CC BY
125
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2014, № 4
УДК 547.458:582.683.2:615.32
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ В ТРАВЕ ИКОТНИКА СЕРОГО
© Дроздова И.Л., Лупилина Т.И.
Кафедра фармакогнозии и ботаники Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: irina-drozdova@vandex.ru
Углеводы играют огромную роль в биорегуляции растений и обладают разносторонним спектром фармакологической активности. Перспективным доступным отечественным сырьевым источником полисахаридов могут стать представители семейства Крестоцветные (Brassicaceae). Род Икотник (Berteroa (L.) DC.) семейства Крестоцветные (Brassicaceae) насчитывает 8 видов, распространенных в Европе и Азии. В России произрастает 2 вида, среди которых широко представлен икотник серый. Возможность использования нового вида сырья в научной медицине делает необходимым разработку методики количественного определения водорастворимых полисахаридов травы икотника серого гравиметрическим методом и проведение валидации методики по параметрам: повторяемость, воспроизводимость, линейность. Установлены рекомендуемые нормы содержания водорастворимых полисахаридов для исследуемого сырья.
Ключевые слова: икотник серый, Berteroa incana (L.) DC., водорастворимые полисахариды (ВРПС), методика количественного определения, валидация.
DEVELOPMENT OF METHODS OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF WATER-SOLUBLE
POLYSACCHARIDES IN BERTEROA INCANA Drozdova I.L., Lupilina T.I.
Department of Pharmacognosy and Botany of Kursk State Medical University, Kursk
Carbohydrates play a huge role in the bioregulation of plants and have a broad spectrum of pharmacological activity. The representatives of Brassicaceae family can become the prospective available domestic source of polysaccharides. Berteroa genus of Brassicacea family has 8 species propagated in Europe and Asia. In Russia there are 2 species, among which Berteroa incana (L.) DC is widespread in areas of central Russia. The ability to use a new type of raw material in scientific medicine makes it necessary to develop the method of quantitative determination of water-soluble polysaccharides of Berteroa incana by gravimetric method. The validation of the developed technique was carried out according to the parameters of repeatability, reproducibility, linearity. The norms of water-soluble polysaccharides contents were installed.
Keywords: Berteroa incana (L.) DC, water-soluble polysaccharides, method of quantitative determination, the validation.
Углеводы - группа природных соединений, являющаяся самой распространенной в растительном мире. Основные биополимеры углеводов - полисахариды. Этот класс веществ играет огромную роль в биорегуляции растений [8] и обладает разносторонним спектром фармакологической активности. Полисахариды растений оказывают выраженное противовоспалительное, ранозаживляющее, антиоксидантное и противо-радиоционное воздействие, стимулируют процессы кроветворения, активируют функции иммунной системы [11]. У растительных полисахаридов обнаружены антигипоксические, иммунотропные, антиатеросклеротические, противоопухолевые, противовирусные, противомикробные, сорбционные и другие свойства [5].
Однако установлено, что информация о характеристике или структуре полисахаридов имеется только для 38% официнальных видов России. Данные о наличии, количественном содержании или природе полисахаридов отсутствуют для 62% официнальных видов представителей 52 семейств [6].
Перспективным доступным отечественным сырьевым источником полисахаридов могут стать представители рода Икотник семейства Крестоцветные (Brassicaceae), которые издавна используются в народной медицине [4]. Род Икотник включает 8 видов, во флоре России представлен 2 видами. На территории Центральных областей России из представителей данного рода произрастает только икотник серый.
Икотник серый (Berteroa incana (L.) DC.) -двулетнее травянистое растение, широко распространенное во всех районах европейской части России, на Кавказе, в западной и Восточной Сибири, как заносное - на Дальнем Востоке [4, 7]. Растет по сухим открытым местам, на каменистых склонах, полянах, опушках, вырубках, лугах, полях, суходольных пастбищах, вдоль дорог, иногда как сорное в посевах, у жилья. Встречается во всех областях Центральной России как обычное растение [4,7], имеет достаточную сырьевую базу.
