CC BY
36
тической композицией (эвкалипт, эхинацея, календула), обладают антимикробным, противовоспалительным и ранозаживляющим действием.
2. Применение разработанных раневых фито-покрытий «Фито-С» и «Фито-В», в сравнении с раневым покрытием «Активтекс-Ф» в эксперименте, выявило, что в фазе воспаления очищение раны происходит в 1,5 раза быстрее, в фазе регенерации отмечается усиление процессов коллагеногене-за, ускорение сокращения размеров ран и эпители-зации рубца в 1,6 раза, наблюдается более быстрая смена воспалительно-регенераторного типа цито-граммы на регенераторный в 1,8 раза.
3. Применение разработанного раневого покрытия «Фито-С» способствовало формированию полноценного эпителиального пласта и рубца к 21 суткам, в пограничной с рубцом зоне в эти сроки эксперимента обнаруживаются зачатки новообразованных сальных желез и волосяных фолликулов.
4. Выявлено отсутствие цитотоксического действия разработанных раневых фитопокрытий «Фито-В» на культуру клеток дермальных фибро-бластов in vitro.
5. Разработанный способ местного лечения ран и раневой инфекции кожи и мягких тканей с использованием раневых фитопокрытий «Фито-С» оптимизирует течение репаративных процессов в ране, позволяет сократить сроки очищения гнойных ран в 1,4 раза и на 27% уменьшает сроки лечения.
6. Применение разработанных раневых покрытий «Фито-С» в лечении пациентов с ранами и раневой инфекции кожи и мягких тканей, по сравнению покрытием «Активтекс-Ф», позволяет сократить сроки купирования инфекционно-вос-палительных явлений в ране на 5 дней, что коррелирует со снижением микробной обсемененности тканей с 106 до 102 в 1 г и уменьшением удельного веса микробной ассоциации с 83,3% до 16,7%.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616.33-002.44-007.251-089
В. В. АЛИПОВ, Е. А. ДОБРЕЙКИН, А. И. УРУСОВА, П. А. БЕЛЯЕВ
РЕЗУЛЬТАТЫ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ МЕДИ И НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ОБЛУЧЕНИЯ ПРИ ИНФИЦИРОВАННЫХ ОЖОГОВЫХ РАНАХ КОЖИ В ХИРУРГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Саратовский государственный медицинский университет им. В. И. Разумовского
V. V. ALIPOV, E. A. DOBREJKIN, A. I. URUSOVA, P. A. BELJAEV
RESULTS OF COMBINED COPPER NANOPARTICLES' AND LOW-INTENSITY LASER APPLICATION OF SIMULATED INFECTED BURN WOUNDS OF THE SKINS IN SURGICAL EXPERIMENT
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ОЖОГИ, ЭКСПЕРИМЕНТ, МОДЕЛИРОВАНИЕ, НАНОЧАСТИЦЫ МЕДИ, НИЗКОИНТЕНСИВНОЕ ЛАЗЕРНОЕ ОБЛУЧЕНИЕ, СОЧЕТАННОЕ ЛЕЧЕНИЕ.
РЕЗЮМЕ
Разработан способ моделирования инфицированной контролируемой по глубине и площади ожоговой раны с помощью применения запатентованного способа лазерного излучения. В условиях эксперимента на белых лабораторных крысах определены особенности течения моделированного раневого процесса при инфицировании ожоговой раны кожи, выраженность антибактериального эффекта различных концентраций наночастиц меди на культуры микроорганизмов под действием лазерного излучения. Сочетан-ное местное применение низкоинтенсивного лазерно-
го излучения (НИЛИ) и наночастиц меди у экспериментальных животных основной группы к 7 суткам обеспечивало прекращение высеваемости патогенной микрофлоры, появлению к 4 суткам грануляций, а к 14 суткам лечения - эпителизации раны.
KEY WORDS: BURNS, EXPERIMENT, SIMULATION, NANOPARTICLES OF COPPER, LOW-ENERGY LASER IRRADIATION, THE COMBINED TREATMENT.
