопсиса (рис. 1).
Темнот 200КС 200КС-30ДКС 200КС-30ДКС* 200КС-300ДКС 200КС-300ДКС*
s
я 0,2 о
I0,15
о
hQ
El 0,1 -
tS
о
G 0,05 -0
200КС+30ДКС 200КС+30ДКС* 200КС+300ДКС 200КС+300ДКС*
Рис. 1. Влияние КС и ДКС света на ростовые параметры 7-дневных проростков Ler арабидопсиса. Цифрами на оси Х обозначена продолжительность освещения, имп., звездочкой - следование ДКС через 10 мин после КС
Т емнота
Действие ДКС зависело от продолжительности освещения и паузы перед следованием ДКС. Эффект ДКС (X = 730 нм, 30 имп., 0,84 Вт/м2) сразу после КС снимал действие последнего на рост семядолей и усиливал эффект КС на длину гипокотилей. Если же ДКС* (X = 730 нм; 30 имп.; 0,84 Вт/м2) давали через 10 мин темноты, то это «отменяло» эффект КС на рост гипокотилей, но не влияло на размеры семядолей. Увеличение продолжительности действия ДКС (300 имп.) обращало действие КС на рост семядолей, не изменяя размеры гипокотилей. Пауза между действием КС и ДКС* (300 имп.) «отменяла» все морфогенные эффекты КС.
На основе сопоставления эффектов ДКС разной продолжительности можно предположить, что отсрочка кратковременного действия ДКС* (30 имп.) на растяжение семядолей не дала эффекта обращения из-за накопления существенного пула вторичных мессенджеров КС или промежуточных форм фитохромов и низкого сигнала ДКС, так как увеличение времени действия ДКС* (300 имп.) обращало эффект КС.
Гипокотили и семядоли по-разному реагировали на освещение. КС ингибировал рост гипокотилей, увеличивая размеры семядолей. Для «отмены» действия КС на рост семядолей требовалось меньшее время действия ДКС, чем для гипокотилей. Различия в реакциях семядолей и гипокотилей на свет, по нашему мнению, связаны или с разным уровнем и набором фоторецепторов, экспрессированных в данный момент, или разным количеством и качеством вторичных мессенджеров, или разной компетентностью к их действию. В итоге в клетке экспрессируется разный набор генов и вырабатываются новые белки, позволяющие развивать адекватную реакцию на световой стимул. Возможно, стимул воспринимается в семядолях и передается в гипокотиль, поэтому требуется больше времени для реализации светового сигнала. Подтверждением предположения служат ранее полученные нами данные, показавшие более высокую чувствительность к свету семядолей по сравнению с гипокотилями при деэтио-ляции проростков арабидопсиса на селективном свету. Так, 30-минутное действие СС (2,7 мкмоль кван-тов/м2с) или ЗС (4,2 мкмоль квантов/м2с) в течение 7 сут увеличивало семядоли проростков Ьвг арабидопсиса на 15 и 22% соответственно, не влияя на размеры гипокотилей.
Разнообразие спектров действия света и кривых доза-ответ светочувствительности семядолей и гипоко-тилей растений можно объяснить также существовани-
ем различных форм агрегированного фитохрома (Ф) [10]. Предположение о существовании агрегированного фитохрома основывается на двух известных фактах: обогащение цитоплазмы кальцием при освещении [11] и поддержание кальцием ассоциаций молекул фитохрома [12]. Моделирование фото преобразования димеров (ФкФк, ФкФдк, ФдкФдк) и агрегированных димеров (тетрамеров и гексамеров) фитохромов показало, что состав различных ассоциаций их молекул на насыщающем КС и ЗС отличается от такового на СС и ДКС [10]. Начальная кинетика реакций, вызванных агрегированными формами фитохрома, медленнее по сравнению с кинетикой реакций мономерной формы, и существуют переходные пики у некоторых ассоциаций на КС и ЗС. Объединение димеров в тетрамеры и гексамеры вызывает формирование отдельного пика на СС, который отсутствует на ДКС.
Эти данные также недостаточно объясняют различные кривые доза-ответ в светозависимых реакциях растений. При построении модели авторы [10] не учли разные свойства фитохромов рЬуЛ (очень низкоэнергетические реакции - ОНЭР, высокоэнергетические реакции - В ЭР) и рЬуВ (низкоэнергетические реакции -НЭР). Не учтены существование промежуточного кон-формера рЬуЛ в цикле превращения Фк через Фдк (Фк+ рЬуЛ) с коротким периодом полураспада [13-15] и участие в поглощении СС сгу1 и сгу2, а также рЬоН и рЬо12.
