CC BY
80
ТОМ 5
НОМЕР 1
201 2
КЛИНИЧЕСКАЯ
ИММУНОБИОЛОГИЯ ОПУХОЛЕЙ
HKU ГЕМАТОЛОГИЯ
Regulatory T-cells in lymphoma patients following autologous hematopoietic stem cell transplantation
E.V. Batorov, E.Ya. Shevela, M.A. Tihonova,
I.V. Kryuchkova, D.S. Baranova, V.V. Sergeevicheva,
S.A. Sizikova, G.Ju. Ushakova, A.V. Gilevich, A.A. Ostanin, E.R. Chernykh
SUMMARY
Aim. Regulatory T-cell (Tsg) reconstitution in malignant lymphoma patients following autologous hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), including patients with co-transplantation of mesenchymal stromal cells (MSCs), and possible relationship between Treg and clinical outcomes have been investigated.
Patients and methods. 50 patients with non-Hodgkin’s lymphomas, Hodgkin’s lymphoma and multiple myeloma underwent autologous HSCT, 24 of them were co-infused with MSCs in an average dose of 0,21 x l06/kg. Level of circulating CD4+CD25hi and CD4+FOXP3+ Treg has been evaluated using flow cytometry before HSCT, at the day of engraftment, and following 6 and 12 months after HSCT.
Results. Relative number of T recovered intensively and reached initially high level at the time of engraftment and then subsequently decreased for 1 year until it lowered to healthy donors’ values. MSC co-transplantation did not affect the reconstitution of T . A relative number of
reg
CD4+FOXP3+ T and absolute count of CD4+CD25hi T
reg reg
at the time of engraftment were increased in patients with relapsed disease during 6 months following HSCT (p = 0,013 and p = 0,039, respectively). ROC curves analysis showed that evaluation of Treg at the day of engraftment allowed predicting early relapse or progression of disease following HSCT.
Conclusions. The content of circulating Treg in peripheral blood of patients with malignant lymphoma is restored quickly and completely after HSCT. Co-transplantation of MSCs does not affect the intensity of T reconstitution. Elevated level of Treg predicts the early relapse or disease progression in post-HSCT period.
Keywords: regulatory T-cells, mesenchymal stromal cells, autologous hematopoietic stem cell transplantation.
Institute of clinical immunology SB RAMS, Novosibirsk Контакты: ct_lab@mail.ru Принято в печать: 3 апреля 2012 г.
Регуляторные Т-клетки у больных лимфомами после аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
Е.В. Баторов, Е.Я. Шевела, М.А. Тихонова, И.В. Крючкова, Д.С. Баранова,
В.В. Сергеевичева, С.А. Сизикова, Г.Ю. Ушакова, А.В. Гилевич, А.А. Останин,
Е.Р. Черных_______________________________________________
_______________________РЕФЕРАТ____________________________
Цель. Исследовать особенности реконституции регуляторных Т-клеток (Трег) после аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (аутоТГСК), в т. ч. на фоне котрансплантации аутологичных мезенхимных стромальных клеток (МСК), и изучить возможную взаимосвязь между содержанием Трег и исходом аутоТГСК у больных лимфомами.
Материалы и методы. АутоТГСК была проведена 50 пациентам с неходжкинскими лимфомами, лимфомой Ходжкина и множественной миеломой. Котрансплантация МСК в средней дозе 0,21 x 106/кг проведена 24 из 50 пациентов, включенных в исследование. Методом проточной цитометрии оценивали количество циркулирующих CD4+CD25hi и CD4+FOXP3+ Трег до аутоТГСК, ко времени восстановления числа лейкоцитов после аутоТГСК, а также через 6 и 12 мес. Результаты. Количество Трег полностью восстанавливалось до исходно повышенного уровня ко времени восстановления числа лейкоцитов. В последующем (в течение года) их относительное содержание постепенно снижалось до нормативных значений. Котрансплантация МСК не влияла на процесс реконституции Трег. Анализ взаимосвязи Трег с исходами показал, что пациенты с рецидивом/прогрессией заболевания в течение первых 6 мес. после аутоТГСК отличались более высоким относительным содержанием CD4+FOXP3+ Трег (p = 0,013) и абсолютным содержанием CD4+CD25hi Трег (p = 0,039) на момент восстановления числа лейкоцитов. При этом проведение ROC-анализа выявило высокую прогностическую значимость оценки Трег как предиктора раннего развития рецидива/прогрессии заболевания после аутоТГСК.
Заключение. Количество циркулирующих Трег после аутоТГСК восстанавливается быстро и полностью. Котрансплантация МСК не влияет на процесс реконституции Трег. Повышенное содержание Трег позволяет прогнозировать развитие рецидива/прогрессии злокачественных лимфопролиферативных заболеваний в посттрансплантационный период.
