CC BY
70
30 ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
'5 (97) сентябрь 2016 г.
УДК 616.9:614.2
с.а. лисовская, е.в. халдеева, н.и. глушко
Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, 420015, г. Казань, ул. Большая Красная, д. 67
Роль бактериально-грибковых ассоциаций в развитии инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи
лисовская Светлана Анатольевна — кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микологии, тел. (843) 236-56-59, e-mail: S_Lisovskaya@mail.ru
Халдеева Елена Владимировна — кандидат химических наук, заведующая лабораторией микологии, тел. (843) 236-56-59, e-mail: mycology-kazan@yandex.ru
Глушко Надежда ивановна — старший научный сотрудник лаборатории микологии, тел. (843) 236-56-59, e-mail: mycology-kazan@yandex.ru
Изучены патогенные свойства (адгезия) 6 штаммов C. аlbicans, выделенных от больных с различными формами кан-дидозов. Для изучения влияния бактерий на патогенные свойства штаммов C. аlbicans в работе использовали экстракты бактерий S. aureus. Установлено, что уровень адгезии у штаммов, выделенных с поверхностей слизистых оболочек, выше, чем у выделенных с кожи и ее придатков. Полученные результаты показали, что отличия в адгезивных свойствах штаммов C. albicans связаны с локализацией микозов. Совместное культивирование штаммов C. albicans с добавлением экстрактов бактерий в течение двух суток увеличило патогенные способности штаммов более чем в 2 раза. Таким образом, показана возможность увеличения степени проявления факторов патогенности гриба С. Аlbicans под воздействием продуктов жизнедеятельности бактерий и, как следствие, возможность возникновения более тяжелой формы кандидоза. Ключевые слова: Candida albicans, адгезия, патогенность, бактериальные ассоциации кандидоза, антагонизм.
s.a. lisovskaya, e.v. khaldeeva, n.i. glushko
Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 67 Bolshaya Krasnaya Str., Kazan, Russian Federation, 420015
The role of bacterial-fungal associations in the healthcare-associated infections
Lisovskaya SA — Cand. Med. Sc., Leading Researcher of the Mycology Laboratory, tel. (843) 236-56-59, e-mail: S_Lisovskaya@mail.ru Khaldeeva E.V. — Cand. Med. Sc., Head of the Mycology Laboratory, tel. (843) 236-56-59, e-mail: mycology-kazan@yandex.ru glushko N.I. — Senior Researcher of the Mycology Laboratory, tel. (843) 236-56-59, e-mail: mycology-kazan@yandex.ru
The virulence features (adhesion) was studied of 6 strains of Candida albicans taken from patients with various candidosis forms. Influence of associated bacteria is estimated using extracts of S. aureus. It was established that adhesion of mucosal strains is 1.5-3 times higher than that of the skin strains. The obtained results show that differences in adhesive properties of C. albicans strains are associated with mycosis localization. Cultivation of C. albicans cultures with extracts of bacteria during 2 days twice increases virulence features of C. albicans. Thus, it is shown that virulence features of C. albicans may increase under the influence of associated bacteria during their collective growth and more serious forms of candidiasis may occur.
Key words: Candida albicans, adhesion, pathogenity, candidiasis associated bacteria, antagonism.
Грибы рода Candida часто обнаруживаются у им-мунокомпрометированных больных, находящихся на длительном лечении как в период госпитализации, так и на амбулаторном лечении. По данным многоцентрового исследования, проведенного в
25 медицинских центрах Европы, в конце прошлого века занимали восьмое место среди микроорганизмов, вызывающих инфекции кровотока, а в США, по данным аналогичного исследования, — четвертое место [1, 2]. Очень часто распространение грибко-
вой инфекции связывают с оказанием медицинской помощи, чему способствует внедрение в повседневную клиническую практику новых высокотехнологических методов лечения, которые требуют увеличения объема инвазивных вмешательств, например, установки имплантатов, внутрисосудистых катетеров, электрокардиостимуляторов,электродов и т.д. [3, 4]. Особое место занимают грибы Candida albicans (C. albicans), на долю которого приходится ведущее место среди возбудителей поверхностных и глубоких хронических форм заболеваний.
