Рекомбинантные интерфероны-альфа человека пролонгированного действия Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Сер. 3 2007 Вып. 4

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

УДК 573.6.086.83:57721]: [615.373.3+615.277) А, В. Карабельский, М. В. Падкина

РЕКОМБИНАНТНЫЕ ИНТЕРФЕРОНЫ-АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ

В последние годы рынок лекарственных средств, произведенных с помощью методов биотехнологии, неуклонно растет. Фармакологическая биотехнология использует микроорганизмы, макроорганизмы и культуры клеток для создания новых лекарственных средств, повышения эффективности уже существующих лекарственных средств и для снижения стоимости производства лекарств. Основную массу рекомбинантных молекул составляют: цитокины, ферменты, гормоны, моноклональные антитела, вакцины, факторы свертывания крови и др, Использование биотехнологии позволяет получать рекомбинантные белки, которые не отличаются от природных молекул, что значительно снижает риск возникновения побочных реакций при их применении.

Интерфероны (ИНФ)—это группа биологически активных пептидов или гли-копротеидов, синтезируемых клеткой в ходе защитной реакции в ответ на вирусное воздействие. Благодаря своим антипролиферативным свойствам и способности подавлять репликацию вирусов, ИНФ-а активно используют в терапии гепатита, стоматита, лейкемии, меланомы и саркомы. Кроме того, не исключается возможность применения ИНФ и в лечении ВИЧ-инфекций.

Развитие методов клонирования ДНК послужило основой получения и исследования генно-инженерных препаратов. К настоящему времени создано большое количество систем гетерологичной экспрессии, обеспечивающих синтез белков человека, в том числе и интерферонов. Практически все существующие на рынке препараты рекомбинантных ИНФ-а человека созданы на основе Escherichia coli. Длительное применение рекомбинантных ИНФ бактериального происхождения сопровождается побочными эффектами. Поэтому особенно актуальной на сегодняшний день является проблема улучшения фармакологических свойств рекомбинантных интерферонов.

Пути повышения клинической эффективности лекарственного вещества могут быть различными: это изменение его химической структуры, соединение с другими препаратами, способными усилить или наоборот ослабить действие основного препарата. Модификация белков или пептидов является проблематичной, поскольку7 изменение их структуры может или ослабить биологические свойства, или способствовать появлению побочных эффектов в процессе лечения (например, такие препараты могут быть иммуногенными).

В настоящее время основными способами повышения эффективности действия лекарственных препаратов являются пегилирование (коваленгное присоединение к белку молекулы полиэтиленгликоля, ПЭГ) и получение «химерных» белков (гибридных молекул), состоящих из альбумина человека и лекарственного белка.

© А. В. Карабельский, М. В. Падкина, 2007

Альфа-интерферон. В настоящее время известно три класса интерферонов: лейкоцитарный, или а-интерферон, фибро-бластный, или (3-интерферон, и иммунный, или у-интерферон (рис. 1).

Благодаря относительному сходству функций и аминокислотных последовательностей ИНФ-а и ИНФ-(3 объединены в одно семейство интерферонов I типа, тогда как ИНФ-у выделяют в отдельное семейство интерферонов П типа [37, 38]. Натив-ный ИНФ-у человека существует в растворе в виде гомодимера, в то время как активными формами ИНФ I типа являются мономеры [42]. Однако, несмотря на то, что для ИНФ I типа не доказано существование димеров в растворе, нельзя исключить, что димеризация может происходить при взаимодействии этих белков с рецепторами [29].

ИНФ-а синтезируется лейкоцитами (В-, Т-лимфоцитами, макрофагами) после воздействия на них митогенов, вирусов, чужеродных и опухолевых клеток. В коротком плече 9-й хромосомы человека находится кластер структурных генов интерферонов I типа, который включает 13 генов ИНФ-а (Ш 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17, 21) [21, 22]. Различные ИНФ-а на 80% идентичны между собой [36]. Для некоторых генов (ШМ1, ШЕА2, ШЕА4) обнаружено явление полиморфизма, поэтому существует два варианта ИНФ-а1 (а, Ь), три варианта ИНФ-а2 (а, Ь, с) и два варианта ИНФ-а4 (а, Ь) [27, 28].