SUMMARY
Developed a way to simulate an infected area and depth-controlled burn wound through the use of the patented method of laser radiation. In the experiment on the white lab rats are features of the simulated wound infection of burn wounds of skin manifestation of antibacterial ef-
fect of different concentrations of copper nanoparticles on cultures of microorganisms exposed to laser radiation. The combined local use of low-intensity laser radiation (NEELY) and copper nanoparticles in experimental animals the core group to 7-days provided the cessation of inoculation made pathogenic microflora, rise to 4-days of granulation and to 14-days of treatment is epithelization of the wound.
Одним из современных способов моделирования ожоговой раны кожи, позволяющим быстро воспроизвести ожоговую рану точно заданной площади и глубины поражения кожи экспериментального животного, является предложение использовать излучение хирургического лазера. Данный способ был разработан, запатентован и апробирован нами в условиях эксперимента при лечении инфицированного ожога кожи [8]. В настоящее время научно обоснована антимикробная активность наночастиц ряда металлов, в частности серебра, меди, железа и др. [1, 9]. Доказано ранозаживляющее действие синтезированного ультрадисперстного порошка меди [6], который в отличие от антибиотиков не вызывает селекции резистентных штаммов, что позволяет в дальнейшем рекомендовать для использования при лечении гнойных заболеваний, вызванных полиан-тибиотикорезистентными штаммами [5].
Высоко оценивается эффективность применения НИЛИ в комплексном лечении гнойных ран [4, 13]. Применение НИЛИ способствует более быстрому очищению ран от гнойно-некротических масс, раннему образованию грануляций, эпителиза-ции раневых дефектов и сокращению сроков лечения [2, 10]; стимулирует макрофагальную реакцию, активирует биосинтетическую функцию фибробла-стов, оптимизирует процессы ангио- и фибрилло-генеза; способствует более быстрому созреванию грануляционной ткани и её фиброзной трансформации, которая завершается к 7-8 суткам [3].
Сочетанное применение нанотехнологий и лазерного излучения нашло применение в экспериментальной онкологии [7, 11, 12]. В работах В. В. Алипо-ва и соавт. (2011) сообщалось о потенцирующем дей-
Алипов Владимир Владимирович - д. м. н., профессор, академик РАЕ, зав. кафедрой оперативной хирургии и топографической анатомии; e-mail: vladimiralipov@yandex.ru
Добрейкин Евгений Алексеевич - аспирант кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии; 410012, Саратов, ул. Б. Казачья, 112; тел. (8452) 66-98-17
Урусова Алина Ивановна - соискатель кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии; 410012, Саратов, ул. Б. Казачья, 112; тел. (8452) 66-98-17
Беляев Павел Александрович - студент 4-го курса; 410012, Саратов, ул. Б. Казачья, 112
ствии НИЛИ и наночастиц меди при неосложнен-ных ожоговых ранах кожи. Таким образом, актуальным направлением в экспериментальной хирургии является моделирование инфицированной ожоговой раны, применение наночастиц металлов, поиск усиления их бактерицидного действия в сочетании с лазерным воздействием на рану.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель работы - разработка способа моделирования инфицированных ожоговых ран и экспериментальное обоснование эффективности сочетанного применения наночастиц меди и низкоинтенсивного лазерного облучения для лечения инфицированных ожоговых ран кожи.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования выполнялись в оперблоке кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии СГМУ им. В. И. Разумовского. В ходе работы использованы «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложения к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. N 755) и Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123), г. Страсбург, 18.03.1986 г. Исследование имеет рекомендацию и положительное заключение комитета по этике ГОУ ВПО Саратовского ГМУ им. В. И. Разумовского (протокол N 1 от 5 сентября 2011 г.). При выполнении всех манипуляций животным использовали внутримышечный наркоз (Sol. Zoletili 0,5%) и его сочетание с местным введением 0,5% раствора новокаина в дозировках, рассчитанных по массе животного.