Особенностью кандидозов является полиморфизм их клинических признаков, а также множество мест локализации грибов C. albicans в одном макроорганизме. Так, у многих больных обратившихся в лабораторию микологии Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии, грибы высевали со слизистых оболочек, кожи, ногтевых валиков, мочи, кала. Связано это, по-видимому, с особенностями самого гриба. Грибы C. аlbicans обладают широким спектром патогенных свойств. Основными факторами вирулентности, определяющими патогенность гриба, являются: протеолитическая активность, модуляция иммунного ответа, способность клеток гриба к адгезии и диморфизму, фенотипическая изменчивость, способность к биопленкообразованию [5].
Кроме того, грибы C. albicans у человека редко выделяются в монокультуре. Как правило, они являются составляющими микробных ассоциаций. Заселяя кожу и слизистые, грибы и бактерии могут выступать в качестве возбудителей оппортунистических инфекций или провоцировать воспалительные реакции. Известно, что в микробной ассоциации между разными видами складываются сложные и неоднозначные взаимоотношения, в которых тесно переплетаются взаимные влияния участников ассоциаций друг на друга и на макроорганизм. Считается, что эти влияния могут осуществляться в следующих основных направлениях: 1) ассоци-анты могут изменять биологические свойства, стимулировать или тормозить размножение и развитие основного возбудителя; 2) в условиях новых взаимоотношений между микробами может изменяться их воздействие на макроорганизм, как за счет усиления вирулентности возбудителя, так и за счет образования новых факторов, отягощающих течение болезни; 3) дополнительная сенсибилизация человека микробами, входящими в ассоциацию [6].
В этиологии инфекции, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), большое значение имеют микробные ассоциации. В связи с этим, важным дополнением к установлению возможных осложнений протекания инфекционных заболеваний является исследование изменения вирулентной активности in vitro у различных клинических штаммов C. albicans, выделенных из различных анатомических локусов человека, под действием экстракта Staphylococcus aureus, как наиболее часто встречаемого в микробиологических посевах у больных.
Материал и методы
Объектом исследования служили дрожжевые грибы C. albicans (6 штаммов), выделенные от пациентов, находящихся на амбулаторном лечении с клиническими признаками поверхностной канди-дозной инфекции различной локализации (слизистых, кожных покровов и ногтевых пластин), при обследовании в клинико-диагнастическом центре Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии.
Микроорганизмы выделялись стандартными методами с использованием агара Сабуро.
Определение адгезивных свойств выделенных штаммов C. albicans проводилось на ранее разработанной авторами модели адгезии клеток гриба на нитроцеллюлозную пленку с иммобилизированным гемоглобином [7]. Полученную пленку площадью 7 см2 инкубировали при температуре 300С с 3 мл суспензии клеток гриба в 0,1М фосфатном буфере в течение двух часов. Начальная оптическая плотность суспензии клеток составляла 0,18-0,21 при длине волны 540 нм. Определение уровня адгезии проводили по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток, а также прямым подсчетом клеток в суспензии с помощью микроскопа Микмед - 6, при увеличении 10х20, подсчитывали не менее 10 полей зрения.
Для изучения влияния бактерий-ассоциан-тов на адгезивные свойства штаммов C. albicans в работе использовали бактериальный экстракт Staphylococcus aureus, предоставленный и изготовленный лабораторией по разработке бактериальных аллергенов Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии в соответствии стандартам ВФС 42-93-88. Ингибирующее или стимулирующее действие бактериального экстракта на адгезивную способность клеток проводили методом острого опыта двумя способами [8].
1 вариант: Культуру клеток C. albicans раннего возраста засевали в жидкую питательную среду Сабуро, разлитую в пробирки по 3 мл с разной концентрацией (0,05; 0,1; 0,2; 0,4 мл) соответствующего экстракта и в течение 48 часов культивировали при температуре 300С. Затем определяли уровень адгезии как описано выше. В качестве контроля исследовали культуру клеток C. albicans, выросшую без добавления экстрактов.