Недавние исследования показали, что спектр активностей ИНФ-а у представителей семейства может различаться. Некоторые ИНФ-а (ИНФ-а8, ИНФ-а17) оказались значительно более эффективными в лечении ряда вирусных заболеваний, чем ИНФ-а2Ь [18, 23]. Действие системы интерферонов направлено, прежде всего, на распознавание и элиминацию чужеродной генетической информации. Многообразие обнаруживаемых и изученных к настоящему времени физиологических функций ИНФ также указывает на их контрольно-регуляторную роль в сохранении гомеостаза. Основные эффекты ИНФ можно подразделить на противовирусные, антимикробные, противоопухолевые и иммуномодулирующие [1].

Рис. 1. Пространственная структура молекул интерферонов.

А — а-интерферон (мономеры), [http://commons.wikimedia.org/wiki/ Image:lRH2Recombinant_Human_Interferon-Alpha_2b]; Б—[3-интерферон (мономеры), [http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:lAUl_ Human Interferon-BetaO 1 .png]; В—у-интерферон (гомодимер), [http://www.chemsoc.org/ExemplarChem/entries/2004/ warwick_robinson/interferon%20complex.jpg].

Экспрессия ИНФ-а осуществляется на самых ранних стадиях инфекции и предшествует экспрессии большинства других цитокинов. ИНФ-а играет ключевую роль в запуске раннего иммунного ответа, прямо или косвенно действует на многие клеточные функции в процессе иммунного ответа, индуцирует продукцию важнейших цитокинов, таких, как ИНФ-у и ИЛ-2, обеспечивает связь врожденного и приобретенного иммунитетов и принимает непосредственное участие в создании иммунологической памяти.

В настоящее время ИНФ-а является важным компонентом фармакотерапии в лечении ряда вирусных, онкологических и аутоиммунных заболеваний [12, 40]. Анти-пролиферативные, противовирусные и иммуномодулирующис свойства ИФН-а обеспечили его использование в клинической практике. Наиболее успешно ИНФ-а применяется в терапии гепатита С (HCV), энцефаломиокардига (ЕМС), везикулярного стоматита (VSV) и лимфатического хориоменингита (LCMV), ИНФ-а используют в лечении некоторых герпетических инфекций, а также хронического гепатита В [14, 25, 45]. Обсуждается возможность использования препаратов интерферона в терапии больных ВИЧ [10, 41].

Развитие генной инженерии позволило клонировать и экспрессировать гены интер-феронов в эукариотических и прокариотических системах. Для получения больших количеств ИНФ-а были созданы штаммы-продуценты активного белка (ИНФ-а2а и ИНФ-а2Ь) на основе микроорганизмов. В настоящее время на рынке существуют несколько препаратов рекомбинантного ИНФ-а2, полученного из Е. coli («Берофор», Boehringer ingelheim, Германия; Интрон-А, Schering-Plough, США; «Реаферон», Вектор-фарм, Россия).

Рекомбинантный ИНФ-а2 по своим функциям полностью соответствует природному, однако короткий период полужизни белка в кровяном русле и в связи с этим частые инъекции препарата, сопровождающиеся побочными эффектами, показали целесообразность модификации молекулы интерферона для улучшения его фармакокинетических и фармакодинамических свойств. Сейчас работы в этой области ведутся во многих лабораториях мира, и наиболее актуальными являются исследования, посвященные созданию химерных молекул, содержащих наряду с активным пептидом последовательности альбумина и полиэтиленгликоля.

ПЭГ-интерферон. Одним из путей повышения эффективности лекарственных препаратов белковой структуры является химическая модификация их молекулы, достигаемая соединением нативной молекулы с полиэталенгликолем (ПЭГ) (данный процесс получил название «пе-гилирование») (рис. 2) [22]. Подобная химическая модификация фармакологических препаратов пептидной структуры направлена на повышение периода их полужизни, улучшение их переносимости, снижение иммуногенности, и как следствие, на значительное повышение качества жизни пациентов в процессе лечения [39, 43, 49, 50].

Рис. 2. Пространственная структура химерной молекулы «ИНФ-а2Ь-ПЭГ» (ИНФ-а2Ь, Schering Plough, США)

[http://www.journalonko.de/bilder/0802/ph02.jpg].

В настоящее время на рынке представлен препарат решмбинангного ИНФ-а2Ь, «сшитого» с молекулой ПЭГ. Данный препарат уже прошел все необходимые клинические испытания и зарегистрирован к применению во всех ведущих европейских странах (в том числе и в России) и США под коммерческим названием ПЭГ-Интрон (Schering Plough, США, 2001) и рекомендован для использования в лечении гепатита С. На рис. 3 представлены основные параметры фармако кинетики двух препаратов: природного ИНФ-сс2Ь и пегилиро-ваннош коньюгата ПЭГ-ИНФ-сс2Ь (ПЭГ-Ингрон) при терапии гепатита С [8].