Моделирование ожоговой раны кожи. Нами в эксперименте на 50 белых лабораторных крысах массой 190-200 г разработан и запатентован новый способ моделирования ожоговой раны кожи [8], который достигается тем, что на выбранный участок кожи накладывают насадку световода лазера, выполненную в виде медной пластинки необходимой формы и размера, и контактно воздействуют на нее лазерным излучением. Способ реализуется следующим образом. Белой лабораторной крысе под двух-компонентным наркозом в межлопаточном пространстве спины сбривается шерсть, кожа обрабатывается спиртом, размечается и бреется участок кожи, к коже подводят насадку - медную пластинку площадью 400 мм и толщиной 1 мм и через торец световода лазера («Лазермед 10 01»), контактно воздействуют на нее излучением длиной волны 1064 нм в постоянном режиме, мощностью на торце световода 7,8-8,2 Вт. Под контролем тепловизора пластинка
нагревается до 220° C, после чего выдерживается на коже еще в течение 2 секунд. В результате создается ожоговая рана последовательно всех слоев кожи до подкожной клетчатки (ожог III Б степени) площадью, соответствующей площади медной пластинки.
Применение НИЛИ при лечении ожоговых ран. В экспериментах при лечении лазером (НИЛИ) пользовались аппаратом АЛТ «Матрикс», тип МЛО1КР (режимы: частота - 80 Гц, мощность излучения -15 мВт, длина волны - 630 нм). Сеансы проводили через день по 2 минуты каждый в течение 14 дней.
Получение и применение наночастиц меди при лечении ожоговых ран. Ультрадисперсный порошок меди получали термолизом в токе оксида углерода оксалата меди. Последний синтезировали из ацетата меди и щавелевой кислоты. Таким способом удаётся получить ультрадисперсный порошок меди, состоящий из её кластеров, включающих фрагменты от 60 до 80 нм и обладающих повышенной устойчивостью на воздухе. Наночастицы меди помещали в стерильные пробирки известной массы для удобства дальнейшего получения стерильных суспензий заданных концентраций. Суспензию наночастиц меди получали при соединении 0,8 мл стерильного подсолнечного масла с 1 мг наночастиц меди с конечной концентрацией 1 мкг/мл. Данное раневое покрытие наносилось на поверхность инфицированной раны в указанной дозе ежедневно каждому животному.
Сочетанное применение наночастиц меди и низкоинтенсивного лазерного излучения на ожоговую рану в эксперименте. Нами изучено влияние сочетанного применения наночастиц меди и низкоинтенсивного лазерного излучения на ожоговую рану в эксперименте на 50 белых лабораторных крысах массой 190-200 г. В целях оценки влияния соче-танного применения наночастиц меди и низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы заживления ожоговой раны проведен эксперимент, в ходе которого животным после создания инфицированной термической ожоговой раны в течение 14 дней проводили лечение низкоинтенсивным лазерным излучением (серия 1), масляной эмульсией наночастиц меди (серия 2), сочетанным воздействием лазера и наночастиц меди (серия 3), левомиколем, как препаратом сравнения (серия 4). Контролем (серия 5) служили животные, которым проводили только хирургическую обработку раны, включающую эвакуацию гноя, извлечение инфицированной марлевой салфетки, удаление некротической ткани и промыванием ее антисептиком. После 3 суток хирургического лечения начинали второй этап специального лечения. Модель гнойной ожоговой раны создавали следующим образом. Под комбинированным наркозом
дно раны подвергали размозжению зажимом Кохе-ра и инфицировали раны лабораторными штаммами Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Для этого из суточных агаровых культур по оптическому стандарту мутности МакФарланда готовили суспензию в физиологическом растворе хлорида натрия в конечной концентрации 3х107 КОЕ/мл и суспензией в объёме 0,1 мл взвеси однократно орошали рану. Для комплексной оценки течения раневого процесса в исследовании использовали методы планиметрического и микробиологического исследования ран, которые осуществляли на 3, 5, 7, 10, 14 сутки, ежедневно оценивали