CC BY
12
УДК 616.932
Л.Г.Гриднева1, Ю.С.Мусатов1, Т.В.Громова1, Н.М.Пуховская1, Н.Б.Белозерова1, О.М.Уткина1, Л.И.Иванов1, А.Г.Ковальский1, Л.В.Миронова2, Е.С.Куликалова2, Ж.Ю.Хунхеева2, С.В.Балахонов2
результаты мониторинга и биологические свойства холерных вибрионов, изолированных из объектов окружающей среды на территории
хабаровского края
ФКУЗ «Хабаровская противочумная станция», Хабаровск, Российская Федерация;
2ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»,
Иркутск, Российская Федерация
С целью оценки ситуации по холере на территории Хабаровского края в предпаводковый и паводковый периоды 2013 г. проведен анализ результатов микробиологического мониторинга объектов окружающей среды на наличие холерного вибриона. Охарактеризованы показатели высеваемости V. cholerae из объектов окружающей среды Хабаровского края в динамике, осуществлена комплексная микробиологическая, молекулярно-генетическая характеристика и MLVA типирование штаммов V. cholerae eltor. Установлено, что наибольший удельный вес в структуре изолированных штаммов холерного вибриона приходится на вибрионы не О1/О139 серогрупп (97,3 %) с максимальным их выделением в период паводка. Наряду с обнаружением V. cholerae не О1/О139, впервые в регионе в предпаводковый период изолированы потенциально эпидемически опасные штаммы V. cholerae eltor О1 серогруппы с генотипом ctxAB tcpA+ и уникальным MLVA профилем. Результаты мониторинга свидетельствуют о наличии в поверхностных водоемах региона оптимальных для накопления V. cholerae условий и определяют необходимость усиления мероприятий по профилактике холеры в послепаводковый период.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, мониторинг, объекты окружающей среды, биологические свойства, MLVA-типирование.
L.G.Gridneva1, Yu.S.Musatov1, T.V.Gromova1, N.M.Pukhovskaya1, N.B.Belozerova1, O.M.Utkma*, L.I.Ivanov1, A.G.Koval’sky1, L.V.Mironova2, E.S.Kulikalova2, Zh.Yu.Khunkheeva2, S.V.Balakhonov2
Results of Monitoring over and Biological Properties of Vibrio cholerae Isolated from Ambient Environment Objects in the Khabarovsk Territory
1Khabarovsk Plague Control Station, Khabarovsk, Russian Federation;2Irkutsk Anti-Plague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk, Russian Federation
Results of microbiological monitoring of the environment objects for the presence of Vibrio cholerae were analyzed to estimate epidemiological situation on cholera in the Khabarovsk Territory in the pre-flood and flood periods in 2013. V. cholerae isolation rate, collected from environment objects of the Khabarovsk territory, was studied in dynamics. Carried out was complex microbiological molecular-genetic characteristics and MLVA-typing of V. cholerae El Tor. It was established that the greatest relative density in the structure of the isolated V. cholerae strains belonged to non-О1/О139 serogroup (97,3 %) with its maximum rate of isolation in the high water period. In pre-flood period, 2013 for the first time ever in the Khabarovsk Territory along with V cholerae non-О1/О139, isolated were potentially hazardous epidemic V cholerae El Tor serogroup О1 with ctxAB- tcpA+ genotype and a unique MLVA profile. The results of the monitoring indicated that there were optimal for V. cholerae accumulation in surface water reservoirs conditions and it was necessary to enhance measures for cholera prophylaxis in the post-flood period.
Key words: Vibrio cholerae, monitoring, ambient environment objects, biological properties, MLVA-typing.
Первое десятилетие XXI века характеризуется крупными эпидемиями и вспышками холеры и устойчивой тенденцией роста мировой заболеваемости [2]. Эволюция возбудителя холеры в эндемичных странах привела к появлению новых вариантов вибриона эльтор, сочетающих в себе признаки классического и эльтор биоваров, которые получили дополнительные селективные преимущества для проникновения и закрепления их на новых территориях [2, 4, 6]. О масштабах эпидемических осложнений, которые могут вызывать такие атипичные штаммы с измененным геномом, свидетельствуют продолжающиеся с 2010 г. эпидемические осложнения по холере в регионе Карибского бассейна, охватившие о. Гаити, Доминиканскую Республику, Кубу, Мексику [5, 7]. Ежегодно регистрируются заносы холеры из эндемичных и вновь вовлеченных в эпидпроцесс стран
на свободные от холеры территории [2, 7].