Ключевые слова:
регуляторные Т-клетки, мезенхимные стромальные клетки, аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток.
ВВЕДЕНИЕ
Регуляторные Т-клетки (Трег) представляют гетерогенную популяцию лимфоцитов, способных подавлять иммунный ответ на различные, в т. ч. опухолевые, антигены. В настоящее время наиболее изучены регуля-
торные Т-лимфоциты CD4+CD25+. Увеличение содержания этих клеток у больных с различными формами рака рассматривается в качестве одной из ведущих причин неэффективности противоопухолевого иммунного ответа [1]. В то же время значение Т при гемобластозах остается ме-
рег ^
ФГБУ «НИИ клинической иммунологии СО РАМН», Новосибирск
61
Е.В. Баторов и др.
нее исследованным и понятным. С одной стороны, возрастание числа Трег в крови и опухолевом микроокружении при лимфомах и лейкозах и выявленная способность этих клеток подавлять реакции клеточного иммунитета свидетельствуют о негативной роли Трег в противоопухолевом ответе [2—4]. Подтверждением этому служат данные, показывающие, что элиминация Трег в экспериментальной модели лимфомы приводит к регрессии опухоли [5]. С другой стороны, количество Трег в зоне роста опухоли при лимфоме Ходжкина и неходжкинских лимфомах прямо коррелирует с показателями выживаемости, а их содержание в стадии ремиссии выше, чем при прогрессии [6, 7]. Эти факты свидетельствуют о том, что локализованные в опухоли Трег могут, по-видимому, оказывать и положительное действие, подавляя пролиферацию малигнизированных клонов лимфоцитов.
Не менее важны исследование восстановления пула Трег у пациентов с лимфомами после аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (аутоТГСК) и оценка влияния этих клеток на иммунную реконституцию и выживаемость больных. Данный вопрос представляет особый интерес при проведении совместной аутоТГСК и аутологичных мезенхимных стромальных клеток (МСК). Аутологичная котрансплан-тация МСК при проведении аутоТГСК рассматривается в качестве новой стратегии улучшения функционирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), поскольку МСК продуцируют гемопоэзстимулирующие цитокины и могут дифференцироваться в клетки кроветворного микроокружения [8—11]. Однако способность МСК индуцировать генерацию Трег [12, 13] вызывает определенные опасения из-за негативного влияния этих клеток на иммунную реконституцию и выживаемость пациентов. Проведенные нами ранее исследования показали, что аутологичная котрансплантация МСК характеризуется отсутствием токсических эффектов и сокращением периода нейтропении и тромбоцитопении после аутоТГСК [14]. Более того, низкие дозы МСК способствуют более раннему восстановлению лимфоцитов [15, 16], что может иметь важное клиническое значение [17]. Учитывая вышесказанное, настоящее исследование было посвящено изучению особенностей восстановления регуляторных Т-лимфоцитов после аутоТГСК, в т. ч. на фоне аутологичной котрансплантации МСК. Кроме того, в работе предпринята попытка поиска взаимосвязи между статусом Трег, продолжительностью ремиссии и сроком жизни лиц со злокачественными лимфопролиферативными заболеваниями.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование было включено 50 пациентов: 31 мужчина и 19 женщин в возрасте 18—55 лет (медиана 35 лет), которым с августа 2009 г. по сентябрь 2011 г. проводилась аутоТГСК на базе отделения гематологии клиники иммунопатологии НИИ клинической иммунологии СО РАМН. Неходжкинские лимфомы (НХЛ) диагностированы у 17 больных, лимфома Ходжкина (ЛХ) — у 20 и множественная миелома (ММ) — у 13. Забор крови и все иммунологические исследования проводили после получения письменного информированного согласия пациентов. В качестве группы сравнения было обследовано 43 здоровых добровольца, сопоставимых по полу и возрасту.
62
Перед высокодозной химиотерапией индукционное лечение проводилось с использованием следующих схем: 6 больных — DexaBEAM, 5 — ICE, 4 — ESHAP, 2 — DHAP, по 1 пациенту — CAV, DCEP. Кроме того, у 27 больных на индукционном этапе лечения применялся циклофосфамид в монорежиме (4 г/м2). В качестве режима кондиционирования у 37 пациентов с лимфомами использовалась схема BEAM, а у 13 больных ММ применялся мелфалан в дозе 200—220 мг/м2. Процедуру афе-реза проводили на сепараторах клеток крови AS TEC 204 (Fresenius) и Spectra LRS 07 (COBE) после достижения в крови концентрации ГСК 1 X 104 CD34+ клеток/кг и продолжали до получения 2 X 106 CD34+ клеток/кг и более.
