CC BY
101
Ключевые слова: ферментативная активность; гидролитические ферментные препараты; национальные стандарты
Key words: enzymatic activity, hydrolytic enzymes; national standards.
УДК 543.866
Разработка национальных стандартов
по методам определения активности ферментных препаратов
Е.М. Серба, канд. техн. наук, доцент, М.Б. Оверченко, канд. техн. наук, Н.И. Игнатова, Е.Н. Соколова, Е.И. Курбатова, канд. техн. наук, доцент ВНИИ пищевой биотехнологии
В настоящее время проблеме применения микробных ферментов в перерабатывающих отраслях пищевой промышленности уделяется большое внимание. Мировой опыт свидетельствует о возрастающих масштабах использования ферментных препаратов как в объемах промышленной продукции, так и в развитии научных разработок, направленных на повышение активности продуцентов, полученных с использованием генной инженерии, на применение термофильных микроорганизмов, создание мультиэнзим-ных композиций и иммобилизованных ферментов [1].
Наличие новых концентрированных ферментных препаратов, используемых в спиртовой, пивоваренной, хлебопекарной и других отраслях пищевой промышленности, диктует необходимость их испытаний и стандартизации, так как уровень активности в ферментных препаратах существенно возрос и изменились их физико-химические характеристики.
Существующие методы определения активностей анализируемых объектов не обеспечивают возможности объективно их оценивать, так как они применяются для препаратов с низкими показателями активности. В связи с этим разработаны современные методы определения активностей в ферментных препаратах гидролитического действия, которые позволяют повысить точность их определения, осуществлять контроль над качеством ферментных препаратов, нормировать их расход в различных отраслях пищевой промышленности, стабилизировать технологические процессы и качество целевой продукции.
Во ВНИИ пищевой биотехнологии в последнее время были разработаны национальные стандарты Российской Федерации по методам определения активности ферментных препаратов, применяемых в пищевой промышленности: в 2010 г. разрабо-
таны ГОСТы по Р-глюканазной и про-теолитической активности; в 2011 г. -по амилолитической активности, включающий активность глюкоами-лазы и Р-амилазы; в 2012 г. - по кси-ланазной, целлюлазной и пектолити-ческой активностей.
Методы определения Р-глюканаз-ной, ксиланазной и целлюлолити-ческой активности введены в ГОСТ впервые [2].
Для определения Р-глюканазной активности введен ГОСТ Р 539732010 «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения Р-глюканазной активности».
Метод основан на количественном определении редуцирующих (восстанавливающих) сахаров, образующихся в результате действия фермента Р-глюканазы на Р-глюкан при температуре 50 °С.
За единицу Р-глюканазной активности (1 ед.р-ГкС) принимают количество фермента, действующего на Р-глюкан из ячменя с высвобождением 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в глюкозном эквиваленте), образующихся за 1 мин при стандартных условиях (температура 50 °С и значение рН 5,0).
Содержание редуцирующих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции, определяют колориметрическим методом, основанным на взаимодействии сахаров с реактивом Шомоди-Нельсона. В результате реакции образуется соединение голубого цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию редуцирующих
сахаров, образовавшихся в процессе ферментативной реакции. Интенсивность окраски полученных растворов измеряют на фотоэлектроколори-метре при длине световой волны 610 нм; активность выражается в ед. Р-ГкС/г или см3 испытуемого препарата.
В настоящее время вводится ГОСТ Р по методу определения ксиланазной активности в ферментных препаратах для пищевой промышленности.
Метод опреления ксиланазной активности основан на количественном определении редуцирующих (восстанавливающих) сахаров, образующихся в результате действия фермента ксиланазы на ксилан из березы при температуре 50 °С.
За единицу ксиланазной активности принимают количество фермента, действующего на ксилан из березы с высвобождением 1 мкмоля восстанавливающих сахаров, образующихся за 1 мин при стандартных условиях (температура 50 °С и значение кислотности 5,0 ед. рН).