РЬуЛ и рЬуВ контролируют прерывание покоя в семенах разными способами [9]; рЬуВ обеспечивает классически фотообратимую реакцию, отвечая на действие большей интенсивности КС и ДКС, чем рЬуЛ. Действие рЬуЛ - фотонеобратимо; оно вызывает прорастание семян при низкой интенсивности освещения УФ-А, видимой области и ДКС [8]. Световые реакции фитохромов на повторное освещение связывают с тем-новой реверсией. Предполагают, что из димеров фитохрома только гетеродимеры ФкФдк переносят темно-вое обращение, тогда как гомодимеры ФдкФдк нестабильны [16, 17].
По нашему мнению, решающую роль в направлении световых реакций могут играть вторичные посредники трансдукции сигнала света, поглощаемого разными фоторецепторами.
На рис. 2 показано, что действие ЗС на рост арабидопсиса во многом зависело от состава функционирующих фоторецепторов. Наибольшее ингибирование роста гипокотилей в ответ на действие ЗС (542 нм;
300 имп.; 1,9 Вт/м2) отмечено у проростков Ler, имеющих полный набор фоторецепторов. Отсутствие одного из фоторецепторов СС (cryl) или КС (фитохромов A-E) снижало чувствительность к ЗС проростков hy4 или
hyl по сравнению с исходной линией Ler. При этом отсутствие фитохромов у hyl снижало чувствительность к ЗС более существенно, чем отсутствие cryl у hy4.
161 14
а 1-2 | in н
1 8 з
| 6 -я
Й 4 .
□ зоозс+зоодкс
Ler
hy4
hyl
Рис. 2. Влияние ЗС и ДКС на длину гипокотилей 7-дневных проростков разных линий арабидопсиса. Цифрами обозначена продолжительность освещения, имп.
ДКС (300 имп.) (рис. 2), следующий после ЗС (300 имп.), не оказывал существенного действия на ростовые реакции гипокотилей Ler, что аналогично реакциям на 200КС+300ДКС (рис. 1). Подобный ответ можно связать с реакциями, опосредованными поглощением ЗС фоторецепторами cryl и phyA и не предусматривающими обращение. На способность cryl и phyA регулировать высокоэнергетические реакции указывают и другие авторы [18].
Участие нескольких фоторецепторов в поглощении одного участка ФАР позволяет предполагать пересечение путей трансдукции света. Исходя из этого, следует, что при проявлении эффекта 300ЗС+300ДКС у проростков Ler наиболее выражены результаты взаимодействия путей передачи сигналов ЗС и ДКС. Известно, что фоторецепторы phyA и cry1 регулируют рост гипо-котилей на СС, при этом phyA частично подавляет действие cryl на рост гипокотилей и семядолей [13]. Аналогичное взаимодействие, возможно, проявляется при действии ЗС и ДКС, при этом ЗС активирует и криптохром 1 и фитохромы, а ДКС инактивирует phyB и активирует phyA. Взаимодействие путей сигнальной трансдукции изменяет физиологический ответ на действие несколько стимулов одновременно. Согласованность действия фоторецепторов лежит в конечном чис-
ле мессенджеров и, следовательно, направлении физиологического ответа.
У проростков ку1 не наблюдали эффекта ЗС/ДКС-обращения, так как нет фитохромов, участвующих в световых превращениях. При повреждении сгу1 ростовые реакции ку4 в ответ на действие ЗС были обратимы ДКС. Этот факт позволяет предполагать отсутствие контроля со стороны криптохрома 1 трансдукции светового сигнала, запускаемой фитохромами. Взаимодействие фитохромов и криптохромов при трансдукции света показано в других работах [13].
Таким образом, мы наблюдали разные ростовые реакции проростков арабидопсиса на действие ЗС и ЗС+ДКС, зависимые от состава фоторецепторов. Отмечена наибольшая ответная ростовая реакция гипокотилей у проростков Ьєг на действие ЗС по сравнению с проростками мутантов Ьу4 и Ну1, у которых нарушен синтез сгу1 и фитохромов соответственно. Последействие дальнего красного света (730 нм) аннулировало эффект действия ЗС (542 нм) на рост гипокотилей мутанта Ну4, но не влияло на рост гипокотилей мутанта Ьу1. Отмечена схожесть ЗС/ДКС-эффектов с КС/ДКС-эффектами на размеры гипокотилей у Ler. Полученные данные позволяют предполагать совместное действие фитохромов и сгу1 в регуляции роста гипо-котилей на ЗС.