Получение и введение МСК. МСК генерировали из прилипающей фракции аспирата костного мозга больных, включенных в исследование, согласно описанной технологии [14, 18], и криоконсервировали в растворе человеческого альбумина («Микроген», Россия), содержащем 10 % DMSO (Sigma-Aldrich). Клетки размораживали непосредственно перед введением, двукратно отмывали, ресуспендировали в 20 мл физиологического раствора и вводили внутривенно сразу после ТГСК. Количество трансплантированных МСК варьировало от 0,06 до 1,46 X 106 клеток/кг массы тела больного (среднее значение — 0,21 X 106 клеток/кг).
Реконституцию Трег оценивали в двух группах больных. В первую группу вошло 24 пациента, которым были выполнены аутоТГСК и котрансплантация МСК (группа МСК+). Вторую группу составили 26 пациентов, которым проводили стандартную аутоТГСК (группа МСК ). Сравнительная характеристика больных в сформированных группах не выявила значимых различий по возрасту, полу, статусу заболевания, предшествующему лечению и режимам мобилизации/кондиционирования ГСК (табл. 1). Абсолютное число лимфоцитов в продукте сепарации и количество трансплантированных CD34+ ГСК в группах также были сопоставимы. Анализируемые группы были в целом сходны по структуре нозологических форм, в частности не различались по количеству больных ЛХ и НХЛ, хотя доля пациентов с ММ в группе МСК— была статистически значимо выше (р = 0,016).
Оценка субпопуляций регуляторных Т-лимфо-цитов. ИсследованиеТ-клеточных субпопуляций лимфоцитов проводилось до аутоТГСК (перед началом режима кондиционирования), после аутоТГСК в день восстановления числа лейкоцитов (число лейкоцитов в среднем более 1 X 109/л, 13-й день), а также через 6 и 12 мес. Общий анализ крови проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Hema-Screen 18 (Hospitex Diagnostics, Италия). Трег идентифицировали по количеству лимфоцитов CD4+CD25hl и CD4+FOXP3+. Относительное содержание CD4+CD25hi оценивали в лейкоцитарной взвеси. Внутриклеточная экспрессия FOXP3 изучалась в популяции мононуклеарных клеток (МНК) в гейте CD4+ методом проточной цитометрии с помощью моноклональных антител (Becton Dickinson, США) к CD4 (РЕ, FITC) («Сорбент-сервис», Россия), CD4 (PerCP), CD25 (FITC), FOXP3 (РЕ). Цитометрию проводили с использованием параметров светорассеяния для определения лимфоцитарного гейта, из которого строили график каналов флюоресценции FL-1 (FITC) против FL-2 (РЕ) (BD FACSCalibur, США).
Клиническая онкогематология
Регуляторные Т-лимфоциты при НХЛ
Таблица 1. Характеристика больных в исследуемых группах
Группы больных
Показатель МСК-, n = 26 МСК+, n = 24
Медиана возраста (диапазон), лет 39 (19-55) 30 (18-55)
Пол
Мужчины 17 (65 %) 14 (58 %)
Женщины 9 (35 %) 10 (42 %)
Диагноз
НХЛ 7 (27 %) 10 (42 %)
ЛХ 8 (31 %) 12 (50 %)
ММ 11 (42 %) 2 (8 %)
Статус
Полная ремиссия 5 (19 %) 9 (37 %)
Частичная ремиссия 21 (81 %) 15 (63 %)
CD34+ ГСК (среднее значение; диапазон), х106/кг 6,0 ± 0,5 (5,25; 2,8-13,9) 4,9 ± 0,5 (4,5; 1,0-9,8)
МСК (среднее значение; диапазон), х106/кг — 0,32 ± 0,07 (0,21; 0,063-1,46)
Абсолютное число лимфоцитов в продукте сепарации (среднее значение; диапазон), х 109 10,6 ± 1,0 (9,8; 4,17-21,9) 14,4 ± 2,6 (11,3; 2,4-50,8)
Оценка пролиферативной активности МНК. Для
оценки пролиферативной активности лимфоцитов из гепаринизированной венозной крови выделяли МНК путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-ве-рографина (р = 1,078). Клетки культивировали в 96-лу-ночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPMI-1640, дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5 ммоль/л HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10 % инактивированной сыворотки группы AB(IV), при температуре 37 °С в СО2-инкубаторе в течение 3 дней в отсутствие и в присутствии aнти-CD3 моноклональных антител (1 мкг/мл, «Медбиоспектр», Россия). Интенсивность пролиферации оценивали радиометрически по включению ЗН-тимидина (1 мкКи/лунка), вводимого за 18 ч до конца культивирования.