Содержание редуцирующих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции, определяют колориметрическим методом, основанным на взаимодействии сахаров с реактивом Шомоди-Нельсона. В результате этой реакции образуется соединение голубого или бирюзового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию редуцирующих сахаров, образовавшихся в процессе ферментативной реакции. Интенсивность окраски полученных растворов измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при длине световой волны 610 нм; активность выражается в единицах КС/г или кубических сантиметрах анализируемого препарата.
На стадии введения в действие находится ГОСТ Р 55293-2012 по методу определения целлюлазной активности в ферментных препаратах для пищевой промышленности.
Метод основан на количественном определении редуцирующих (восстанавливающих) сахаров, образующихся в результате действия фермента целлюлазы на субстрат натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) при температуре 50 °С.
За единицу целлюлазной активности (1 ед.ЦлС) принимают количество фермента, которое гидролизует КМЦ с высвобождением 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в глюкозном эквиваленте), образующихся за 1 мин при стандартных условиях (температура 50 °С и 5,0 ед. рН).
Содержание редуцирующих Сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции, определяют колориметрическим методом, основанным на взаимодействии Сахаров с реактивом Шомоди-Нельсона. В результате этой реакции образуется соединение голубого или бирюзового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию редуцирующих сахаров, образовавшихся в процессе ферментативной реакции. Интенсивность окраски полученных растворов измеряют на фотоэлектроко-лориметре или спектрофотометре при длине световой волны 610 нм; активность выражается в единицах целлюлазной способности ед. ЦлС/г или см3 анализируемого препарата.
ГОСТы определения амилолити-ческой, протеолитической и пекто-литической активностей были разработаны взамен старых, союзных ГОСТов 20264.2-89, 20264.2-88,
20264.3-81. Включенные в ГОСТы Р новые методы ориентированы на высокоактивные ферментные препараты для пищевой промышленности, и изменения касались в основном разработки современных способов, стабилизирующих процессы биокатализа субстрата, а также подготовки ферментных препаратов к анализу.
ГОСТ Р 54330-2011. Методы определения амилолитической активности был введен взамен ГОСТа
20264.4-89. ГОСТ отражает изложение методов определения амилоли-тической и глюкоамилазной активности [2]. За основу взят старый метод, но изменения касаются введения в ГОСТ современных аналитических приборов, а также способа подготовки ферментных препаратов для анализа и реактивов (увеличена в 2 раза концентрация соляной кислоты при приготовлении раствора йода). Разработаны условия для определения активности термостабильных Р-амилаз. В связи с тем, что современные высокоактивные препараты обладают повышенной стабильностью для приготовления контрольных образцов, время температурной инактивации ферментов увеличено в 6 раз, т.е. до 1 ч. Сокращены расходы субстрата и раствора ферментных препаратов на проведение анализа в 5 раз.
Метод определения амилолитической активности основан на количественном определении прогидро-лизованного крахмала в результате его гидролиза ферментами амило-литического комплекса до декстринов различной молекулярной массы в стандартных условиях (температу-
ра 30 °С, значение рН 6,0 - для бактериальных и 4,7- для грибных Р-амилаз, продолжительность гидролиза 10 мин).
За единицу амилолитической активности (АС) принято такое количество фермента, которое при определенных значениях рН (6,0 - для бактериальных и 4,7 - для грибных Р-амилаз) и температуре 30 °С за 1 мин катализирует гидролиз 1 г крахмала до декстринов различной молекулярной массы, что составляет 30 % крахмала, введенного в реакцию. Активность выражается в единицах АС/г или кубических сантиметрах анализируемого ферментного препарата.
Количество прогидролизованного крахмала определяется колориметрическим методом по степени окраски остаточного крахмала раствором йода.
Метод определения глюкоамилазной активности основан на количественном определении глюкозы, образующейся при гидролизе крахмала глюкоамилазой в стандартных условиях (температура 30 °С, значение рН 4,7, продолжительность гидролиза 10 мин).