Очевидно, что ПЭГ-ИФН-а2Ь имеет значительно лучший биологический профиль, нежели ИНФ-а2Ь; это выражается существенным повышением периода полужизни пегилированного аналога. Присоединение относительно небольшой молекулы ПЭГ молекулярной массой 12 кДа к ИНФ в опытах in vivo продемонстрировало, что максимальная концентрация белка при использовании такого коньюгата достигается через 15-44 ч и сохраняется в течение 48-72 ч. Таким образом, период «эффективной» полужизни препарата составляет в среднем около 40 ч. Замедление выведения (клиренса) ПЭГ-ИФН-а2Ь из плазмы обеспечивает циркуляцию его в крови в течение недели. Именно такие фармакокинетические и фарма-кодинамические параметры препарата обеспечивают заведомо более высолю эффективность ПЭГ-ИФН-а2Ь по сравнению со стандартным ИНФ-а2Ь [8, 24, 43, 49].

Таким образом, для ПЭГ-ИФН-а2Ь характерен баланс между противовирусной активностью и длительным периодом полувыведения, позволяющим назначать препарат один раз в неделю, а также эффективно выводить метаболиты ПЭГ из организма [2].

ПЭГ-модифицированные пептидные препараты имеют на сегодняшний день большие перспективы при лечении таких заболеваний, как ферментные дефициты, лейкемия, хронические воспалительные заболевания, онкология, хронические вирусные инфекции, кардиоваскулярная патология. Пегилированные лекарственные препараты пептидной структуры обладают рядом весомых и несомненных преимуществ по сравнению с природными аналогами: усиление биологической активности, удлинение периода «эффективной» полужизни, замедление выведения, отсутствие пиков плазменной/тканевой концентрации, понижение токсичности и иммуногенности [8, 30]. Кроме того, было показано, что ПЭГ-модифицированные ИНФ-а2а и ИНФ-а2Ь не индуцируют развитие депрессии, которая является следствием инъекции ИНФ [31].

Основным недостатком ПЭГ-коньюгированных пептидов является возможное уменьшение активности белка, связанное с выбором «неправильного» размера или структуры ПЭГ; с этой же причиной может быть связано и возможное удлинение времени элиминации пептида [4]. В некоторых случаях терапия гепатита С ПЭГ-интроном не дает ожидаемых результатов, что делает необходимым поиск новых модифицированных препаратов [7].

Химерный белок «Альбумин-интерферон». Многочисленные эксперименты по улучшению фармако кинетических свойств ИНФ-а привели к созданию химерного белка, в котором к молекуле ИНФ «пришита» молекула альбумина человека—основного

пг/мл

юоон

100-

10

30-10-

Пегилированныи интерферон альфа-2Ь 1,5 мкг/кг

4—Ь

-4-

-1-Ь

24 48

72 96 120 144 168 192 Время (часы)

Стандартный интерферон альфа-2Ь 3 млн МЕ х 3 раза в неделю

Рис. 3. Изменение концентраций стандартного (природного) и пегилированного ИНФ-а2Ь в Крови [http://medi.ru/doc/08hl301.htm].

компонента плазмы крови. Сывороточный альбумин человека (HSА) — это глобуляр ный белок, состоящий из 585 АК и имеющий молекулярную массу около 66 кДа. Период его полужизни примерно 19 дней. Альбумин обладает рядом ценных свойств, главным из которых является его способность связывать и транспортировать эндо-и экзогенные лиганды (в том числе и белки). Таким образом, он играет роль естественного стабилизатора и переносчика белков плазмы крови. Ранее альбумин уже использовали в экспериментах по созданию химерных белков, применяемых в терапии («альбумин-хирудин», «альбумин-С04»), Все эти белки имели длительный период полужизни и обладали высокой стабильностью [47, 48]. Создание активного препарата, «сшитого» с альбумином ИНФ-а, позволит скомбинировать высокую иммунологическую активность интерферона с фармакокинетическими преимуществами альбумина.

Функциональные отличия между видами интерферона-альфа до конца не установлены. Известно лишь, что некоторые ИНФ-а могут обладать большей противовирусной активностью по сравнению с другими (см. ранее). Поэтому на сегодняшний день получение рекомбинантных препаратов различных видов ИНФ-а и их модифицированных форм является особенно актуальным.