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft) и GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.). Оценка значимости различий между группами больных осуществлялась с использованием критерия х2 для дискретных переменных и непараметрического критерия Уилкок-сона—Манна—Уитни для непрерывных переменных. Исследование корреляционных взаимосвязей выполняли с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Для оценки диагностической значимости использовался ROC-анализ с расчетом площади под кривой. Различия считали значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для изучения динамики восстановления регуляторных Т-лимфоцитов был проведен сравнительный анализ относительного и абсолютного числа этих клеток до и после стандартной аутоТГСК (МСК-). Количество Трег определяли на момент восстановления числа лейкоцитов, а также через 6 и 12 мес. после аутоТГСК. Учитывая отсутствие единого универсального маркера CD4+ Трег, а с другой стороны — данные о сопряженности супрессорной активности Трег с высокой экспрессией CD25 и внутриклеточной экспрессией транскрипционного фактора FOXP3, содержание Трег оценивали по количеству CD4+CD25hi и CD4+FOXP3+. Проведенное в отдельной серии экспериментов исследование показало высокую внутриклеточную экспрессию FOXP3 в популяции Т-клеток CD4+CD25hi, что отражено в качестве примера на рис. 1. Кроме того, меж-
www.medprint.ru
Рис. 1. Цитометрическая характеристика регуляторных Т-клеток (Т ). Показана внутриклеточная экспрессия FOXP3 в области, используемой для подсчета Трег (CD4+CD25hi). Представлены данные случайно выбранного пациента
ду относительным и абсолютным содержанием этих популяций при обследовании до аутоТГСК выявлялась прямая корреляционная связь (Rs = 0,30, р = 0,061 и Rs = 0,54, р = 0,0004), которая сохранялась после аутоТГСК (на момент восстановления числа лейкоцитов) в обеих группах больных (МСК— и МСК+). В дальнейшем экспрессию FOXP3 оценивали в общей популяции Т-клеток CD4+, поскольку данный транскрипционный фактор может обнаруживаться не только в субпопуляции CD4+CD25hi Трег, но и среди Т-лимфоцитов CD4+, не экспрессирующих или низко экспрессирующих молекулу CD25.
По сравнению со здоровыми добровольцами у больных, обследованных до начала аутоТГСК, исходное относительное содержание CD4+CD25hi и CD4+FOXP3+ Т было статистически значимо повышено (2,1 ± 0,2 vs 1,35 ± 0,1 %, р = 0,0006 и 5,9 ± 0,5 vs 3,8 ± 0,3 %, р = 0,0008 соответственно). Тем не менее из-за наличия лимфопении абсолютное число этих клеток было сходным с таковым у здоровых добровольцев (0,026 ± 0,003 и 0,026 ± 0,002 х 109/л для клеток CD4+CD25hi; 0,09 ± 0,02 и 0,07 ± 0,01 х 109/л для клеток CD4+FOXP3+).
После проведения аутоТГСК ко времени восстановления числа лейкоцитов относительное содержание циркулирующих CD4+CD25hi и CD4+FOXP3+ Трег
статистически значимо увеличивалось до 3,2 ± 0,6 и
63
Е.В. Баторов и др.
Рис. 2. Относительное количество (А) CD4+CD2511' и (Б) CD4+FOXP3+ субпопуляций регуляторных Т-клеток (Т ) в группах больных с трансплантацией мезенхимных стволовых клеток (МСК+) и без нее (МСК-) до и после аутоТГСК. До аутоТГСК — n = 40 (n = 19 в группе МСК- и n = 21 в группе МСК+); на момент восстановления в 1-й месяц после аутоТГСК — n = 46 (n = 24 в МСК-, n = 22 в МСК+); через 6 мес. после аутоТГСК — n = 25 (n = 15 в МСК-, n = 10 в МСК+); через 12 мес. после аутоТГСК — n = 13 (n = 6 в МСК-, n = 7 в МСК+). Данные представлены в виде среднего и стандартной ошибки. Горизонтальной пунктирной линией указаны средние значения у здоровых добровольцев * p < 0,05 в сравнении с показателями у здоровых добровольцев.
** p < 0,05 в сравнении со значениями до аутоТГСК.
8,3 ± 1,1 % соответственно (р < 0,05). Однако, поскольку в этот период абсолютное число лимфоцитов не восстанавливалось до исходного уровня (0,85 ± 0,08 vs 1,49 ± 0,17 х 109/л; р = 0,00064), абсолютное число Трег значимо не отличалось от значений в предтрансплантационный период. Через 6 мес. после аутоТГСК абсолютное содержание лимфоцитов восстанавливалось до исходного уровня (1,52 ± 0,19 х 109/л), оставаясь, тем не менее, ниже нормативных значений. Доля Т-клеток CD4+CD25hi снижалась до исходного уровня (2,05 ± 0,3 %), а CD4+FOXP3+ — даже ниже (3,6 ± 0,4 %), достигая значений у здоровых добровольцев. Через 12 мес. при дальнейшем повышении абсолютного числа лимфоцитов (до 1,90 ± 0,33 х 109/л), некотором снижении процентного содержания CD4+CD25hi (1,61 ± 0,3 %) и росте CD4+FOXP3+ (3,93 ± 0,3 %) абсолютные и относительные значения Т статистически значимо не
рег
отличались от таковых у здоровых добровольцев (рис. 2).