Глюкоамилазная активность (ГлС) характеризует способность ферментного препарата катализировать расщепление растворимого крахмала до глюкозы.
За единицу глюкоамилазной активности принято такое количество фермента, которое способно катализировать гидролиз растворимого крахмала при температуре 30°С и значении рН 4,7, высвобождая за 1 мин 1 мкмоль глюкозы. Активность выражается в единицах ГлС/г или кубических сантиметрах анализируемого ферментного препарата.
При проведении цветной реакции количество глюкозы, образующейся в результате ферментативного гидролиза крахмала, определяют глю-козооксидазным методом, основанным на действии ферментов глюко-зооксидазы и пероксидазы. Фермент глюкозооксидаза катализирует окисление р^-глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты с образованием перекиси водорода. Оба конечных продукта образуются в количествах, эквимолярных окисленной глюкозе. Перекись водорода под действием фермента пероксида-зы окисляет ферроцианид калия (калий железистосинеродистый), который переходит в феррицианид калия, окрашенный в лимонно-желтый цвет, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству глюкозы. Интенсивность окраски растворов замеряют на фотоэлектроко-
МИР
1Ш_Ц I! ,
•Щ г
Почему
БОЛЕЕ 50
предприятий
Готовый продукт соответствует требованиям ГОСТ Р 53094-2008
Упрощенная технология
производства
Сокращение времени брожения ~
12-14 часов
Снижение себестоимости готового продукта за счет уменьшения количества концентрата квасного сусла на 60%; отсутствие стадии подготовки закваски
Превосходные органолептические свойства готового продукта: вкус, цвет, аромат
лориметре при длине световой волны 400 нм.
ГОСТ Р 53974-2010. Метод определения протеолитической активности был введен взамен ГОСТа 20264.2-88 [2,3].
Для характеристики ферментных препаратов и оценки их качества предлагаются различные методы определения протеолитической активности.
Известный метод определения протеолитической активности по ГОСТу 20264.2-88 основан на гидролизе казеината натрия исследуемым ФП до пептидов и аминокислот с последующим их определением. Изложенный в ГОСТе метод позволяет определять общую протеолити-ческую активность микробных про-теаз при различных значениях рН. Однако в результате анализа широкого массива экспериментальных статистически обобщенных данных был выявлен важный недостаток этого метода. При приготовлении субстрата казеинат натрия в кислой и слабокислой зонах рН сворачива-
ГОСТы определения амилолитической, протеолитической и пектолитической активностей были разработаны взамен старых, союзных ГОСТов.
ется, образуя хлопья, что делает этот метод не универсальным для всех областей рН и не позволяет получать достоверные данные об уровне про-теолитической активности в ферментных препаратах [3].
Существует также метод определения протеолитической активности в кислой и слабокислой зонах рН, основанный на гидролизе белка гемоглобина препаратом фермента, находящегося в исследуемом растворе, с последующей инактивацией фермента и осаждением непрогидроли-зованного белка трихлоруксусной кислотой. Протеолитическая активность в данном методе характеризует способность ферментов катализировать расщепление белка гемоглобина до пептидов и аминокислот и выражается числом единиц протеа-зы на 1 г препарата. Определение протеолитической активности осуществляют в зоне рН 4,0-5,4. В этом методе гемоглобин растворяют в ацетатном буфере (0,2 М раствор соляной кислоты и 0,2 М раствор ацетата натрия в различных пропорциях для создания рН буфера от 3,49 до 4,95). Однако при значениях рН
свыше 5,5 использование данного буферного раствора не подходит из-за снижения его буферных свойств. Субстрат, приготовленный на этом буфере при рН 6,0 и более, не стабилен, что снижает достоверность показателей активности ФП [3]. Данный метод также не является универсальным, в связи с тем, что он рассчитан только на слабокислую зону рН. Существуют и другие недостатки этого метода.