Икотник серый издавна и до настоящего времени используется только в народной медицине
91
Методика исследования
при судорожных сокращениях диафрагмы - икоте, заболеваниях пищеварительной, нервной костно-мышечной систем, при травмах, растяжении связок, при женских заболеваниях и кровотечениях после родов, некоторых инфекционных и паразитарных болезнях, при недомогании и утомляемости для общего укрепления организма, а также наружно для промывания ран [7].
Проведенные нами фитохимические исследования показали, что трава икотника серого содержит различные группы БАВ: углеводы (водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества, гемицеллюлозы А и Б), фенольные соединения (флавоноиды, фенолокислоты, кумарины, дубильные вещества), тритерпеновые сапонины, органические кислоты, аминокислоты, каротиноиды, макро- и микроэлементы. При оценке количественного содержания БАВ было установлено, что трава икотника серого содержит значительное количество водорастворимых полисахаридов, которые могут отвечать за фармакологические свойства растения.
Возможность использования нового вида лекарственного растительного сырья в научной медицине делает необходимым разработку методик количественного определения основных групп действующих веществ, а также проведение валидации.
Цель нашего исследования - разработка методики количественного определения водорастворимых полисахаридов в траве икотника серого.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Количественное определение водорастворимых полисахаридов (ВРПС) проводили методом гравиметрии, основанным на экстракции суммы полисахаридов из сырья водой с последующим осаждением их спиртом этиловым 96%. Этот ме-
тод рекомендуется ГФ-XI для анализа сырья, содержащего полисахариды [2]. Для экстрагирования ВРПС из сырья использовали воду очищенную. Определение оптимальных условий экстракции ВРПС из травы икотника серого, а также условия осаждения их спиртом этиловым 96% проводили на одном образце сырья.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе нами проведены исследования по изучению оптимальных условий экстракции и осаждения ВРПС из травы икотника серого и разработке методики их количественного определения.
Результаты изучения влияния степени измельчения на экстракцию ВРПС показали, что максимальное извлечение наблюдается при степени измельчения сырья икотника серого до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, что согласуется с литературными данными [2]. Извлечение полисахаридов проводили водой путем экстракции до полного истощения сырья при соотношении сырье-растворитель 1:10. Было установлено, что при использовании метода трехкратной экстракции в течение 90 минут (3 раза по 30 минут) извлечение ВРПС из сырья икотника серого происходит полностью. Осаждение полисахаридов из водных извлечений проводят спиртом этиловым 96% [2]. Проведенные нами исследования по изучению оптимального соотношения извлечения и спирта, обеспечивающего максимальный выход ВРПС, свидетельствуют о том, что полнота осаждения ВРПС из водного извлечения достигается при использовании 4-кратного количества спирта этилового 96% по отношению к извлечению. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Определение оптимальных условий экстракции и осаждения суммы ВРПС из травы икотника серого методом гравиметрии
Показатель Значение показателя Содержание суммы ВРПС, % (от воздушно-сухого сырья)
Степень измельчения сырья, мм 1 10,70
2 11,90
3 9,58
Время экстрагирования, мин 30 6,71
60 (30x2) 10,11
90 (30x3) 11,91
120 (30x4) 11,85
Объем осадителя (соотношение извлечения и спирта этилового 96%) 1:1 5,84
1:2 7,29
1:3 10,53
1:4 11,90
1:5 11,87
92
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2014, № 4
Таблица 2
Оптимальные условия количественного определения суммы ВРПС в траве икотника серого гравиметрическим методом
Наименование параметра Величина показателя
Степень измельчения сырья, мм 2
Условия экстракции Экстрагент Вода
Соотношение сырье - экстрагент 1:10
Время экстракции, мин 90 (3х30)
Условия осаждения Осадитель Спирт этиловый 96%
Объем осадителя 4
Содержание суммы ВРПС, % от 10,23±0,16 до 11,90±0,22
Таблица 3
Результаты определения повторяемости методики
№ опыта Содержание суммы ВРПС, %
1 11,84
2 12,00
3 11,94
4 11,90
5 12,00
6 11,74
относительное стандартное отклонение, % 2,18
На основании проведенных исследований впервые разработана методика количественного определения суммы ВРПС в траве икотника серого (таблица 2).