2 вариант: Бактериальный экстракт разной концентрации (0,05; 0,1; 0,2; 0,4 мл) добавляли непосредственно в инкубационную среду в пробирки с суспензией клеток и нитроцеллюлозной пленкой. Затем определяли уровень адгезии как описано выше.
Все результаты усредняли по трем измерениям и оценивали достоверность различий по критерию Стъюдента.
Результаты и обсуждения
Все группы штаммов грибов C. albicans были разделены с учетом места обнаружения: три штамма из зева и ротовой полости и три штамма, выделенные с поверхности гладкой кожи туловища и конечностей.
Способность C. albicans к адгезии — это не только один из основных вирулентных факторов, определяющих патогенность гриба, являющийся первоначальным этапом развития инфекции, но и начальная стадия в цикле формирования биопленки. В связи с этим, первым этапом иследования стало изучение адгезивной активности штаммов.
В ходе исследования выявлено, что наибольший процент адгезии отмечался у штаммов, выделенных с поверхностей слизистых оболочек ротовой полости в обеих группах, в то время как штаммы, выделенные с кожи и ее придатков, существенно (в 1,5-3 раза) уступали им в адгезии. Уровень адгезии изо-лятов C. albicans, обнаруженных на слизистых оболочках зева и ротовой полости, достигал 46%, тогда как штаммы, обнаруженные у больных с диагнозами кандидоз кожи, имели уровень адгезии от 8 до 20% (рис. 1).
х
32 ^ ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА '5 (97) сентябрь 2016 г.
Рисунок 1.
Уровень адгезии клинических штаммов С. albicans при кандидозах различной локализации
ео
Слизистые ротовой полости Кожные покровы
Рисунок 2.
Адгезивные свойства штаммов C. albicans, при совместном культивировании с экстрактом St. аureus
^ 60 п
1 40 U
гэ
£ 20^
< ,
0,025 0,05 0,1 V3KCT, мл
0,2
0,4
□ Штамм, вьделенньй из зева, с высокой вирулентной активностью
■ Штам^, вьделенньй из зева, с низкой вирулентной активностью
□ Штамм, вьделенньй из кожи, с вьсокой вирулентной активностью
□ Штамм, вьделенньй из кожи, с низкой вирулентной активностью
■ Штам^ №4, непатогенный
Низкий уровень адгезивных свойств штаммов, выделенных с кожи и придатков, вероятно связан с резко отличающимися условиями жизни гриба: низкая влажность, малодоступные субстраты (кератин, коллаген). Вероятно, здесь главную роль играют другие факторы патогенности, например комплекс внеклеточных протеолитических ферментов, в первую очередь секретируемых аспарагировых проте-иназ, обладающих способностью разрушать белки кожных покровов [5]. С другой стороны, штаммы, обнаруженные в ротовой полости, постоянно обеспечиваются питательными веществами, но для закрепления в среде, где идет постоянное вымывание, высокая адгезия может служить необходимым фактором.
Совместный рост грибов C. albicans и различных видов бактерий в культурах из патологического ма-
териала на среде Сабуро и МПА показывает разнообразные взаимоотношения данных видов. Нередко можно видеть зону «неприкосновенности» вокруг некоторых колоний бактерий, например Pseudomonas aeruginosa, в которые не вступает дольше растущие грибы. По-видимому, диффундирующие в среду продукты жизнедеятельности бактерий задерживают развитие грибов. И совсем другая картина наблюдается у колоний C. albicans и Staph. aureus, которые почти всегда прекрасно чувствуют себя друг с другом. Можно предположить, что данный вид бактерий оказывает благоприятное воздействие на культуру C. albicans, способствуя их развитию. Исходя из этого, для исследования ин-гибирующего или стимулирующего влияния Staph. aureus на адгезивные свойства штаммов C. albicans был взят бактериальный экстракт данного вида в
различных объемах. В качестве контроля между группами штаммов был взят непатогенный музейный штамм №4.