В группе с аутологичной котрансплантацией МСК (МСК+) абсолютное число лимфоцитов ко времени восстановления числа лейкоцитов полностью восстанавливалось (1,29 ± 0,21 х 109/л), а относительное количество Трег (2,16 ± 0,2 % клеток CD4+CD25hi и 7,06 ± 0,8 % клеток CD4+FOXP3+) значимо не отличалось от исходных показателей и соответствующих значений в группе МСК—. Через 6 мес. доля Т-клеток CD4+CD25hi снижалась до нормы (1,58 ± 0,4 %), по-прежнему не отличаясь от исходных значений и группы МСК—. Относительное количество CD4+FOXP3+ Т оставалось повышенным
рег
(6,95 ± 1,1 %). Через год, как и в группе МСК—, абсолютное число лимфоцитов полностью восстанавливалось (до 1,77 ± 0,34 х 109/л), тогда как относительное и аб-
солютное число Трег снижались до нормативных значений (1,48 ± 0,2 % клеток CD4+CD25hi и 2,36 ± 0,4 % клеток CD4+FOXP3+), причем доля последних была статистически значимо ниже таковой до аутоТГСК (р = 0,01) и в группе МСК— (см. рис. 2).
Таким образом, относительное содержание Трег восстанавливалось до исходно повышенного уровня уже ко времени восстановления числа лейкоцитов, однако в дальнейшем (к 6 и, особенно, 12 мес.) снижалось до нормативных значений. При этом в группе МСК+ отмечалось более раннее уменьшение доли Т-клеток CD4+CD25hi и более отсроченное (к 12 мес.) снижение относительного содержания CD4+FOXP3+. Абсолютное число Т в обеих группах также восстанавливалось к
рег
моменту восстановления числа лейкоцитов и в течение всего последующего периода статистически значимо не отличалось от такового до аутоТГСК и нормативных значений, а также между группами.
Для изучения возможного супрессивного влияния Трег на функциональную активность лимфоцитов мы сравнили уровень спонтанной и анти-CD3-стимулированной пролиферации МНК крови больных до и после аутоТГСК. Корреляционный анализ не выявил каких-либо взаимосвязей между количеством Трег и пролиферативной активностью МНК в течение всего периода наблюдения. Спонтанная пролиферация МНК до трансплантации, на момент восстановления лимфоцитов и через 6 мес. после аутоТГСК в сравниваемых группах была сходной. Анти-CD3-стимулированный ответ МНК в группах также не различался, оставаясь сниженным в течение всего времени наблюдения, включая предтрансплантационный период (рис. 3).
До ТГСК 13-й день 6 мес. 12 мес.
Рис. 3. Анти-CD3-индуцированная пролиферация моно-нуклеарных клеток (МНК) до и после аутоТГСК. До аутоТГСК — n = 24 (n = 13 в группе МСК- и n = 11 в группе МСК+); на момент восстановления в 1-й месяц после аутоТГСК — n = 31 (n = 17 в МСК-, n = 14 в МСК+); через 6 мес. после аутоТГСК — n = 13 (n = 5 в МСК-, n = 8 в МСК+); через 12 мес. после аутоТГСК — n = 10 (n = 4 в МСК-, n = 6 в МСК+). Данные представлены в виде медианы и межквартильных интервалов. Горизонтальной пунктирной линией указаны медианные значения у здоровых добровольцев (29 593 имп./мин; n = 61) * p < 0,05 в сравнении с показателями у здоровых добровольцев.
64
Клиническая онкогематология
Регуляторные Т-лимфоциты при НХЛ
Рис. 4. Относительное (А, Б) и абсолютное (В, Г) число регуляторных Т-клеток (Трег) на момент восстановления лимфоцитов в группах больных с благоприятным и неблагоприятным 6-месячным исходом аутоТГСК. Данные представлены в виде индивидуальных значений; показаны медиана и межквартильный интервал
Таким образом, пролиферативная активность Т-клеток, стимулированных анти-CD3-антителами, сохранялась на исходно низком уровне вне зависимости от динамических изменений количества циркулирующих Трег в посттрансплантационный период.