К настоящему времени было создано 2 варианта гибридного белка, состоящего из альбумина человека и ИНФ-а.

Корпорация Schering Plough сообщила о создании штамма дрожжей Kluyveromyces lactis продуцента химерного белка «Альбуферона», иммуннологачески-активным компонентом которого является ИНФ-а2Ь (Intron-A; Schering Plough Corp., Kenilworth, NJ) [34, 46].

В лаборатории биохимической генетики БиНИИ СпбГУ был получен химерный белок на основе метилотрофных дрожжей Pichia pastoris, состоящий из альбумина человека и ИНФ-а16 («Альбурон 16») [2, 3],

Большая часть работ по созданию продуцентов гетерологичных белков проведена на Escherichia coli. Однако, так как Е. coli является прокариотическим условно-патогенным микроорганизмом, то для получения медицинских препаратов требуется высокая степень очистки гетерологичного белка. Альтернативой может быть создание эукариотических систем экспрессии на основе дрожжей, которые сочетают простоту работы с прокариотическими системами с высоким уровнем синтеза гетерологичного белка. Химерный белок Альбуферон-ß (ША-ИНФ-ß) был получен из культуры клеток млекопитающих, а химерный белок Альбуферон (ША-ИНФ-а2Ь)—из дрожжей Kluyveromyces lactis [34, 46]. Нецелесообразность использования штаммов-продуцентов на основе дрожжей К lactis заключается в гипергликозилировании секретируемых рекомбинантных белков, что может сопровождаться практически полной потерей биологической активности [19, 33]. Кроме того, для трансформации клеток К. lactis используют репликативные плазмиды, которые содержат в своем составе ген устойчивости к ге-нетицину (G418), что может быть потенциально опасным в связи с вероятностью горизонтального переноса генов устойчивости к антибиотикам [20].

Химерный белок Альбурон 16 (альбумин-ИНФ-а16) был получен из метилотрофных дрожжей Pichia pastoris. Данный вид дрожжей характеризуется высокой продуктивностью и способностью секретировать рекомбинантный белок в культуральную среду. Использование интегративных плазмид позволяет получать стабильные штаммы дрожжей, не содержащие бактериальную ДНК и генов устойчивости к атнибиотикам [15, 16, 32]. Кроме того, белки, секретируемые дрожжами Р. pastoris, не являются иммуногенными и сохраняют свою биологическую активность за счет корректной посттрансляционной модификации [6, 11, 17].

Альбуферон (Schering Plough) —белок с молекулярной массой около 85,7 кДа. К С-концу решмбинангного альбумина с помощью методов генной инженерии «пришит» N-конец рекомбинантного ИНФ-а2 (рис. 4). Альбуферон в настоящее время проходит последние стадии клинических испытаний, которые продемонстрировали значительные его преимущества в сравнении с рекомбинангным ИНФ-а2Ь [13].

Для выявления противовирусных и антипр о л ифер атив ных свойств белка in vitro проводили сравнение активности Альбуферона и ИНФ-сх2 на нескольких клеточных линиях. Для изучения фармакокине-тических и фармакодинамических свойств химерного белка in vivo исследования проводили на приматах.

Результаты анализа in vitro показали, что Альбуферон ингибирует пролиферацию клеток и имеет чуть более низкую противовирусную активность, чем ИНФ-а2. Однако сниженный уровень активности Альбуферона in vitro компенсируется его улучшенными фармакокинетическими свойствами [34].

Химерный белок Альбуферон обладает улучшенными фармакологическими характеристиками, прежде всего, за счет длительного периода полужизни, замедленного клиренса и высокой стабильности в плазме крови. Фармакокинетический анализ in vivo показал, что выведение Альбуферона (клиренс) начинается преимущественно на 10-й день после его инъекции. При подкожном введении препарата период полужизни Альбуферона составляет около 90 ч, что в 18 раз больше, чем у ИНФ-а2, и в 3 раза больше, чем у «ПЭГ-Интрона».

Фармакокинетеческие преимущества Альбуферона положительным образом сказываются на его противовирусной и антипролиферативной активностях. В качестве маркера антивирусной активности Альбуферона in vivo использовали ИНФ-а-зависимое увеличение концентрации мРНК 2'-5'-олигоаденилатсингазы (2'-5'-ОАС) [34]. Этот фермент активирует латентную эндорибонуклеазу (РНКазу L), разрушающую вирусную РНК [34].

