Регуляция лептином и грелином экспрессии мембранных молекул и продукции цитокинов натуральными t-регуляторными клетками Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2014 БИОЛОГИЯ Вып. 1

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 612.018:612.017.1:611.018.53

РЕГУЛЯЦИЯ ЛЕПТИНОМ И ГРЕЛИНОМ ЭКСПРЕССИИ МЕМБРАННЫХ МОЛЕКУЛ И ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ НАТУРАЛЬНЫМИ T-РЕГУЛЯТОРНЫМИ КЛЕТКАМИ

Е. Г. Орловаа, С. В. Ширшевa,b, О. А. Логиноваb

a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13; [email protected]; (342)2808431

b Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Изучены эффекты лептина и грелина, и их комбинаций в концентрациях, характерных для беременности, на экспрессию мембранных молекул (CTLA-4, GITR, GARP) и продукцию цитокинов (IL-10, TGF-P1) в культуре натуральных Т-регуляторных клеток in vitro.

Ключевые слова: натуральные T-регуляторные клетки; лептин; грелин.

Введение

Лептин и грелин - пептидные гормоны, разнонаправленно регулирующие энергетический обмен и метаболизм жировой ткани, а также пищевое поведение организма человека. Помимо этого, оба гормона обладают выраженной иммуномодулирующей активностью и тесно вовлечены в реализацию репродуктивной функции [Tena-Sempere, 2007]. Содержание лептина и грелина в периферической крови значительно нарастает при беременности, причиной чему является изменение жирового и энергетического обмена, а также продукция гормонов плацентой и тканями эмбриона. Лептин и грелин играют важную роль на всех этапах гестации, контролируя процессы имплантации, рост и развитие плода [Hardie, Trayhurn 1997; Fuglsang et al., 2005; Tena-Sempere, 2007]. В работах ряда авторов показано, что гормоны проявляют реципрокную иммунорегуляторную активность [Annunziato et al., 2008; Liu et al., 2011]. Беременность характеризуется наличием специфической неотвечаемости иммунной системы матери к полуаллогенному эмбриону [Ширшев, 2009]. Одним из основных механизмов формирования иммунологической толерантности как при беременности, так и при опухолевом росте является увеличение количества Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) периферической крови, обладающих иммуносупрессорной активностью [Heikkinen et al., 2004]. Повышение уровня Treg в периферической крови происходит как за

счет индукции адаптивных Treg ^Treg), так и путем усиления пролиферации натуральных Treg (CD4+CD25brghtFOXP3+) (nTreg) [Ярилин, 2010].

Ранее в наших работах показано, что лептин и грелин в концентрациях, характерных для беременности, разнонаправлено регулируют формирование и функциональную активность аТreg [Орлова, 2011; Орлова, Ширшев, 2013б]. Поэтому важно было оценить влияние гормонов на функциональную активность nTreg. Реализация супрессорной функции Treg осуществляется путем непосредственного взаимодействия мембранных молекул Treg (CTLA-4, GITR, GARP и др) со своими лигандами на эффекторных клетках, а также путем продукции иммуносупрессорных цитокинов (IL-10, TGF-P1) [Ярилин, 2010]. CTLA-4 - гомолог CD28, конститутивно экспрессируется на Treg, обладая высокой авидностью к CD80/86, блокирует кости-мулирующий сигнал, вызывая анергию Т-эффек-торных клеток [Ярилин, 2010]. Активация самих Treg через CTLA-4 приводит к усилению выработки TGF-P [Ярилин, 2010]. GITR (индуцируемый глюкокортикоидами TNF-рецептор) также конститутивно присутствует на Treg, и его связывание с лигандом на эффекторных клетках блокирует их пролиферацию. Тогда как активация самих Treg через GITR стимулирует NF-kB-путь, с последующей индукцией супрессивных молекул и усилением контактной супрессии. GARP - (Glycoprotein A repetitions predominant) рецептор для низкоаффин-

© Орлова Е. Г., Ширшев С. В., Логинова О. А., 2014

49

ного (latent) TGF-P1, экспрессируется на Treg и способствует сохранению их регуляторного фенотипа. TGF- р1, связываясь с GARP на наивных CD4+-Т-клетках, фосфорилирует Smad2/3, что препятствует их дифференцировке в эффекторные клетки, но усиливает формирование аTreg [Hahn et al., 2013].