Анализ результатов аутоТГСК в группе из 37 пациентов, находившихся под наблюдением более 12 мес., показал, что неблагоприятные исходы в виде рецидива (прогрессии) заболевания в течение первого года после аутоТГСК наблюдались у 11 (30 %) из 37 пациентов (4 — с ММ, 2 — с НХЛ, 5 — с ЛХ). Среди них рецидивы в первые 6 мес. отмечены у 8 пациентов (2 — с ММ, 1 — с НХЛ, 5 — с ЛХ). Оценка количества Т на момент восстановления числа лейкоцитов у больных с противоположными исходами показала, что пациенты с рецидивом/прогрессией заболевания в течение первых 6 мес. (п = 8) отличались более высоким относительным и абсолютным содержанием клеток CD4+CD25hi (3,7 ± 1,0 vs 2,2 ± 0,3 %, p = 0,086 и 0,038 ± 0,008 vs
0,022 ± 0,003 х 109/л, p = 0,013 соответственно) и клеток CD4+FOXP3+ (11,7 ± 1,9 vs 7,0 ± 0,7 %, p = 0,039 и 0,15 ± 0,05 vs 0,070 ± 0,01 х 109/л, p = 0,071 соответственно) по сравнению с пациентами (п = 29), сохранившими полную и частичную ремиссии (рис. 4).
У пациентов с неблагоприятным исходом, развившимся в течение первого года (п = 11), статистически значимые различия в содержании Трег ко времени восстановления числа лейкоцитов выявлялись для относительного количества клеток CD4+FOXP3+ (10,7 ± 1,5 vs 6,9 ± 0,7 % у больных с благоприятным исходом; p = 0,024). Оценить содержание Трегу больных после рецидива/прогрессии не удалось в связи с продолжением терапии по месту жительства или летальным исходом.
Для определения прогностического значения содержания Т на момент восстановления лейкоцитов, через
рег
6 и 12 мес. после аутоТГСК был проведен ROC-анализ. Построение ROC-кривых (рис. 5) показало высокую информативность определения содержания Трег.
Рис. 5. ROC-анализ диагностической значимости определения содержания регуляторных Т-клеток (Трег) на момент восстановления кроветворения после аутоТГСК и его значение для прогноза раннего рецидива через (А, В) 6 и (Б) 12 мес.:
А — 9,1 % Т-клеток CD4+FOXP3+ (чувствительность 87,5 %, специфичность 77,4 %); Б — 9,1 % Т-клеток CD4+FOXP3+ (чувствительность 72,7 %, специфичность 77,8 %); В — 0,026 х 109/л Т-клеток CD4+CD25hi (чувствительность 75 %, специфичность 73,3 %)
О — пороговое значение
www.medprint.ru
65
Е.В. Баторов и др.
Так, площадь под кривой (AUC) при оценке относительного количества Т-клеток CD4+FOXP3+ через 6 и 12 мес. после аутоТГСК составила 0,80 (р = 0,0087) и 0,75 (р = 0,018) соответственно; абсолютное число клеток CD4+CD25hi через 6 мес. после аутоТГСК — 0,75 (р = 0,035). Относительное содержание Т-клеток CD4+FOXP3+ более 9,1 % позволяло прогнозировать неблагоприятный исход через 6 мес. со специфичностью 77,4 % и чувствительностью 87,5 %; на период 12 мес. — со специфичностью 77,8 % и чувствительностью 72,7 %. Для Т-клеток CD4+CD25hi пороговым было значение 0,026 X 109/л. Прогноз рецидива или прогрессии заболевания в течение первых 6 мес. при численности данной популяции выше указанного порога характеризовался чувствительностью 75 % и специфичностью 73,3 %.
ОБСУЖДЕНИЕ
В целом полученные данные позволяют заключить, что относительное содержание Трег у больных с лимфомами и ММ после аутологичной ТГСК быстро (в течение 1 мес.) достигает исходно повышенного уровня, после чего снижается и к 12 мес. соответствует нормативным значениям. При этом в силу постепенного восстановления абсолютного числа лимфоцитов абсолютное число циркулирующих Трег на протяжении всего периода наблюдения остается в пределах нормы. Выявленное быстрое восстановление Трег согласуется с данными литературы о более ранней и полной реконституции Трег по сравнению с другими субпопуляциями лимфоцитов после аллогенной ТГСК при ряде гемобластозов [19, 20]. Одним из объяснений данного феномена может быть относительно большее количество Трег в продукте сепарации в связи с меньшей чувствительностью этих клеток к химиотерапии [21], а также включением механизмов гомеостатической пролиферации после аллоТГСК [20]. Однако в настоящем исследовании впервые изучены особенности восстановления Т
рег
при аутоТГСК у больных лимфомами и ММ.