Показано, что однократная инъекция Альбуферона резко увеличивает концентрацию 2'-5'-ОАС мРНК и поддерживает ее примерно на одном уровне в течение 8 дней, в то время как антивирусная активность ИНФ-а2 сохраняется лишь в течение 24 ч после инъекции, а активность ПЭГ-Интрона наблюдали в течение 120 ч [34].

Сходные результаты были получены при исследовании активности химерного белка Альбуферона-ß (т. е. химерного белка, состоящего из альбумина и ИНФ-ß человека) на приматах. В частности было показано, что период его полужизни около 36-40 ч, что в 5 раз больше, чем у наливного ИНФ-ß. Однократное введение Альбуферона-ß повышает концентрацию неоптерина (индикатора клеточного иммунитета) в плазме крови, а также активирует продукцию 2'-5'-ОАС [46].

Результаты клинических исследований фармакологических свойств Альбуферона-а на приматах предполагали, что период полужизни белка в плазме крови человека будет составлять от 90 до 288 ч. Недавно проведенные клинические испытания химерного белка на больных хроническим гепатитом С подтвердили это предположение. Химерный белок имел замедленный клиренс, период полужизни около 159 ч и устойчивую

Рис. 4. Возможная пространственная структура химерного белка «HSA-HHO-a2» [http://www.natap.org/2005/AASLD/aasld_38.htm].

противовирусную активность. При этом интервал между инъекциями лекарства составлял от 2 до 4 недель [9]. Подобная терапия невозможна даже при использовании модифицированных пегилированных препаратов.

Известно, что терапия гепатита С ИНФ-а сопровождается значительными негативными побочными эффектами [35]. Было показано, что инъекции ИНФ-а2 приводят к изменениям в системе метаболизма серотонина и снижению его уровня в мозге, что часто приводит к тяжелой депрессии [44]. Кроме того, интенсивная терапия ИНФ иногда приводит к развитию анемии [26]. Таким образом, более редкое введение модифицированного препарата ИНФ позволяет снизить риск появления побочных эффектов действия ИНФ и тем самым значительно упростить процесс лечения [34].

Альбурон 16 (ЛБГ БиНИИ СПбГУ)—белок с молекулярной массой около 86 кДа, в котором к С-концу рекомбинантного альбумина «пришит» N-конец рекомбинантно-го ИНФ-а16. Использованный способ конструирования вектора, а именно отсутствие линкера между геном HSA и INFA16 и расположение гена HSA со стороны 5'-конца экспрессионной кассеты, позволило получить штамм дрожжей Pichia pastoris, секре-тирующий около 25 мг/л биологически активного рекомбинантного белка [2, 3].

Ранее в лаборатории биохимической генетики БиНИИ был создан штамм дрожжей Pichia pastoris, секретирующий рекомбинантный ИНФ-а 16 человека [5]. Доклинические испытания рекомбинантного ИНФ-а16 человека на острую и хроническую токсичность, проведенные в Научно-исследовательском испытательном центре государственного научно-исследовательского института военной медицины МО РФ (Санкт-Петербург), показали, что применение этого препарата, несмотря на присутствие примесных дрожжевых белков, не сопровождается побочными эффектами, наблюдаемыми при использовании Реаферона (ИНФ-а2 человека бактериального происхождения), что подтверждает преимущества дрожжей как продуцентов белков человека медицинского назначения. Кроме того, рекомбинантный ИНФ-а16 человека демонстрировал более высокую антивирусную активность по сравнению с Реафероном. Поэтому нельзя исключить, что химерный белок, состоящий из альбумина человека и ИНФ-а16 (Альбурон 16), наряду с улучшенными фармакологическими характеристиками, будет обладать более высокой противовирусной или антипролифератив-ной активностями, чем гибридый белок HSA-HF№-a2b (Альбуферон). Учитывая данные о свойствах подобных химерных белков, можно сделать заключение, что полученный рекомбинантный белок Альбурон16 будет востребован в дальнейшем в качестве противовирусного или антипролиферативного лекарственного импортозамещающего препарата.

Summary

KarabelskyA. V, PadhnaM. V. The recombinant human interferon alphas of the prolonged action.

Nowadays the recombinant interferon alphas are widely used in the treatment of viral and oncological diseases. The use of recombinant interferon alpha developed from bacteria cells has different side effects during the therapy period. In the cunent review the native and recombinant interferon alphas action is discussed and the ways of their pharmacological property improving by modifications and using the yeast expression systems are considered.