Проведенные эксперименты показали неэффективность добавления бактериального экстракта в инкубационную среду на стадии определения адгезии, при проведении опыта вторым способом. Начальная оптическая плотность суспензии клеток практически сохранялась после инкубации пленки, отклонения были незначительны — менее 0,01%, то есть адгезивная активность штаммов не проявлялась. Можно предположить, что в результате быстрого связывания экстракта с гемоглобином, иммобилизованным на нитроцеллюлозную пленку, образуется биопленка, препятствующая адгезии клеток гриба C. albicans.
Совместное культивирование штаммов C. albicans с экстрактом показало наличие стимулирующего действия бактерий на адгезивные свойства штаммов C. albicans. Однако, эффект достигался только при культивировании штаммов с объемом экстракта 0,1; 0,2 мл, причем добавление 0,2 мл экстракта показало наиболее заметное влияние на адгезивные свойства штамма (рис. 2). Добавление 0,4 мл бактериального экстракта оказывало выраженное ингибирующее действие на рост штаммов C. albicans. Культивирование штаммов с 0,04 мл экстракта оказывало незначительное влияние на адгезивные свойства штамма, что, вероятно, обусловлено слишком низкой концентрацией биологически активных соединений.
Было замечено, что добавление экстракта оказывает более выраженное стимулирующее действие на адгезивные свойства штаммов C. albicans, выделенных с поверхности кожи, средний уровень адгезии повысился с 9,5 до 21,6%. Адгезивная активность штаммов, выделенных из зева и кожи с низкой вирулентной активностью, увеличивалась почти в два раза — с 22±0,1 до 36±0,2% и 13±0,1 до 25±0,1% соответственно.
Таким образом, проведенные исследования показали, что вирулентная активность штаммов
C. albicans связана не только с местом их локализации у больного, но и с видами ассоциантов, участвующих в патогенетическом процессе заболевания. Рассмотрев бактериально-грибковое взаимодействие было показано, что обретение дрожже-подобными грибами C. albicans агрессивных свойств связано с интеграцией гриба с другими микроорганизмами. Кроме того, характер взаимодействия бактерий и грибов С. albicans зависит от количественного соотношения микроорганизмов и степени вирулентной активности штаммов С. albicans. Показана возможность увеличения факторов патоген-ности штаммов С. albicans под воздействием продукции жизнедеятельности бактерий. На основании проведенных исследований можно сделать вывод о возможном синергизме C. albicans и бактерий при смешанных инфекциях. Это указывает на возможность возникновения более тяжелой формы канди-доза при микст-инфекциях, т.е. C. albicans в таких условиях способна стать ведущим этиологическим фактором заболевания, что требует особого подхода к лечению.
ЛИТЕРАТУРА
1. Климко Н.Н. Диагностика и лечение кандидемии и острого дис-семинированного кандидоза // Инфек. и антимикроб. тер. — 2002. — Т. 4, №1. — С. 30-37.
2. Ruhnke M. Mucosal and systemic fungal infections in patients with AIDS: prophylaxis and treatment // Drugs. — 2004. — Vol. 64 (11). — P. 1163-80.
3. Хазанова В.В., Рабинович И.М., Земская Е.А., и др. Изучение микробиоценоза при хронических заболеваниях слизистой оболочки полости рта // Стоматология. — 1996. — Т. 75, №2. — С. 26-28.
4. Афиногенова А.Г., Даровская Е.Н. Микробные биопленки ран: состояние вопроса // Травматология и ортопедия России. — 2011. — №3. — С. 119-125.
5. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. — М.: Триада-Х, 2000. — 472 с.
6. Реброва Р.Н. Грибы рода Candida при заболеваниях негрибковой этиологии. — М.: Медицина, 1989. — С. 123.
7. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В. Лабораторная модель для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов // Проблемы медицинской микологии. — 2006. — Т. 8, №3. — С. 36-39.
8. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. и др. Методы экспериментальной микологии. Справочник. — Киев: Наукова думка, 1982. — 550 с.
х