ЛИТЕРАТУРА
1. Карначук Р.А., Постоеалоеа В.М., Беленькая Е.В., Жуланова С.Г. Фитохромный контроль метаболизма |4С-углеводов в растениях // Физио-
логия растений. 1978. Т. 25, № 2. С. 268-271.
2. Карначук Р.А., Голоеацкая И.Ф., Ефимова М.В., Хрипач В.А. Действие эпибрассинолида на морфогенез и гормональный баланс проростков
арабидопсиса на зеленом свету // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 4. С. 591-595.
3. Голоеацкая И.Ф. Роль криптохрома 1 и фитохромов в регуляции фотоморфогенетических реакций растений на зеленом свету // Физиология
растений. 2005. Т. 52, № 6. С. 822-829.
4. Briggs W.R., Olney M.A. Photoreceptors in plant photomorphogenesis to date. Five phytochromes, two cryptochromes, one phototropin, and one su-
perchrome // Plant Physiol. 2001. Vol. 125. P. 85-88.
5. Liscum E., Hodgson D.W., Campbell T.J. Blue Light Signaling through the Cryptochromes and Phototropins. So That's What the Blues Is All About //
Plant Physiol. 2003. Vol. 133. P. 1429-1436.
6. Koornneef M., Rolff E., Spruit C.J.P. Genetic Control of Light-Inhibited Hypocotyl Elongation in Arabidopsis thaliana L. Heynh // Z. Pflanzenphysiol.
1980. Vol. 100. P. 147-160.
7. Davis S.J., Kurepa J., Vierstra R.D. The Arabidopsis thaliana HY1 locus, required for phytochrome-chromophore biosynthesis, encodes a protein
related to heme oxygenases // Plant Biol. 1999. Vol. 96. Р. 6541-6546.
8. Botto J.F., Sa'nchez R.A., Whitelam G.C., Casal J.J. Phytochrome A Mediates the Promotion of Seed Germination by Very Low Fluences of Light and
Canopy Shade Light in Arabidopsis // Plant Physiol. 1996. Vol. 110. Р. 439-444.
?
0
9. Shinomura T., Nagatani A., Hanzawa H., Kubota M. et al. Action spectra for phytochrome A- and phytochrome B-specific photoinduction of seed
germination in Arabidopsis thaliana // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. Р. 8129-8133.
10. Ninkovic V., Obrenovic S. A Computer Simulation of Aggregated Phytochrome Photoconversion // Physiol. plantarum. 2000. Vol. 108. P. 330-336.
11. Roux S.J., Wayne R.O., Datta N. Role of Calcium in Phytochrome Responses: An update // Physiol. Plant. 1986. Vol. 66. P. 344-348.
12. Yamamoto K.T., Smith W.O., Furuya M. Photoreversible Ca2+-dependent Aggregation of Purified Phytochrome from Etiolated Pea and Rye Seedlings // Photochem. Photobiol. 1980. Vol. 32. P. 233-240.
13. Hennig L., Poppe C., Unger S., Schafer E. Control of Hypocotyl Elongation in Arabidopsis thaliana by Photoreceptor Interaction // Planta. 1999. Vol. 208. P. 257-263.
14. Hennig L., Biiche C., Schafer E. Degradation of Phytochrome A and the High Irradiance Response in Arabidopsis: a Kinetic Analysis // Plant Cell Environ. 2000. Vol. 23. P. 727-734.
15. Shinomura T., Uchida K., Furuya M. Elementary Responses of Photoperception by Phytochrome A for High Irradiance Response of Hypocotyl Elongation in Arabidopsis // Plant Physiol. 2000. Vol. 122. P. 147-156.
16. Schmidt W., Schafer E. Dependence of Phytochrome Dark Reactions on the Initial Photostationary State // Planta. 1974. Vol. 116. P. 267-272.
17. Hennig L., Schafer E. Both Subunits of the Dimeric Plant Photoreceptor Phytochrome Require Chormophore for Stability of the Far-Red Light-Absorbing Form // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 7913-7918.
18. Furuya M., Schafer E. Photoperception and Signalling of Induction Reactions by Different Phytochromes // Trends Plant Sci. 1996. Vol. 1. Р. 301305.
Статья поступила в научную редакцию «Биологические науки» 13 декабря 2006 г., принята к печати 20 декабря 2006 г.