В таких условиях мониторинг вибриофлоры имеет важное эпидемиологическое значение, поскольку доказана роль поверхностных водоемов в накоплении возбудителя холеры (в случае заноса его на территорию) и формировании местных очагов, связанных с водопользованием населения [3]. Актуальность этому на территории Хабаровского края придает эпидемическое неблагополучие по холере на сопредельной территории (КНР), постоянная миграция населения, высокая вероятность завоза холеры через речные порты и международные аэропорты Хабаровского края, массивное загрязнение пограничной р. Амур водами рек (притоков р. Амур) Китая. Все это обусловливает высокую вероятность заноса возбудителя холеры на территорию и развития эпидемических осложнений по холере, связанных, прежде всего, с реализацией
водного пути передачи инфекции.
В системе эпиднадзора за холерой для прогнозирования эпидемиологической обстановки на каждой конкретной административной территории важнейшее значение приобретает наличие многолетних данных о циркуляции в объектах окружающей среды холерных вибрионов и их биологических свойствах. Хабаровская противочумная станция проводит наблюдение за вибриофлорой поверхностных водоемов на территории Хабаровска с 1958 г. Результаты этого мониторинга свидетельствуют о постоянном обнаружении холерных вибрионов не О1/О139 серогрупп в воде поверхностных водоемов и хозяйственнобытовых сточных водах города. Выявление V. chole-rae О1 серогруппы в 1995-2006 гг. из воды р. Амур свидетельствовало о наличии благоприятных экологических условий для персистенции холерного вибриона. Эпидемиологическое благополучие на территории объяснялось тем, что все культуры О1 серогруппы были авирулентными по фаговому тесту и пробе Грейга (т.е. вызывали гемолиз эритроцитов барана) и не содержали генов ctxAB и tcpA при тестировании в ПЦР. Лишь у одного штамма, изолированного из воды р. Амур в августе 1999 г., в первых генерациях был выявлен ген, кодирующий синтез холерного токсина (ctxAB), и по результатам изучения вирулентности штамма на модели кроликов-сосунков он был отнесен к слабовирулентным.
Целью настоящего исследования является анализ результатов мониторинга контаминации холерными вибрионами поверхностных водоемов в Хабаровском крае за 2013 год.
Материалы и методы
В работе использовано 72 штамма Vibrio chole-rae не О1/О139 и 2 - V. cholerae eltor Ogava, выделенные из поверхностных водоемов и сточной воды на территории Хабаровского края в 2013 г.
Отбор проб проводился с мая по октябрь еженедельно в 20 эпидемиологически обоснованных точках стационарного наблюдения девяти поверхностных водоемов. Кроме этого, на исследование доставлялась сточная вода с двух городских канализационных станций. В период паводка (август-сентябрь
2013 г.) в целях усиления бактериологического контроля количество точек отбора проб воды и их география были расширены.
Изучение культурально-морфологических, биохимических и серологических свойств выделенных холерных вибрионов, а также их чувствительность к бактериофагам C, eltor проводили в соответствии с МУК [1]. Для молекулярно-генетической идентификации и обнаружения маркеров токсигенности штаммов использовали тест-систему АмплиСенс Vibrio cholerae-FL (ИнтерЛабСервис, Москва) в соответствии с наставлением производителя. Таксономическую принадлежность исследуемых культур к V. cholerae дополнительно определяли на основании MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа с применением расширенной базы данных MALDI Biotyper 3,0 на масс-спектрометре Microflex™ LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Германия), а также секвенированием участка гена, кодирующего 16S рибосомальную РНК, с помощью набора «MicroSeq 500 16S rDNA Bacterial Identification Kit». Мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов в штаммах V. cholerae eltor (MLVA-типирование) проводили на основании определения структуры пяти локусов - VcA, VcB,VcC, VcD, VcG с идентификацией их размеров посредством капиллярного электрофореза на ДНК-анализаторе ABI Prism 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).
Результаты и обсуждение
При проведении эпиднадзора за холерой в Хабаровском крае осуществлялся бактериологический контроль объектов окружающей среды: р. Амур, малые реки и озера, хозяйственно-бытовые сточные воды (12, 8, 2 стационарные точки наблюдения соответственно). В течение мая-сентября 2013 г. было исследовано 310 проб воды из р. Амур (изолировано 39 культур), 228 проб из малых водоемов (выделено 33 культуры V. cholerae не О1/О139 и 2 штамма Vibrio cholerae eltor), 101 проба сточной воды (9 штаммов не О1/О139). Результаты сезонной динамики высева-емости объектов окружающей среды представлены на рисунке.