E-mail: [email protected]

Литература

1. Ершов Ф. И. Система интерферона в норме и при патологии. М., 1996. 2. Карабелъ-скийА.В., ПадкинаМ.В. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris продуцента гибридного белка «Альбурона16» //Тез. Междунар. школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино, 28 ноября—1 декабря 2006. С. 206-208. 3. КарабелъсшйА.В., Парфенова Л. В., Смирнов М.Н., ПадкинаМ.В. Создание штамма дрожжей Pichia pastoris продуцента габридного

белка «Альбуферона1б»//III Московский международный конгресс «Биотехнология — состояние и перспективы развития». М, 2005. С. 74-75. 4. Никитин И. Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние проблемы и перспективы//Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. 2001. № 3 (13). 5. ПадкинаМ.В., Парфенова Л. В., СамбукЕ.В. Штамм-дрожжей Pichia pastor is—продуцет лейкоцитарного интерферона-16 человека, рекомбинантная плаз-мидная ДНК рНШ и способ ее конструирования//Патент РФ RU 2203950 С1.-МКИ С 12 N 15/21, 15/23, 1/19. 2002. 6. Alvarado Е, BallouL., HernandezL.M., BallouC.E. Localization of alpha 1-3-linked mannoses in the N-linked oligosaccharides of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants //Biochemistry. 1990. Mar. 13. Vol. 29 (10). P. 2471-2482. 7. AzaryanA. V, WongM., Friedman T.C., CowleyN.X., EstivarizF.E„ ChenH. C., Loh Y.P. Purification and characterization of a paired basic residue-specific yeast aspartic protease encodod by the YAP3 gene. Similarity to the mammalian pro-opiomelanocortin-convcrting enzyme. // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268 (16). P. 11968-11975. 8. BakerD.E. Pegylated interferons//Rev. Gastroenterol. Disord. 2001. Vol. 1 (2). P. 87-99. 9. Balan V, NebonD.R., SulkowsldM.S., EversonGT., LambiaseLR., Wiesner R. H., Dickson R. C„ Post А. В., RedfieldR. R„ Davis G. L, Neumann A. U., Osborn B. L., Frei-muth W. W., Submanian G.M. A Phase I/П study evaluating escalating doses of recombinant human albumin-interferon-alpha fusion protein in chronic hepatitis С patients who have failed previous interferon-alpha-based therapy//Antivir. Ther. 2006. Vol.ll(l). P. 35-45. 10. BrassardD. L„ GraceM.J., Bor-densR. W. Interferon-alpha as an immunotherapeutic protein//J. Leukoc. Biol. 2002. Apr. Vol. 71 (4). P. 565-581. 11. BretthauerR.K„ CastellinoF.J. Glycosylation of Pichia pastoris-derived proteins // Biotech-nol. Appl. Biochem. 1999. Vol. 30 (R 3). P. 193-200. 12. BrodS.A. Ingested type I interferon: a potential treatment for autoimmunity//! Interferon Cytokine Res. 2002. Dec. Vol. 22 (12). P. 1153-1166. 13. Chem-manurA. Т., Wu G. Y. Drug evaluation: Albuferon-alpha—an antiviral interferon-alpha/albumin fusion protein //Curr. Opin. Investig. Drugs. 2006. Aug. Vol. 7 (8). P. 750-758. 14. ChinR., LocarniniS. New therapies for the treatment of chronic hepatitis В infection//Curr. Opin. Infect. Dis. 1998. Dec. Vol. 11(6). P. 719-726. 