При разработке технологий применения ФП в пищевой промышленности с целью биокатализа белковых полимеров перерабатываемого сырья нередко возникает необходимость исследовать активность ФП, проявляемую во всех зонах рН. Особенно это важно при определении эффективности применения биокатализаторов в различных отраслях промышленности. В спиртовом производстве важна область рН от 4,0 до 6,5; в молочной промышленности - 3,5-5,5; в сокоморсовой - 3,04,5; в синтетических моющих средствах - 6,0-9,0 и так далее [3].
Поэтому необходима была разработка универсального метода определения общей протеолитической активности ферментных препаратов при различных значениях рН. Основным субстратом был выбран гемоглобин, так как он достаточно хорошо растворим во всех диапазонах рН универсального буфера. Кроме того, гемоглобин не сворачивается в универсальном буфере, который применяли для приготовления субстрата, используя казеинат натрия.
Разработанный метод определения протеолитической активности основан на гидролизе 2 %-ного раствора гемоглобина - животного белка в кислой (рН 3,0), слабокислой (рН 5,3), нейтральной (рН 7,0) и щелочной (рН 9,0) зонах исследуемым ферментным препаратом, находящимся в растворе, до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот с последующей инактивацией фермента путем осаждения непрогидролизованного белка три-хлоруксусной кислотой (ТХУ) и определением образовавших пептидов и свободных аминокислот.
За единицу общей протеолитичес-кой активности (ПС) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 °С приводит гемоглобин в неосаждаемое состояние ТХУ в количестве, соответствующем 1 мкмолю тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг); активность выражается в единицах ПС/г или кубических сантиметрах испытуемого препарата.
Количество белка, превращенного в низкомолекулярные пептиды и аминокислоты, определяют по оптической плотности на спектрофотометре при длине волны X = 275 нм или по реакции свободных аминокислот с реактивом Фолина и дальнейшим определением оптической плотности образующихся голубых растворов на фотоэлектроколори-метре при длине световой волны X = 670 нм.
Определение протеолитической активности кислых протеаз осуществляют при рН реакционной смеси 3,0±0,2, слабокислых протеаз - при рН 5,3±0,2, нейтральных протеаз -при рН 7,0±0,2, щелочных протеаз -при рН 9,0±0,2 и рассчитывают по градуировочному графику, построенному для тирозина.
Таким образом, разработанный метод, основанный на определении протеолитической активности ФП по степени гидролиза белка гемоглобина, является универсальным и позволяет анализировать ферментные препараты, применяемые в пищевой промышленности, в различных областях рН и положен в основу разработанного ГОСТа Р.
Особенности разработанных методов определения активности ферментных препаратов для пищевой промышленности и их отличия от ранее введенных в ГОСТ можно проиллюстрировать на примере метода определения пектолитической активности. ГОСТ по методам определения пектолитической активности в настоящий момент находится в наборе и вводится взамен ГОСТа 20264.3-81 [2].
Для характеристики пектолити-ческих ферментных препаратов (ФП) используют показатели их способности катализировать расщепление пектина под действием ферментов литического действия: эндо-, экзополигалактуроназ, пек-тинэстераз, а также трансэлиминаз-ного действия: пектин - (пектат) -лиаз. На сегодняшний день в России определение каталитической способности пектиназ выполняют по ГОСТ 20264.3-81, в котором методы основаны на гидролизе свекловичного пектина при 30 °С, и предусмотрено трехчасовое приготовление раствора субстрата на буфере для определения общей пектолити-ческой активности (ПкС). Действие ферментов, катализирующих гидролиз пектина, приводит к сдвигу исходного значения рН реакционной смеси вследствие накопления продуктов гидролиза, что снижает достоверность результатов. Решение данной проблемы заключается в
QUALITY AND SAFETY^
проведении ферментативной реакции в буферных растворах, не влияющих на ингибирование действия ферментов.
В связи с этим возникла необходимость разработки усовершенствованных экспресс-методов определения общей пектиназной и эндополи-галактуроназной (эндо-ПгС) активностей для повышения достоверности экспериментальных данных при характеристике различных ФП.