Первые находки холерного вибриона не О1/О139
Высеваемость V. Лоїете из объектов окружающей среды Хабровского края в 2013 г.: по оси X - период мониторинга, по оси У - процент положительных на V. Лоїете проб
Выделение Vibrio cholerae не O1/O139 на территории Хабаровского края
Объект Период Показатель Месяц Всего за сезон
V VI VII VIII IX
р. Амур 2008-2012 гг. Исследовано проб 246 249 328 360 244 1427
Выделено штаммов 5 17 41 60 19 142
% 2 6,8 12,5 16,6 7,8 9,95
2013 г. Исследовано проб 48 48 81 73 59 309
Выделено штаммов 1 3 5 25 5 39
% 2,1 6,25 6,2 34,2 8,5 12,6
Малые водоемы 2008-2012 гг. Исследовано проб 85 167 319 322 108 1001
Выделено штаммов 7 16 18 32 13 86
% 8,25 9,6 5,65 9,9 12 8,6
2013 г Исследовано проб 16 32 88 62 29 227
Выделено штаммов 1 2 6 (+2) 17 7 33(+2)
% 6,25 6,25 9,1 27,4 24,1 15,4
Канализационные 2008-2012 гг. Исследовано проб 58 76 110 91 86 421
системы Выделено штаммов 4 8 15 14 6 47
% 6,9 10,5 13,6 15,4 7 11,2
2013 Исследовано проб 12 24 30 17 18 101
Выделено штаммов -0 2 0 2 5 9
% 0 8,3 0 11,8 27,8 8,9
серогрупп в воде поверхностных водоемов (р. Амур) зарегистрированы во второй декаде мая при температуре воды 12-15 °С и рН 7,0. В предпаводковый период процент высеваемости V. cholerae не О1/О139 группы из проб воды поверхностных водоемов составил 4,7 %, хозяйственно-бытовых сточных вод -5,5 %. При повышении температуры (до 21-27 °С) и уровня воды в водоемах в августе-сентябре (период паводка) зарегистрирована и максимальная конта-минированность холерным вибрионом воды поверхностных водоемов - 24,2 %, сточных вод - 20,0 %.
Сопоставление данных мониторинга вибри-офлоры объектов окружающей среды в 2013 г. со среднемесячной частотой обнаружения V. cholerae, рассчитанной за 5 лет (2008-2012 гг.), свидетельствует о значительном увеличении показателя вы-севаемости холерного вибриона (в два и более раза) из проб воды поверхностных водоемов в пик паводка (август-сентябрь 2013 г.), таблица.
Изучение биологических свойств выделенных холерных вибрионов не О1/О139 показало. что все они были типичными по культуральноморфологическим свойствам. Штаммы V. cholerae не О1/О139, выделенные из различных объектов, практически не отличались по биохимической активности. Все они характеризовались принадлежностью к первой группе Хейберга, ферментировали до кислоты глюкозу, сахарозу, маннозу, маннит, не разлагали инозит, арабинозу, содержали декарбоксилазу лизина и орнитина, не обладали дегидролазой аргинина и уреазой, расщепляли крахмал, образовывали ацетил-метилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра.
Штаммы холерного вибриона не О1/О139 группы не агглютинировались специфическими холерными сыворотками О1, Инаба, Огава, RO и О139, были резистентны к фагам С, eltor, ХДФ-3,4,5.
Помимо вибрионов не О1/О139 серогруппы, из
проб воды, отобранных 16.07.2013 г. в стационарной точке р. Черная у п. Черная речка, было изолировано две культуры, идентифицированные как Vibrio cholerae eltor Ogava. Обе культуры типичны по тинкто-риальным, культурально-морфологическим, биохимическим свойствам, агглютинируются до титра холерными О1 и Огава сыворотками, дают специфическое свечение в реакции иммунофлуоресценции, вызывают гемолиз эритроцитов барана в пробе Грейга. Оба штамма лизируются классическим холерным фагом в разведении 10-1, тогда как при оценке чувствительности к диагностическому фагу эльтор один из штаммов (V cholerae eltor № 286) лизировался только цельным фагом, второй (V cholerae eltor № 287) - в разведении 10-2.
Углубленное изучение указанных штаммов в Региональном центре по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I-II групп патогенности на базе ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора подтвердило их таксономическую принадлежность к V. cholerae на основании определения спектра константных белков («достоверная идентификация до вида» max score 2,546 и 2,580) и структуры фрагмента гена 16S rDNA (100 % соответствие нуклеотидной последовательности указанного гена исследуемых штаммов V. cholerae с нуклеотидной последовательностью референсного штамма из базы данных программы MicroSEQ® ID 16S rDNA 500 Library v2.1).