15. Clare J.J., RomanosM.A., RaymentF.B., RowedderJ. E„ SmithM.A., PayneM.M., SreekrishnaK., HemvoodC.A. Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies//Gene. 1991a. Vol. 105. P. 205-212. 16. CreggJ.M., BarringerK.J., HesslerA. Y., MaddenKR. Pichia pastoris as a host system for transformations//Mol. Cell Biol. 1985. Dec. Vol. 5 (12). P. 3376-3385. 17. DumanJ.G., MieleR.G„ LiangH., GrellaD.K., SimKL., Castellino F.J., Bretthauer R. K. O-Mannosylation of Pichia pastoris cellular and recombinant proteins //Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. Vol. 28 (Ft. 1). P. 39-45. 18. Escuret V, Martin A., DurantelD., Parent R., HantzO., TrepoC., MenguyT., BottiusE., DardyJ., MaralJ., EscaryJ.L., ZoulimF. Novel interferon alpha variant with improved inhibitory activity against HCV genotype 1 replication compared to IFN-alpha 2b therapy, in a subgenomic replication system//Antimicrob. Agents Chemother. 2006. Vol. 50 (12). P. 3984-3991. 19. Fleer R., ChenX.J., AmellalN., YehP., FournierA., GuinetF, GaultN., FaucherD., FolliardF, FukuharaH. High-level secretion of correctly precessed recombinant human inter-leukin-1 beta in Kluyveromyces lactis//Gene. 1991. Vol. 107(2). P. 285-295. 20. Fleer R., FoournierA., GuittonJ.-D., Gerard J., YehP. Fusion polypeptides comprising human serum albumin, nucleic acids encoding same, and recombinant expression thereof//United States Patent. 5,876,969. 1999. Mar. 2. 21. FoserS., RenwanzL, EbelingM., HeizmannC. W., Certa U. Interferon-alpha and transforming growth factor-beta co-induce growth inhibition of human tumor cells // Cell Mol. Life Sci. 2006. Oct. Vol. 63 (19-20). P. 2387-2396. 22. Francis G. E., Fisher D., DelgadoC., MalikF., Gardiner A., Neale D. PEGylation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides: the importance of biological optimisation of coupling techniques // Int. J. Hematol. 1998. Jul. Vol. 68 (1). P. 1-18. 23. Garcia J. C. S., ArizaA.M., LassaA.M., GonzalezL. J., Perez V.B. Over-expression and single-step purification of human IFNa8 and human IFNa2b reveals the highest antiviral activity of human IFNa8.//Mcrobial Cell Factories. 2006. Vol. 5 (Suppl I). P. 73. 24. GlueP., Fang J. W., Rouzier-Panis В., RaffanelC., SaboR., GuptaS.K., SalfiM., Jacobs S. Pegylated interferon-alpha2b: pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and preliminary efficacy data. Hepatitis С intervention therapy group//Clin. Pharmacol. Ther. 2000. Vol. 68 (5). P. 556-567. 25. Hadziyan-nisS.J. New developments in the treatment of chronic hepatitis В //Expert Opin. Biol. Ther. 2006. Sep. Vol. 6 (9). P. 913-921. 26. HungC.H., LeeC.M., LuS.N., WangJ.H, ChenC.H., Ни Т.Н., KeefCM., Chang K.C., Tseng PL., YenY.H., ChangchienC.S. Anemia associated with antiviral therapy in chronic