Изучение динамики растворения субстратов: 1 %-ного раствора пектина в ацетатном буфере рН 4,0; 5,0 для определения ПкС; 1 %-ного раствора пектовой кислоты в ацетат-НС! буфере для определения эндо-ПгС, а также степени растворения пектина в дистиллированной воде (согласно ГОСТ 20264.3-81 п. 2.3.3) показало, что максимальное накопление растворимых сухих веществ (СВ) отмечается при использовании буферного раствора рН 5,0 через 30 мин перемешивания. При этом в контрольном образце (по ГОСТ 20264.3-81) через 30 мин концентрация СВ составляет 65 % от максимально возможного, а через 60 мин 86,7%. Полученные экспериментальные данные подтверждены как при использовании ацетатного буфера, так и ацетат-НС! буфера. Эффективность использования буферного раствора рН 5,0 подтвердилась и по повышению показателя динамической вязкости раствора субстрата, приготовленного на основе ацетатного и ацетат-НС! буферов рН 5,0, достигающего степени растворения 98,6 % уже через 10 мин перемешивания (3,5мПа*с).
Для получения статистических данных была проведена сравнительная характеристика ФП, отличающихся составом ферментного комплекса, а также источником получения. При разных значениях рН субстрата при определении ПкС показано, что ацетатный буфер рН 5,0 наиболее оптимален и его использование позволяет определить максимально достоверные значения (наиболее высокие) активности выбранных ФП (рис. 1, 2).
Для определения эндо-ПгС ферментных препаратов был выбран ацетат-Н^ буфер со значением рН 5,0 как наиболее оптимальный, ферментативная активность выбранных образцов была наиболее высокой (рис. 3, 4).
В результате исследований разработаны методики определения ПкС и эндо-ПгС усовершенствованным методом; экспериментально подтверждена возможность сокращения времени приготовления субстрата до 30
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
рН 4 Г РН 4,5 || рН 5
рН 6 _| контроль
jflfl -Лл rfflfl .Я1П
i
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 1. Влияние рН ацетатного буфера на уровень показателя пектолитической активности
рН 4 рН 4,5 рН 5 рН 6 контроль
500 450 3 400
и
^ 350
^ 300
и
1= 250
СУ
I 200
СУ
I 150
т
100 50 0
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 2. Влияние рН ацетат-НС! буфера на уровень показателя пектолитической активности
п
■гШ! .жп Л J\I\ -Л1П ^пл 1
600
500
400
300
ч н
т
200
т 100
0
рН 4
рН 4,5
рН 5 рН 6
контроль
гГПи ril rVU ^Jb гЛя rJT.
И
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рис. 3. Влияние рН ацетат-НС! буфера на уровень показателя эндополигалактуроназной активности
мин, что позволит значительно сократить длительность анализа. Наиболее оптимальные буферные системы: ацетатный буфер рН 5,0 для определения ПкС и ацетат-НС1-буфер рН 5,0 для определения эндо-ПгС.
Таким образом, в результате проведенных исследований: подобрана
оптимальная буферная система со значением рН 5,0, обеспечивающая точность определения активностей пектолитического комплекса, стабильность технологических процессов и качество целевой продукции; проведена метрологическая оценка точности определения общей пекти-
9
9
назной и эндополигалактуроназной активности в оптимальной зоне рН и подтверждено соответствие показателей общей пектиназной и эндопо-лигалактуроназной активностей ферментных препаратов, определяемых по разработанной методике, предъявляемым метрологическим требованиям.
Внедрение нового метода позволит значительно сократить длительность анализа и повысить точность определения активностей пектолитического комплекса, обеспечить контроль расхода ферментных препаратов и повышение качества биоконверсионных процессов при переработке пектинсодержа-щего сырья в пищевой промышленности.
Метод определения активности ферментов пектолитического комплекса позволяет оценить результаты совместного действия ферментов этого комплекса, катализирующих гидролиз пектина.