общее состояние животных. Бактериологическое исследование гнойных ран включало изучение качественного состава микробных возбудителей и количественный учет микроорганизмов. Учитывались следующие параметры течения раневого процесса: наличие и характер воспалительной реакции, состояние краев и дна раны, сроки очищения раны от некротических тканей и появления грануляций, характер грануляционной ткани, сроки начала эпителизации ран. Через 14 дней лечения, что соответствовало 17 суткам после воспроизведения ожога, животных взвешивали и выводили из эксперимента передозировкой эфирного наркоза. У животных забирали фрагменты кожи из центра и периферии ожоговой раны (окраска парафиновых срезов гематоксилином-эозином и пикрофуксином). Статистическую обработку результатов проводили с учётом принципов доказательной медицины, с использованием параметрических и непараметрических методов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании гистологических препаратов через сутки эксперимента во всех сериях экспериментов в зоне термического воздействия были обнаружены изменения, характерные для ожога III Б степени: в дерме под базальной мембраной появлялись по-лиморфноядерные лейкоциты, коллагеновые волокна образовывали грубые конгломераты и фрагменти-ровались, разрушались сальные железы и волосяные фолликулы. К 3 суткам после воспроизведения ожога рана покрывалась толстым, жестким струпом буровато-коричневого цвета, спаянным с подлежащими тканями. Края раны у животных группы были утолщены и резко возвышались над струпом, при надавливании из-под струпа выдавливался серозно-гнойный экссудат. На 7 сутки эксперимента ожоговая поверхность оставалась бледной, с редкими грануляциями, фибри-новым налетом и подрытыми краями. На 14 сутки, в целом, размеры раны уменьшились, но её края оставались подрытыми, местами сохранялся трудно отделяемый струп. Анализ процессов формирования и
заживления инфицированных ожоговых ран показал, что на 3 сутки моделированной инфицированной ожоговой раны в межлопаточной области у животных формировалась гнойная рана со всеми характерными признаками гнойного воспаления. Отмечался отек и гиперемия кожи в области нанесения раны, припухлость, у некоторых животных между швами выделялся гной. При пальпации определялась местная гипертермия и флюктуация. Наличие инфициро-ванности подтверждалось бактериологическим посевом раневого содержимого. В среднем перед началом лечения обсеменённость ран Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus составляла 4300±512 КОЕ/мл раневого отделяемого. Площадь ран во всех сериях с лечением была статистически значимо меньшей (p<0,05), чем без лечения.
На 7 день комбинированного хирургического и специального лечения планиметрические характеристики инфицированных ран в сериях 1-2 свидетельствует о том, что раневое покрытие суспензией на-ночастицами меди обладает более эффективным лечебным действием, чем действие НИЛИ. Динамика уменьшения площади ран к 14 суткам при сочетан-ном применении НИЛИ и суспензии наномеди была наиболее заметной, наблюдалось в более ранние сроки наблюдения, чем в сериях 1, 2, 4. Анализ сроков очищения раны, появления грануляций и эпителизации выявил следующее. В серии животных, не получавших лечение, лишь к 10 суткам наметилось очищение раны, а к 14 суткам появление редких грануляций.
Сопоставимыми являются результаты серий 2 и 4 с применением наносуспензий меди и левомиколя: частичная эпителизация констатирована на 13-14 сутки лечения. Очищение раны, появление грануляций и эпителизация в экспериментах 3 серии зарегистрированы сооветственно на 5, 7 и 10 сутки, т. е. на 4 дня раньше, чем в сериях 1, 2, 4. Важным показателем заживления инфицированной ожоговой раны является динамика обсеменённости микроорганизмами. Бактериологическое исследование отделяемого из ран животных показало, что при сочетанном лечении (3 серия) происходит постепенное линейное снижение количества микроорганизмов в ране, максимально выраженное по сравнению с другими группами.