Таким образом, цель работы - изучить влияние лептина и грелина, а также их совместные эффекты в концентрациях, отражающих уровень гормонов в периферической крови при беременности, на экспрессию мембранных молекул (CTLA-4, GITR, GARP) и продукцию иммуносупрессорных цитоки-нов (IL-10, TGF-P1) nTreg in vitro.

Материалы и методы

В работе использовали фракционированную суспензию мононуклеарных клеток периферической крови здоровых женщин в возрасте от 20 до 36 лет, находящихся в фолликулярной фазе менструального цикла (4-11 день). Суспензию мононуклеаров получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 г/см3). Далее методом иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Regulatory CD4+CD25+ T-cell Kit; Invitrogen) из суспензии мононуклеаров выделяли CD4+CD25bright (nTreg). Полученную клеточную суспензию (1 х 105 - 5х106 кл/мл) инкубировали в плоскодонном 96-луночном планшете, в полной питательной среде (ППС) (среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мМ буфера HEPES, 2 мМ L-глютамина, 200 ед/мл гентамицина), в течение 3 суток при 37°С, в условиях 5%-ного СО2 с гормонами. Гормоны вносили в культуры в концентрациях, характерных для беременности, а именно, лептин («Sigma», США) в концентрации 35 нг/мл [Hardie, Trayhurn, 1997], грелин («Sigma», Израиль) в концентрации 1.2 нг/мл [Fuglsang et al., 2005]. Для исследования совместных эффектов гормонов их вносили в пробы одновременно. В контрольные пробы вместо гормона добавляли физиологический раствор, используемый для растворения гормонов. Чистота выделения Treg (CD4+CD25bright) оценивалась методом проточной цитометрии, и составляла 90% и более. Количество Treg оценивали как процент CD4+CD25brightFOXP3+ клеток (Anti-Human FOXP3 Alexa Fluor® 488, 206D) в гейте

CD4+CD25bnght лимфоцитов (PE/Cy5 Anti-Human CD4, OKT4; PE Anti-Human CD25, BC96). Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 72 ч. инкубации с гормонами, составляла 92-98%. Окрашивание поверхностных и внутриклеточных маркеров осуществляли согласно методике производителя моноклональных антител («eBioscience», США). При учете результатов подсчитывали не менее 10000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна ис-

пользовали соответствующие изотипические контроли. На выделенной культуре CD4+CD25brightFOXP3+ исследовали экспрессию молекул CTLA-4, GITR и GARP. Рассчитывали процент клеток, несущих CTLA-4, либо GITR, либо GARP в гейте CD4+FOXP3+ лимфоцитов. В супернатантах культур оценивали содержание IL-10, TGF-P1 иммуноферментным методом (ИФА) с использованием коммерческих наборов «ООО «Век-тор-Бест» (Россия) и «eBioscience» (США) согласно методике производителя. Контролем служили пробы, в которые вместо гормона вносили аналогичное количество ППС.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «MS Office Excel». При этом вычисляли среднюю арифметическую величину и ее стандартную ошибку. Поскольку выборочное распределение данных, оцениваемое по критерию Фишера, было нормальным, достоверность различий между средними величинами оценивали по парному t-критерию Стьюдента при р < 0.05.