Второй важный вывод заключается в том, что аутологичная котрансплантация относительно низких доз МСК не влияет на эффективность раннего восстановления Трег после аутоТГСК и их последующего снижения к 12 мес. Отличительным признаком в группе МСК+ (по сравнению с группой МСК-) было более раннее снижение относительного содержания клеток CD4+CD25hi при отсроченном снижении доли Т-клеток CD4+FOXP3+. Таким образом, проведение аутоТГСК в сочетании с введением МСК не приводит к количественной экспансии супрессорных Т .
рег
Наиболее важным итогом исследования, на наш взгляд, служат данные о том, что развитие рецидива или прогрессия заболевания в ближайшие 6—12 мес. после аутоТГСК связаны с более высоким содержанием Трег, поэтому оценка этих клеток на момент восстановления числа лейкоцитов, по предварительным данным, может быть использована для прогнозирования исхода аутоТГСК. Повышенное число Трег в крови после аутоТГСК было выявлено у больных хроническим миелолейкозом, у которых впоследствии развился рецидив [22]. Также известно, что отсутствие «реакции трансплантат против хозяина» (РТПХ), с одной стороны, связано с более высоким содержанием Трег [19, 23], а с другой — сопряжено с вероятностью развития рецидива после аллоТГСК [24], что может быть обусловлено угнетением противоопу-66
холевого иммунитета под действием Трег. В то же время A.N. McMurchy и соавт. в обзоре, посвященном клиническому использованию Т , указывают на отсутствие
рег
угнетения противоинфекционного или противоопухолевого иммунного ответа при введении сепарированных или генерированных in vitro Трег, используемых с целью профилактики РТПХ [25]. Возможно, отсутствие ингибирующего эффекта Трег в последнем случае обусловлено недостаточно высокими дозами вводимых клеток (в силу несовершенства существующих протоколов генерации Т ) либо способностью Т селективно блокировать ал-
рег рег
лореактивные Т-лимфоциты, не препятствуя экспансии клеток, участвующих в поддержании противоинфекционного иммунного ответа [26].
Выявленные различия в количестве Трег у пациентов с наличием и отсутствием рецидива представляют интерес не только в плане патогенетической значимости Т при злокачественных лимфомах, но и в качестве
рег
обоснования новых подходов к прогнозированию исхода аутоТГСК. Действительно, проведенный ROC-анализ показал, что оценка относительного содержания Т-клеток CD4+FOXP3+ и абсолютного числа Т-клеток CD4+CD25hi (на момент восстановления числа лейкоцитов) позволяет прогнозировать ранний рецидив через 6—12 мес. после аутоТГСК. Согласно данным литературы, прогностическими факторами выживаемости больных лимфомами после аутоТГСК помимо статуса заболевания и международного прогностического индекса служат раннее восстановление лимфоцитов, абсолютное число лимфоцитов (и их субпопуляций) в продукте афереза, время от последнего курса химиотерапии до мобилизации ГСК и др. [17]. При этом нами впервые продемонстрирована значимость Трег как прогностического биомаркера исхода аутоТГСК у больных лимфомами и ММ. Учитывая также выявленную взаимосвязь между высоким числом Трег и неблагоприятным исходом, другим важным прикладным аспектом работы представляются данные об отсутствии стимулирующего влияния МСК на восстановление Трег и частоту рецидивов, что указывает на безопасность трансплантации относительно невысоких доз МСК у больных с лимфомами при проведении аутоТГСК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Beyer M., Schultze J.L. Regulatory T cells in cancer. Blood 2006; 108: 804-11.
2. Mittal S., Marshall N.A., Duncan L. et al. Local and systemic induction of CD4+CD25+ regulatory T-cell population by non-Hodgkin lymphoma. Blood 2008; 111: 5359-70.
3. Szczepanski M.J., Szajnik M., Czystowska M. et al. Increased frequency and suppression by regulatory T cells in patients with acute myelogenous leukemia. Clin. Cancer Res. 2009; 15: 3325-32.
4. Hilchey S.P., De A, Rimsza L.M., Bankert R.B., Bernstein S.H. Follicular lymphoma intratumoral CD4+CD25+GITR+ regulatory T cells potently suppress CD3/CD28-costimulated autologous and allogeneic CD8+CD25- and CD4+CD25- T cells. J. Immunol. 2007; 178: 4051-61.
5. Heier I., Hofgaard P.O., Brandtzaeg P., Jahnsen F.L., Karlsson M. Depletion of CD4+ CD25+ regulatory T cells inhibits local tumour growth in a mouse model of B cell lymphoma. Clin. Exp. Immunol. 2008; 152: 381-7.
6. Tzankov A, Meier C., Hirschmann P. et al. Correlation of high numbers of intratumoral FOXP3+ regulatory T cells with improved survival in germinal center-like diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma and classical Hodgkin’s lymphoma. Haematologica 2008; 93: 193-200.