Наиболее приближены к данной динамике показатели в группе животных, которым проводили лечение наномедью, что подтверждает выявленный в экспериментах in vitro факт усиления лазерным излучением бактерицидного действия наночастиц меди. Практически сравнимыми являются данные обсемененности при лечении левомиколем. Однако данный эффект в эксперименте на животных был выражен в меньшей степени (по сравнению с экс-
периментом in vitro), что свидетельствует о необходимости оптимальных концентраций наночастиц меди для лечения инфицированных ожоговых ран.
На 14 сутки лечения у животных 3 серии (лазер + наномедь) отмечен четкий переход фазы воспаления в фазу регенерации и эпителизации раны. Визуально к этому времени отмечалась полная или частичная эпителизация раны без признаков рубцевания. Струп на месте ожога уже отошел, отмечено восстановление всех слоев эпидермиса. Поверхностный слой грануляционной ткани был диффуз-но инфильтрирован лейкоцитами, среди которых преобладали лимфоциты и нейтрофилы. В более глубоком слое наблюдалось обширное пропитывание грануляционной ткани эритроцитами. Сама грануляционная ткань состояла из большого количества формирующихся сосудистых петель и тонкой сети коллагеновых волокон с большим количеством фибробластов. Сосуды тонкостенные и в большинстве полнокровные. В пограничной зоне наблюдалось частичное отслоение эпидермиса от собственно кожи, при этом в целом сохраняются все слои эпидермиса.
Таким образом, анализ гистологических препаратов участков кожи из области инфицированных ожоговых ран показал, что сочетание НИЛИ и применения раневого покрытия суспензией наночастиц меди оказывает более эффективное влияние на процессы репаративной регенерации после воспроизведения инфицированной ожоговой раны. Изучение влияния местного лечения инфицированных ожоговых ран масляной суспензией наночастицами меди, низкоинтенсивным лазерным излучением, в сравнении с использованием левомиколя выявило наличие терапевтического эффекта нового способа лечения, максимально выраженного при сочетанном применении НИЛИ и наночастиц меди при отсутствии явного токсического эффекта на организм.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При изолированном применении лазерного излучения по сравнению с группой контроля площадь инфицированной раны сократилась на 20%, отмечено раннее появление грануляций, хотя полная эпи-телизация не наступила даже к 14 суткам лечения. Бактериальная обсемененность при местном лечении раны ликвидирована лишь к 11 суткам применения НИЛИ.
Наночастицы меди в применяемых концентрациях вызывают резкое сокращение количества микробных клеток Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Бактериальная обсемененность инфицированной раны при местном применении наночастиц
меди исчезла к 9 суткам, тогда как в группе контроля она сохранялась и после 14 суток наблюдения. Частичная эпителизация раны при использовании раневого покрытия с суспензией наномеди наступала через 13-14 суток лечения.
Имеет место синергизм антимикробного действия сочетанного использования наночастиц меди и НИЛИ при воздействии на культуры Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, что позволяет получать антибактериальный эффект при более низких концентрациях наночастиц меди (менее 1 мкг/мл), снижая тем самым возможное токсическое действие данного вещества на организм. Сочетанное применение НИЛИ и наночастиц меди в концентрации 1 мг/ мл обладает терапевтическим эффектом без оказания токсического действия на организм и позволяет проводить лечение без определения типа возбудителя. У экспериментальных животных третьей серии соче-танное лечение давало максимально быстрое и выраженное линейное снижение микробной обсемененно-сти раны по сравнению с другими сериями наблюдений. При сочетанном применении НИЛИ и наномеди переход процесса гнойно-воспалительных явлений в регенераторный период наблюдался на четверо суток раньше, чем во 2 и 4 сериях экспериментов, тем самым сокращался срок эпителизации раны в 1,5 раза, а в сравнении с контрольной серией - в 2 раза.