Результаты и их обсуждение

Исследуемая популяция клеток, выделенная из периферической крови, имеет фенотип CD4+CD25brightFOXP3+, что дает основания полагать, что эти клетки являются nTreg. В отличие от аTreg, формирование nTreg происходит в тимусе, где они приобретают фенотип

CD4+CD25brІ8htFOXP3+[Ярилин, 2010]. nTreg осуществляют супрессию, главным образом, путем непосредственного взаимодействии с эффекторными клетками [Gregori et al., 2007], поэтому изучение экспрессии поверхностных молекул является важной характеристикой их функциональной активности. В результате проведенных исследований установлено, что лептин и грелин, а также их комбинация не оказывают значимых эффектов на количество nTreg, несущих CTLA-4 (табл. 1). Ранее нами показано, что лептин снижает, а грелин повышает число а^^ экспрессирующих CTLA-4 [Орлова, Ширшев, 2013а]. Различия в эффектах гормонов на nTreg и aTreg, возможно, обусловлены тем, что присутствие CTLA-4 не является обязательным условием для формирования nTreg [Zheng et al., 2006], и для модуляции его экспрессии необходимы костимулирующие сигналы. Тогда как высокая экспрессия CTLA-4 необходима для индукции FOXP3 в наивных CD4+-Т-клетках при формировании аTreg и осуществления ими супрессорной функции [Zheng et al., 2006].

Лептин в концентрации, характерной для II-III триместров беременности, усиливает экспрессию GITR на nTreg, а грелин в концентрации, отражающей его уровень в крови в I-II триместрах беременности, повышает экспрессию GARP на nTreg. Сочетанное действие лептина и грелина нивелирует

самостоятельное влияние каждого из гормонов на присутствие GITR и GARP на мембране nTreg.

Таблица 1

Влияние гормонов на экспрессию CTLA-4, GARP и GITR на nTreg

Гормоны О4 + 3 рц X 0 Рч + 1 < ь-1 н о + Q О VO II й + 3 рц X о Рч + н 3 + 4 Q О II 3 Р^ X О Рч + + 4 Q О II

Контроль 64.6±17.1 72.4±10.4 94.3±5.7

Лептин, 35 нг/мл 62.8±19.8 90.9±8.4* 94.3±5.7

Лептин, 35 нг/мл 66,9±15,3 80.3±8.9 91.8±8.2

+ Грелин, 1.2

нг/мл

Грелин, 1.2 нг/мл 72.5±19.3 82.1±4.7 96.7±3.3*

Примечание. Здесь и в табл. 2 - * - различия достоверны (р < 0.05) по парному Г-критерию Стьюдента по отношению к контролю.

Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что лептин оказывает оппозитные эффекты, угнетая формирование аTгeg [Орлова, Шир-шев, 20136], но усиливая экспрессию GITR на nTreg, то есть способствуя повышению их супрессорного потенциала. Причем, стимулируя экспрессию GITR, через NF-kB-путь, лептин, возможно, будет способствовать индукции и других супрессорных молекул на nTreg. Тогда как грелин действует однонаправленно, усиливая формирование аTreg, и экспрессию GARP на nTreg. Причем, возможно, увеличение экспрессии GARP является одним из механизмов, объясняющих преимущественное формирование аTreg под действием грелина [Hahn et al., 2013].

При изучении влияния лептина и грелина на продукцию цитокинов - TGF-pi и IL-10, в культурах nTreg, модулирующих эффектов гормонов выявлено не было (табл. 2). По-видимому, это обусловлено тем, что выработка иммуносупрессорных цитокинов не является ведущим механизмом реализации супрессорной активности nTreg. Так же следует отметить, что отсутствие выраженных эффектов гормонов, возможно, объясняется характерной особенностью nTreg, описанной рядом авторов, проявлять слабую функциональную активность in vitro [Thornton, Shevach, 1998].

Суммируя полученные результаты, можно полагать, что лептин и грелин, действуя самостоятельно, синергично регулируют экспрессию мембранных молекул на nTreg, усиливая их супрессорный потенциал. Тогда как физиологическая комби-

нация лептина и грелина, которая ближе отражает условия беременности, не влияет на экспрессию супрессорных молекул и цитокинов пГ^. Учитывая, что лептин и грелин, а также их сочетания в изучаемых концентрациях, угнетают апоптоз nTreg, а также предшественников аTreg [Орлова, 2011; Орлова, Ширшев, 2013б], можно заключить, что гормоны являются значимыми регуляторами функциональной активности и формирова-

ния периферической толерантности при беременности.