Оценка эпидемической значимости в ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени показала наличие в геноме штаммов V. cholerae eltor О1 гена tcpA, детерминирующего биосинтез основной структурной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона, при отсутствии гена холерного токсина ctxА, что дает основание расценить данные штаммы как потенциально эпидемически
опасные. При MLVA типировании выявлен не характерный для изолируемых из поверхностных водоемов на фоне эпидемиологического благополучия штаммов холерного вибриона локус VcB с уникальной структурой, характеризующейся большим количеством повторов. В целом аллельный профиль обоих штаммов определен как VcA18, VcB30, VcC12, VcD9, VcG6.
Профиль чувствительности штаммов к антибиотикам оказался вариабельным: один из них чувствителен к левомицетину, ципрофлоксаци-ну, ко-тримоксазолу, норфлоксацину, азитромици-ну, имипенему, меропинему; второй - отличается по антибиотико-чувствительности к гентамицину, ципрофлоксацину, ко-тримоксазолу.
Таким образом, данные микробиологического мониторинга поверхностных водоемов Хабаровского края в 2013 г. свидетельствуют о том, что вибриоф-лора их представлена преимущественно вибрионами не О1/О139 серогрупп (97,3 %). При этом анализ сезонной динамики выделения V cholerae из поверхностных водоемов показал значительное повышение уровня контаминации проб воды в паводковый период 2013 г. Обнаружение впервые в гидросфере Амурского бассейна в предпаводковый период потенциально эпидемически опасных вариантов V. chol-erae eltor, содержащих ген токсин-корегулируемых пилей адгезии, и однократность их выделения позволяют предполагать возможность заноса указанного варианта холерного вибриона в водоем Хабаровска. Все это свидетельствует о наличии в поверхностных водоемах региона оптимальных для накопления V. cholerae условий и определяет необходимость усиления мероприятий по профилактике холеры в по-слепаводковый период.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Лабораторная диагностика холеры: Методические рекомендации МУК 4.2.2218-07. М.; 2007 87с.
2. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Арешина О.А., Адаменко О.Л. Оценка эпидемиологической обстановки по холере в мире в современный период. Прогноз. Пробл. особо опасных инф. 2011; 1(107):16-9.
3. Марамович А.С., Урбанович Л.Я., Миронова Л.В., Куликалова Е.С. Эволюция эпидемиологии холеры. Журн. ми-кробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006; 6:63-71.
4. Смирнова Н.И., Горяев А.А, Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры в современный период. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2010; 4:11-9.
5. Pun S.B. Understanding the Cholera Epidemic, Haiti. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(11):2178-9.
6. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.C. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010, 18(1):46-4.
7. Weekly epidemiological record. 2013; 88(31):321-36. http:// www.who.int/wer/2013/wer8831.pdf
References
1. [Laboratory Diagnostics of Cholera. Methodological Regulations]. MR 4.2.2218-07. M.; 2007. 87 p.
2. Lomov Yu.M., Moskvitina E.A., Areshina O.A., Adamenko O.L. [Assessment of cholera epidemiological situation in the world in the present period. Prognosis]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2011; 1(107):16-9.
3. Maramovich A.S., Urbanovich L.Ya., Mironova L.V., Kulikalova E.S. [Evolution of cholera epidemiology]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2006; 6:63-71.
4. Smirnova N.I., Goryaev A.A., Kutyrev V.V. [Evolution of the cholera agent genome in the modern period]. Mol. Genet. 2010; 4:11-9.
5. Pun S.B. Understanding the Cholera Epidemic, Haiti. Emerg. Infect Dis. 2011; 17(11):2178-9.
6. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.C. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010, 18(1):46-4.
7. Weekly epidemiological record. 2013; 88(31):321-36. http://www. who.int/wer/2013/wer8831.pdf
Authors:
Gridneva L.G., Musatov Yu.S., Gromova T.V., Pukhovskaya N.M., Belozerova N.B., Utkina O.M., IvanovL.I., Koval’skyA.G. Khabarovsk Plague Control Station. 7, Sanitarny Line, Khabarovsk, 680031, Russian Federation. E-mail: chum@chum.khv.ru
Mironova L.V., Kulikalova E.S., Khunkheeva Zh.Yu., Balakhonov S.V. Irkutsk Research Anti-Plague Institute of Siberia and Far East. 78, Trilissera St., Irkutsk, 664047, Russia. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru
Об авторах:
Гриднева Л.Г., Мусатов Ю.С., Громова Т.В., Пуховская НМ., БелозероваН.Б., Уткина ОМ., Иванов Л.И., Ковальский А.Г. Хабаровская противочумная станция. Российская Федерация, 680031, Хабаровск, Санитарный переулок, 7. E-mail: chum@chum.khv.ru
Миронова Л.В., Куликалова Е.С., Хунхеева Ж.Ю., Балахонов С.В. Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока. Российская Федерация, 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78. E-mail: adm@chumin.irkutsk.ru