ВЫВОДЫ
1. Разработанный способ моделирования ожоговых ран с использованием лазера прост в техническом исполнении, значительно сокращает время лазерного воздействия на кожу, экономически целесообразен и доступен, позволяет стандартизировать эксперимент, четко соблюдать заданные критерии площади и глубины ожога и может применяться в экспериментальной хирургии и комбустиологии.
2. Полученные данные экспериментальных исследований с применением планиметрических и микробиологических методов исследования указывают на достаточно высокую эффективность сочетанно-го применения наночастиц и лазерного излучения, по срокам и полноценности эпителизации раны превосходящую применение стандартных способов лечения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бабушкина, И. В. Наночастицы металлов в лечении экспериментальных гнойных ран / И. В. Бабушкина // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2011.- N 3. - С. 530-533.
2. Байбеков, И. М. Влияние низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения на заживление ран / И. М. Байбеков, Р. Ш. Мавлян-Ходжиев,
В. П. Туманов // Бюллетень биологии и медицины. -1995. - N 2. - С. 218-224.
3. Гаджиев, Э. А. Низкоинтенсивное лазерное и импульсно-индукционное магнито воздействие - способ потенциирования традиционной терапии гнойных ран / Э. А. Гаджиев // Лазерная медици-на.-2009. - N 4. - С. 21-28.
4. Гейниц, А. В. Лазеротерапия гнойных ран / А. В. Гейниц // Применение лазеров в хирургии и медицине. - М. - 1988. - С. 148-150.
5. Глущенко, Н. Н. Сравнительная токсичность солей и наночастиц металлов и особенность их биологического действия / Н. Н. Глущенко, О. А. Богословская, И. П. Ольховская // Нанотехно-логия - технология XXI века. - М. - 2006. - С. 93-95.
6. Доронин, С. Ю. Синтез и бактерицидные свойства ультрадисперсного порошка меди / С. Ю. Доронин, Р. К. Чернова, В. В. Алипов, Г. М. Белолипцева, М. С. Лебедев // Известия Саратовского университета. - Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. - 2011. - Т. 1. - N1. - С. 18-22.
7. Патент РФ N 2475251 от 06.02.2012 г. Способ комбинированного лечения абсцессов в эксперименте / В. В. Алипов, М. С. Лебедев, С. Ю. Доронин, О. Г. Шаповал, Н. В. Алипов, Е. А. Лебедева.
8. Патент РФ N 2472232 от 24.03.2011 г. на изобретение Способ моделирования термической ожоговой раны кожи у лабораторных животных /
A. В. Колсанов, В. В. Алипов, Е. А. Добрейкин.
9. Николенко, В. Н. Перспективные нанотех-нологии в области экспериментальной медицины /
B. Н. Николенко, В. В. Алипов, О. А. Фомичева, М.
C. Лебедев, Х. М. Цацаев // Нанотехника. - 2009. -N19. - С. 66-68.
10. Толстых, П. И. Лечение гнойных ран низкоинтенсивным лазерным излучением / П. И. Толстых // Применение лазеров в научных исследованиях и медицинской практике. - М., 1999. - С. 98.
11. Alipov, V. К Lazer nanotechnology in experimet-al surgery. International Kongress «EuroMedica-2012» / V. V. Alipov. - Hannover, 2012. - С. 22-23.
12. Terentyuk, G. S. N. G. Application of gold nanoparticles to x-ray diagnostics and phototermal therapy of cancer. Saratov Fall Meeting: Coherent Optics of Ordered and Random Media VII Ed. D.A / G. S. Terentyuk, I. L. Maksimova, К V. Tuchin, V. P. Zha-rov, V. A. Bogatyrev, L. A. Dykman. - 2007. - Р. 6536: 6537.
13. Tuchin, V. V Laser-induced tissue hyperthermia mediated by gold nanoparticles: toward cancer phototherapy / V. V. Tuchin, G. S. Terentyuk, I. L. Maksimova, L. V. Suleymanova, N. G. Khlebtsov, B. N. Khlebtsov // J. Biomed. Optics. - 2009. - N14 (2), 021016 (1-9).