Методика количественного определения суммы ВРПС
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм. Около 5,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл воды, колбу присоединяют к обратному холодильнику и кипятят при перемешивании на электрической плитке в течение 30 минут. Экстракцию водой повторяют еще два раза по 50 мл в течение 30 минут каждый раз. Объединенные водные извлечения центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 минут и декантируют в мерную колбу вместимостью 500 мл через 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку и предварительно смоченной водой. Фильтр промывают водой и доводят объем раствора водой до метки (раствор А).
25 мл раствора А помещают в центрифужную пробирку, прибавляют 100 мл спирта этилового 96%, перемешивают, подогревают на водяной бане при температуре 600С в течение 5 минут. Через 30 минут содержимое центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом при остаточном давлении 13-16 кПа через высушенный до постоянной массы при темпера-
туре 100-105°С стеклянный фильтр ПОР 16 диаметром 40 мм. Затем осадок количественно переносят на тот же фильтр и промывают 15 мл смеси спирта этилового 96% и воды (3:1). Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, затем при температуре 100-1050C до постоянной массы.
Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
(m2-mi) х 500 х 100 х 100
X, % =......................., где
m х 25 х (100-W) mi - масса фильтра в граммах; m2 - масса фильтра с осадком в граммах; m - масса сырья в граммах;
W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
Второй этап наших исследований был посвящен валидации разработанной методики. Валидация количественного определения суммы ВРПС в траве икотника серого проводилась по показателям повторяемости, воспроизводимости и линейности [1, 9, 10].
Повторяемость методики определяли на одном образце сырья в 6 повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 4% [3]. В нашем случае оно составило 2,18%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости (таблица 3).
93
Методика исследования 94
Таблица 4
Результаты определения воспроизводимости методики
Химик-аналитик № образца Повторность сумма ВРПС, % Относительное стандартное отклонение, %
1 химик 1 1 11,67 3,19
2 11,82
3 12,00
2 химик 1 1 11,93
2 11,90
3 12,10
1 химик 2 1 11,10 4,54
2 10,95
3 11,28
2 химик 2 1 11,47
2 11,20
3 11,44
1 химик 3 1 11,10 4,05
2 10,78
3 10,68
2 химик 3 1 11,00
2 10,86
3 10,69
Результаты исследования методики по показателю линейности
Таблица 5
Масса навески сырья, г 3,0016 4,0118 5,0096 6,0123 7,0098 8,0129
Масса осадка ВРПС, г 0,3572 0,4761 0,5901 0,7161 0,8412 0,9575
Рис. 1. Зависимость массы осадка от массы лекарственного растительного сырья при гравиметрическом определении ВРПС в траве икотника серого.
94
Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2014, № 4
Таблица 6
Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы ВРПС
№ партии, место и время сбора сырья n X S2 S X P,% T(Pf) АХ E -^отн
1. г. Курск, 2012 г. 5 11,90 0,0314 0,0729 95 2,78 0,22 4,14%
2. г. Курчатов, 2012 г. 5 10,23 0,0165 0,0574 95 2,78 0,16 3,49%
3. г. Льгов, 2012 г. 5 11,15 0,0138 0,0525 95 2,78 0,15 2,93%
4. г. Курск, 2013 г. 5 11,30 0,0255 0,0714 95 2,78 0,20 3,93%
5. г. Льгов, 2013 г. 5 10,50 0,0173 0,0589 95 2,78 0,16 3,49%
Воспроизводимость определяли 2 химика-аналитика на 3 образцах в 3 повторностях [3]. Относительное стандартное отклонение составило не более 4,54%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости (таблица 4).
Линейность устанавливается на основании измерения в 6 экспериментальных точках. Для этого взвешивали отдельные навески сырья массой от 3,0 г до 8,0 г и массы выделенных из них осадков ВРПС (таблица 5, рисунок 1). Мерой линейности является коэффициент корреляции, если его величина близка к единице, то совокупность данных можно описать прямой линией. Нижний допустимый предел этой величины 0,98. Вычисление коэффициента корреляции проводили с помощью программы Microsoft Excel 2010 [3].