Метод основан на количественном определении продуктов гидролиза пектина, не осаждаемых сернокислым цинком, под действием ферментов пектолитического комплекса в стандартных условиях (температура 30 °С, значение рН реакционной среды 5,0 ед. рН, продолжительность гидролиза 1 ч).
За единицу пектолитической активности ПкС принято такое количество фермента, которое при значении 5,0 ед. рН и температуре 30 °С за 1 мин катализирует гидролиз 1 г пектина до продуктов, не осаждаемых сернокислым цинком, что составляет 30 % пектина, введенного в реакцию. Активность выражается в единицах ПкС/г или кубических сантиметрах анализируемого ферментного препарата.
Количество продуктов прогидро-лизованного пектина, не осаждаемых сернокислым цинком, определяется интерферометрическим методом.
Метод определения эндополига-лактуроназной активности основан на гидролизе пектовой кислоты анализируемым ферментным препаратом с контролем степени расщепления и снижения вязкости субстрата.
Эндополигалактуроназная активность (Эндо-ПгС) характеризует способность ферментного препарата снижать вязкость 1,0 %-ного раствора пектовой кислоты.
За единицу эндополигалактуро-назной активности принято такое количество фермента, которое способно катализировать гидролиз 1,0 г пектовой кислоты при температуре 30 °С и значении кислотности 5,0 ед. рН, снижая за 1 мин вязкость раствора на 30 %. Эндополигалактуроназ-ная активность выражается в единицах Эндо-ПгС/г или кубических сантиметрах анализируемого ферментного препарата.
Метод определения экзополига-лактуроназной активности основан на учете количества прогидроли-зованных связей в пектовой кислоте, рассчитываемых по увеличению конечных альдегидных групп.
За единицу экзополигалактуроназ-ной активности принято такое количество фермента, которое способно катализировать гидролиз 1,0 мкмоль эквивалента гликозидных связей в молекуле пектовой кислоты за 1 мин при температуре 30 °С и значении рН 4,0. Экзополигалактуроназная активность выражается в единицах Экзо-ПгС/г или кубических сантиметрах анализируемого ферментного препарата.
Метод определения пектинэсте-разной активности основан на гидролизе высокометоксилированного пектина анализируемым ферментным препаратом с последующим определением освободившихся в результате гидролиза карбоксильных групп.
Пектинэстеразная активность (ПэС) характеризует способность ферментного препарата катализировать гидролиз сложноэфирных связей в молекуле высокометоксилиро-ванного пектина с образованием карбоновых кислот и метилового спирта.
За единицу пектинэстеразной активности принято такое количество фермента, которое способно катализировать гидролиз 1,0 мкмоль слож-ноэфирных связей в молекуле пектина за 1 мин при температуре 30 °С и значении кислотности 4,0 ед. рН.
Пектинэстеразная активность выражается в единицах ПэС/г или кубических сантиметрах анализируемого ферментного препарата.
Подобным образом были отработаны все методы определения ферментативных активностей, которые могут быть применены для оценки качества ферментных препаратов, используемых в пищевой промышленности. Достоинством разработанных национальных стандартов является создание унифицированных метрологически аттестованных методов определения активностей ФП для пищевой промышленности, которые позволят объективно контролировать их расход в производстве и обеспечить эффективность применения ферментных препаратов в технологических процессах перерабатывающих отраслей АПК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Серба, Е.М. Синтез и секреция гидролаз микромицетом АзрегдШив огугае- продуцентом ферментов, необходимых для биокатализа полимеров зернового сырья/Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Л.В. Римарева// Производство спирта и ликерово-дочных изделий. - 2011. - № 2. -С. 18-20.
2. Полыгалина, Г.В. Определение активности ферментов/Г.В. Полыгалина, В.С. Чередниченко, Л.В. Рима-рева//Справочник. - М.: ДеЛи принт, 2003. - 375 с.
3. Универсальный метод определения протеолитической активности ферментных препаратов для пищевой промышленности/Е.М. Серба [и др.]//Хранение и переработка сель-хозсырья. - 2010. - № 6. - С. 33-35.