hepatitis С: incidence, rick factors, and impact on treatment response//Liver Int. 2006. Nov. Vol. 26 (9). P. 1079-1086. 27. HusscdnM., GillD.S., LiaoM.J. Both variant forms of interferon-alpha4 gene (IFNA4a and IFNA4b) are present in the human population//! Interferon Cytokine Res. 1997. Vol. 17. P. 559-566. 28. HusscdnM., NiD., GillD., LiaoM.J. IFN-alphala gene is the major variant in the North American population // J. Interferon Cytokine Res. 2000. Vol. 20 (9). P. 763-768. 29. KarpusasM., NolteM., Benton C.B. The crystal structure of human interferon-p at 2.2-A resolution //Prot. Natl. Sci. USA. 1997. Vol. 94 (22). P. 11813-11818. 30. KnauftM.J., Bell D. P., HirtzerP., LuoZ., Young J. D., KatreN. ^Relationship of effective molecular size to systemic clearance in rats of recombinant interleukin-2 chemically modified with water-soluble polymers//! Biol. Chem. 1988. Vol. 263 (29). P. 15064-15070. 31. LoftisJ.M., Wall J.M., PagelR.L., HauserP. Administration of pegylated interferon-alpha-2a or -2b does not induce sickness behavior in Lewis rats // Psychoneuroendocrinology. 2006. Nov. Vol. 31 (10). P. 1289-1294. 32. OhiH., Okazaki N., UnoS., MiuraM., Iiiramatsu R. Chromosomal DNA patterns and gene stability of Pichia pastoris//Yeast. 1998. vol. 14. P. 895-903. 33. OishiH., MorimotoT., WatanabeY., Tamed Y. Purification and characterization of phospholipase В from Kluyveromyces lactis, and cloning of phospho-lipase В gene//Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. Vol. 63 (1). P. 83-90. 34. OsbornB.L., OlsenH.S., NardelliB., Murray J, H, ZhouJ.X., GarciaA., MoodyG., ZaritskayaL.S., SungC. Pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumm-mterferon-alpha fusion protein in cynomolgus monkeys//J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002. Nov. Vol. 303 (2). P. 540-548. 35. PawlotskyJ.M., GishR. G. Future therapies for hepatitis C//Antivir. Ther. 2006. Vol. 11 (4). P. 397-408. 36. PestkaS. The human interferon alpha species and receptors//Biopolymers. 2000. Vol. 55. P. 254-287. 37. PestkaS., BaronS. Definition and classification of the interferons//Meth. Enzymol. 1981. Vol. 78. P. 3-14. 38. PestkaS., Longer J. A., Zoon К. C., Samuel S. E. Interferons and their actions //Ann. Rev. Bochem. 1987. Vol. 56. P. 727-777. 39. Peddler S. C. Pegylation of interferon alfa: structural and pharmacokinetic properties // Semin. Liver Dis. 2003. Vol. 23. Suppl. 1. P 19-22. 40. PfefferLM., DinarelloC.A., HerbermanR.B., WilliamsB.R., Borden E.C., BordensR., WalterM.R., Nagabhushcm T.L, TrottaP.P., PestkaS. Biological properties of recombinant alpha-interferons: 40th anniversary of the discovery of interferons // Cancer Res. 1998. Jun. 15. Vol. 58 (12). P. 2489-2499. 41. PomovaN.I., IvanikovI.O., Siutkin V.E. Use of peg-intron in combined treatment of chronic liver disease caused by HTV infection//Eksp. Klin. Gastroenterol. 2003. Vol. (1). P. 42-45, 182. 42. Rinderknecht E„ О'Conner B.H., RodriguezH. Natural human interferon-gamma. Complete amino acid sequence and determination of site of glycosylation//J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259 (11). P. 6790-6797. 43. RobertsM. J., Harris J. M. Attachment of degradable poly(ethylene glycol) to proteins has the potential to increase therapeutic efficacy//! Pharm. Sci. 1998. Vol. 87(11). P. 1440-1445. 44. Sato Т., Suzuki E., YokoyamaM., SembaJ., WatanabeS., MiyaokaH. Chronic intraperitoneal injection od interferon-alpha reduces serotonin levels in various regions of rat brain, but does not change levels of serotonin transporter mRNA, nitrite or nitrate //Psychiatry Clin Neurosci. 2006. Aug. Vol. 60 (4). P. 499-506. 45. Sie-beckN., Hurley D. J., GatviaM., Greene C.E., KostlinR.G., Moore P. A., Dietrich U.M. Effects of human recombinant alpha-2b interferon and feline recombinant omega interferon on in vitro replication of feline herpesvirus-1 //Am. J. Vet Res. 2006. Sep. Vol. 67 (8). P. 1406-1411. 46. SungC., NardelliB., LaFle-urD.W., Blatter E„ Corcoran M., OlsenH.S., BirseC.E., Pickeral O.K., Zhang J., Shah D„ MoodyG., GentzS., BeebeL, Moore PA. An IFN-beta-albiunin fusion protein that displays improved pharmacokinetic and pharmacodynamic properties in nonhuman primates//J. Interferon Cytokine Res. 2003. Jan. Vol. 23(1). P. 25-36. 47. SyedS., Schuyler P. D., KulczyckyM., Sheffield W. P. Potent antithrombin activity and delayed clearance from the circulation characterize recombinant hirudin genetically fused to albumin//Blood. 1997. May. 1. Vol. 89 (9). P. 3243-3252. 48. YehP, Landcds D„ LemaitreM., Maury I., CrenneJ. Y., BecquariJ., Murry-BrelierA., Boucher F., MontayG., Fleer R. Design of yeast-secreted albumin derivatives for human therapy: biological and antiviral properties of a serum albumin-CD4 genetic conjugate//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992. Mar. 1. Vol. 89 (5). P. 1904-1908. 49. ZeuzemS., FeinmanS. V, RasenackJ., Heathcote E.J., LcdM. Y., GaneE., OGradyJ., ReichenJ., DiagoM., Lin A., HoffinanJ., Brun-daM.J. Peginterferon alfa-2a in patients with chronic hepatitis C//N. Engl. J. Med. 2000. Vol. 343 (23). P. 1666-1672. 50. ZeuzemS., WelschC., HerrmannE. Pharmacokinetics of peginterferons//Semin. Liver Dis. 2003. Vol. 23. Suppl. 1. P. 23-28.

Статья принята к печати 15 мая 2007 г.