7. Carreras J., Lopez-Guillermo A, Fox B.C. et al. High numbers of tumor-infiltrating FOXP3-positive regulatory T cells are associated with improved overall survival in follicular lymphoma. Blood 2006; 108: 2957-64.
8. Majumdar M.K., Thiede MA., Haynesworth S.E., Bruder S.P., Gerson S.L. Human marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages. J. Hematother. Stem Cell Res. 2000; 9: 841-8.
Клиническая онкогематология
Регуляторные Т-лимфоциты при НХЛ
9. Останин А.А., Петровский ЯЛ., Шевела Е.Я., Черных Е.Р. Мультиплексный анализ цитокинов, хемокинов, ростовых факторов, MMP-9 и TIMP-1, продуцируемых мезенхимальными стромальными клетками костного мозга, жировой ткани и плаценты человека. Клеточные технол. в биол. и мед. 2011; 1: 29-38.
10. Шевела ЕЯ, Петровский ЯЛ, Курганова Е.В. и др. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных гемобла-стозами. Гематол. и трансфузиол. 2008; 53: 32-8.
11. Battiwalla M, Hematti P. Mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation. Cytotherapy 2009; 11: 503-15.
12. Di Ianni M, Del Papa B, De Ioanni M. et a!. Mesenchymal cells recruit and regulate T regulatory cells. Exp Hematol. 2008; 36: 309-18.
13. Prevosto C, Zancolli M, Canevali P, Zocchi M.R., Poggi A. Generation of CD4+ or CD8+ regulatory T cells upon mesenchymal stem cell-lymphocyte interaction. Haematologica 2007; 92: 881-8.
14. Sergeevicheva V.V., Shevela E.Ya., Sizikova SA. et al. Autologous mesenchymal stromal cells of hemoblastosis patients efficiently support hematopoietic recovery after stem cell transplantation. Cell Ther. Transplant. 2010; 1(4): 98-105.
15. Черных Е.Р., Баторов Е.В., Шевела Е.Я. и др. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на раннее восстановление лимфоцитов у больных злокачественными лимфомами с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток. Бюлл. СО РАМН. 2011; 31(2): 101-7.
16. Шевела ЕЯ, Баторов Е.В., Пронкина Н.В. и др. Особенности восстановления кроветворения и реконституции лимфоцитов у больных лимфомами с ко-трансплантацией гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток. Рос. иммунол. журн. 2011; 5: 323-31.
17. Porrata L.F., Markovic S.N. Autograft mediated adoptive immunotherapy of cancer in the context of autologous stem cell transplantation. World J. Clin. Oncol. 2010; 1: 29-34.
18. Сергеевичева В.В., Шевела Е.Я., Крючкова И.В. и др. Использование совместной трансплантации мезенхимальных стволовых стромальных клеток и стволовых кроветворных клеток при гемобла-стозах и аутоиммунных заболеваниях. Разрешение Росздравнадзора на применение новой медицинской технологии ФС № 2008/014 от 30.01.2008 г.
19. Rezvani K., Mielke S., Ahmadzadeh M. et al. High donor FOXP3-positive regulatory T-cell (Treg) content is associated with a low risk of GVHD following HLA-matched allogeneic SCT. Blood 2006; 108: 1291-7.
20. Matsuoka K., Kim H.T., McDonough S. et al. Altered regulatory T cell homeostasis in patients with CD4+ lymphopenia following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Clin. Invest. 2010; 120: 1479-93.
21. Condomines M., Quittet P., Lu Z.Y. et al. Functional regulatory T cells are collected in stem cell autografts by mobilization with high-dose cyclophosphamide and granulocyte colony-stimulating factor. J. Immunol. 2006; 176: 6631-9.
22. Nadal E., Garin M., Kaeda J. et al. Increased frequencies of CD4+CD25high Tregs correlate with disease relapse after allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia. Leukemia 2007; 21; 472-9.
23. Magenau J.M., Qin X., Tawara I. et al. Frequency of CD4+CD25hiFOXP3+ regulatory T cells has diagnostic and prognostic value as a biomarker for acute graft-versus-host-disease. Biol. Blood Marrow Transplant. 2010; 16: 907-14.
24. Horowitz M.M., Gale R.P., Sondel P.M. et al. Graft-versus-leukemia reactions after bone marrow transplantation. Blood 1990; 75: 555-62.
25. McMurchyA.N., Bushell A, Levings M.K., WoodK.J. Moving to tolerance: clinical application of T regulatory cells. Semin. Immunol. 2011; 23: 304-13.
26. Di Ianni M., Falzetti F., Carotti A. et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood 2011; 117: 3921-8.
wwwmedprint.ru
67