Из рис. 1 видно, что почти все экспериментальные точки лежат на одной линии. Значение коэффициента корреляции 0,9998 и лежит в пределе 0,98 < R2 > 1,0, следовательно, область линейной зависимости наблюдается при массе навески сырья от 3,0 г до 8,0 г. Полученная зависимость аппроксимируется уравнением прямой y = 0,1205х-0,0074.
В ходе исследований установлено, что разработанная методика легко воспроизводима, доступна, занимает минимум рабочего времени, не требует дорогостоящих реактивов и оборудования и позволяет объективно оценивать качество лекарственного растительного сырья - травы икотника серого.
Предложенной методикой проанализировано 5 партий сырья, собранных в различных районах Курской области в разные годы. Результаты анализов представлены в таблице 6.
Из таблицы 6 видно, что содержание суммы ВРПС находится в пределах от 10,23% до 11,90%. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 4,14%. В связи с этим считаем возможным рекомендовать установить норму содержания суммы ВРПС в траве икотника серого не менее 10,0%.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Впервые для стандартизации сырья разработана методика количественного определения ВРПС травы икотника серого методом гравиметрии. Установлено, что содержание ВРПС в траве икотника серого колеблется от 10,23% до 11,90%.
2. Проведена валидация разработанной методики по параметрам: повторяемость, воспроизводимость, линейность. Исследования по валидации показали, что разработанная методика соответствует критериям приемлемости и может быть использована для аналитических целей.
3. Анализ 5 партий сырья, заготовленного в различных районах Курской области в разные годы, позволил рекомендовать установить норму содержания ВРПС в сырье исследуемого растения - не менее 10,0%.
ЛИТЕРАТУРА
1. Арзамасцев А.П., Садчикова Н.П., Харитонов Ю.Я. Валидация аналитических методов // Фармация. -
2006. - № 4. - С. 8-12.
2. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М. : Медицина, 1989. -400 с.
3. Евдокимова О.В. Разработка и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве тысячелистника // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2007. - № 2. - С. 155-160.
4. Киселева К.В., Майоров С.Р., Новиков В.С. Флора средней полосы России: Атлас-определитель / под ред. проф. В.С. Новикова. - М. : ЗАО «Фитон+», 2010. -544 с.
5. Криштанова Н.А., Сафонова М.Ю., Болотова В.Ц., Павлова Е.Д., Саканян Е.И. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2005. - № 1. -С. 212-221.
6. Оленников Д.Н., Кащенко Н.И. Полисахариды. Современное состояние изученности: экспериментально-наукометрическое исследование // Химия растительного сырья. - 2014. - № 1. - С. 5-26.
7. Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая акивность. Т. 2. Семейства Actinidiaceae-
95
Методика исследования
Malvaceae, Euphorbiaceae-Haloragaceae. / отв. ред. А.Л. Буданцев. - СПб.; М. : Товарищество научных изданий КМК, 2009. - 513 с.
8. Робакидзе Е.А. Сезонная динамика содержания водорастворимых полисахаридов в хвое Picea obovata (Pinaceae) // Растительные ресурсы. - 2012. - Т. 48, вып. 3. - С. 363-370.
9. Руководство по инструментальным методам исследований при разработке и экспертизе качества лекарственных препаратов / под ред. С.Н. Быковского, И.А. Василенко, М.И. Харченко, А.Б. Белова, И.Е. Шохина, Е.А. Дориной. - М. : Изд-во Перо, 2014. - 656 с.
10. Руководство ICH «Валидация аналитических методик. Содержание и методология» Q2(R1) // Фармация. -2008. - № 4. - С. 3-8.
11. Сычев И.А., Калинкина О.В., Лаксаева Е.А. Биологиче-
ская активность растительных полисахаридов [Электронный ресурс] // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2009. - Вып. 4. -Режим доступа:
http://www.vestnik.rzgmu.ru/biologicheskaya-aktivnost-rastitelnyx-polisaxaridov, свободный (15.09.2014).
96