Таблица 2

Влияние гормонов на продукцию цитокинов nTreg

Гормональное воздействие TGF-P1, нг/мл (n=10) IL-10, нг/мл (n=6)

Контроль 26.3±13.9 8.4±2.7

Лептин, 35 нг/мл 29.4±16.4 9.6±6.1

Лептин, 35 нг/мл+ Грелин, 1.2 нг/мл 20.6±17.9 8.2±2.6

Грелин, 1.2 нг/мл 22.3±9.0 7.9±2.9

Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» 12-П-4-1017.

Библиографический список

Орлова Е.Г. Регуляция лептином и грелином индукции Т-регуляторных лимфоцитов // Вестник Уральской медицинской академической науки. 2011. Т. 35, № 2/1. С. 55-56.

Орлова Е.Г., Ширшев С.В. Регуляция лептином и грелином апаптоза CD4+-лимфоцитов in vitro // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2013а. Вып. 2. С. 100-104.

Орлова Е.Г., Ширшев С.В. Роль лептина и грелина в индукции дифференцировки ИЛ-17-проду-цирующих и Т-регуляторных лимфоцитов // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. 20135. Т. 156, № 12. С. 786-791. Ширшев С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий: монография // Екатеринбург: УрО РАН, 2009. 582 с.

Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГОЭТАР-Медиа, 2010. С. 752.

Annunziato F. et al. The phenotype of human Th17 cells and their precursors, the cytokines that mediate their differentiation and the role of Th17 cells in inflammation // Int.. Immunol. 2008. Vol. 20, N. 11. P. 1361-1368.

Fuglsang J. et al. Ghrelin and its relationship to growth hormones during normal pregnancy // Clin. Endocrinol. 2005. Vol. 62. P. 554-559.

Gregori S. et al. Isolation, expansion, and characterization of human natural and adaptive regulatory T cells // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 380. P. 83-105.

Hahn S.A. et al. Soluble GARP has potent antiinflammatory and immunomodulatory impact on human CD4+ T cells // Blood. 2013. Vol. 122. P. 1182-1191.

Hardie L., Trayhurn P. Circulating leptin in women: longitudinal study in menstrual cycle and during pregnancy // Clin. Endocrinol. 1997. Vol. 47. P. 101-106.

Heikkinen J. et al. Phenotypic characterization of regulatory T cells in the human decidua // Clinical & Experimental Immunology. 2004. Vol. 136, is. 2. P. 373-378.

Liu Y.S. et al Study on the relationship between Th17 cells and unexplained recurrent spontaneous

abortion // Am. J. Reprod. Immunol. 2011. Vol. 65, N 5. P. 503-511.

Tena-Sempere M. Roles of ghrelin and leptin in the control of reproductive function // Neuroendocrinology. 2007. Vol. 86. P. 229-241.

Thornton A.M., Shevach E.M. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production // J. Exp. Med. 1998 Vol. 188. P. 287296.

Zheng S.G. et al. TGF-P requires CTLA-4 early after T cell activation to induce foxP3 and generate adaptive CD4+CD25+regulatory cells // J. Immunol. 2006. Vol. 176. P. 3321-3329.

Поступила в редакцию 14.01.2014

Leptin and ghrelin regulation of membrane molecules expression and cytokines

productions by natural Treg

E. G. Orlova, candidate of biology, senior researcher

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; [email protected], (342)2808431 S. V. Shirshev, doctor of medicin, professor

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str.,

Perm, Russia, 614081; [email protected]

Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990

O. A. Loginova, master's student

Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]

Studied the effects of leptin and ghrelin in the concentrations characteristic for pregnancy, on the expression of membrane molecules (CTLA-4, GITR, GARP) and cytokine production (IL-10, TGF-P1) by natural Treg in the culture in vitro.

Key words: nTreg; leptin; ghrelin.

Орлова Екатерина Г ригорьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук

Ширшев Сергей Викторович, доктор медицинских наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук

ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»

Логинова Ольга Александровна, магистр

ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»